专利名称：：促进兰科植物种子萌发的三株真菌菌株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程
技术领域：
，具体说涉及促进兰科植物种子萌发的三株真菌菌株，能够与兰科植物种子伴播，用于育苗盘或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。
背景技术：
：兰科植物中有很多传统名贵中药，比如石斛，白芨等。根据《中国药典》2005版的记载，石斛具有益胃生津、滋阴清热的功效，还能利咽明目，调节人体免疫功能。白芨以块茎入药，具有收敛止血、消肿生肌等功效，主治咳血吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂，肺结核咳血、溃疡病出血，同时还能治疗尿血、便血等症。药用石斛的记载始见于《神农本草经》，被列为上品，是"九大仙草"之首。可作药用的兰科石斛属植物有30多种，目前国内铁皮石斛、金钗石斛、束花石斛，齿瓣石斛、鼓槌石斛等一些名贵的药用石斛资源奇缺，其中铁皮石斛("e/7rfroZit/忍ca/7力'&历Wall,exLindl)的自然资源已濒临枯竭，该植物己被列入国家保护植物名录，而其昂贵的价格更加剧了对其资源的毁灭性破坏。石斛属植物的自然繁殖率低，生长缓慢，这也是导致其资源濒危的一个重要因素。白芨目前基本上依靠采集野生药材经加工后供药用。由于需求量的增加，导致药农对野生资源大量采挖，野生资源在不断减少，产量在不断下降，价格却一直在不断增长，目前已经处于濒危状态。为了实现对濒危物种的保护和应用的双重目的，在拯救和保护珍稀瀕危物种的同时，还要对物种所在的整个生态系统进行研究，以利于资源的可持续利用。兰科药用植物种子的田间萌发一直是一个难题，尤其是石斛种子的田间萌发国内外尚无人研究。研究石斛属种子的萌发以及真菌在种子萌发过程中所起的作用，是石斛属植物资源保护的一个重要内容。关于石斛属植物的栽培技术研究目前已有一些报道，利用组织培养的方法已经能够获得栽培用的幼苗，并在云南省和浙江省等地有小规模的栽培。但是在实际应用中，使用组培快繁获得的无菌苗进行栽培时，练苗和移栽两个环节不仅从技术上，也从生产成本上限制了该方法的推广应用。在这方面技术未获得突破之前，石斛属植物还难以实现大面积的栽培生产。关于白芨的栽培技术目前仅有散见的报道，但是都缺乏系统的研究，而且没有大面积栽培基地出现，传统的依靠野生植株无性繁殖的方法进行栽培目前还有很多问题需要解决。野生变家种需要一段较长的驯化过程，但是目前还未见有此方面的报道。使用组织培养的方法解决濒危植物的繁殖和种质保存问题是一条有效的途径，目前，巳经有一些单位开展了种子，茎尖及侧芽，假鳞茎的组织培养和快速繁殖研究，能够在一段时间内获得无菌苗，但是练苗和移栽是一个限制其应用的难题，目前还没有有效的练苗移栽方法，这方面技术获得突破后，才可能得到实际的应用。另外，白芨作为一种常用的中药，其发生疗效的作用基础往往是复合化学成分的共同作用，而无菌苗在繁殖中由于激素或其他因素作用，可能导致内部成分发生变异，这种变异在培养中往往不易辨认，因此无菌苗栽培得到的植株，其成分含量有无变化，能否代替药材使用，也是有待研究的课题。兰科植物的种子被称为"灰尘种子"，具有以下特点种子细小，种子量巨大，每个蒴果内有几万到几十万粒种子，在自然界很难萌发，只有依靠适合的真菌为其提供营养才能够萌发。找到能促进兰科药用植物种子萌发的真菌，并利用互作技术使种子能够在自然条件下萌发，是实现兰科药用植物田间栽培的有效方法。目前，国内外有关促进兰科药用植物种子萌发真菌的研究报道很少，还没有发现能促进种子萌发优良真菌。近几年，我们使用新的真菌分离技术，分离到了对兰科药用植物种子萌发有促进作用的真菌。与种子的无菌萌发和组织培养相比，种子与真菌的共生萌发能解决兰科药用植物种子的田间应用难题，从而减少生产环节，降低生产成本，具有巨大的应用价值。
发明内容本发明的目的是提供能够促进兰科植物种子萌发的三株真菌菌株。为解决兰科植物某些种的濒危现状提供一条新的途径。本发明采用的3株真菌经鉴定分别为丝核菌属真菌Bsgll(朋/卵"o/w'asp.)，保藏编号CGMCCNo.2450，胶膜菌属真菌Bsgl4(7WaOTe77asp.),保藏编号CGMCCNo.2451，这2株真菌于2008年4月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，小菇属真菌MF24(补ce朋sp.)，保藏编号CGMCCNo.1350，该菌株于2005年4月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所。3株真菌的保藏和存活证明见附件。三株真菌的培养特性分别为Bsgll:在PDA培养基上，菌落圆形，初期菌落白色，后期正面和背面都为浅黄色，气生菌丝不发达，25。C生长一周的菌落直径为8.8厘米，常规培养基上不产生孢子。Bsgl4:在PDA培养基上，初期和后期的菌落都为白色，菌落圆形，气生菌丝不发达，25"C生长一周的菌落直径为6.8厘米，常规培养基上不产生孢子。MF24:在PDA培养基上，初期和后期的菌落都为白色，菌落圆形，气生菌丝较发达，25r生长一周的菌落直径为5.5厘米，常规培养基上不产生孢子。本发明所述三株真菌的内转录间隔区核糖体DNA的序列如序列表所示。本发明所述三株真菌具有与兰科植物种子互作使种子共生萌发的作用，兰科植物种类可以为铁皮石斛，兜唇石斛，黑毛石斛，束花石斛，齿瓣石斛，白芨。本发明所述三株真菌可以用于兰科植物种子共生萌发的研究，也可以与兰科植物种子伴播，用于育苗盘或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。本发明的有益效果是-本发明所述的真菌菌株具有与部分兰科植物种子互作而使其共生萌发的生理活性，有助于解决兰科植物种子在田间难于萌发的问题，能够为兰科植物资源的保护和可持续利用以及繁殖和栽培提供一个有力的工具，具有巨大的应用价值。具体实施方式实施例l萌发真菌的分离在白芨和石斛的适宜生长环境中播种种子，获得种子、原球茎和幼苗，经过对萌发材料表面消毒后分离筛选得到萌发真菌。实施例2Bsgl4对铁皮石斛种子的萌发效果把铁皮石斛种子播种到已经长满Bsgl4真菌菌丝的麦麸、树叶和锯末上，以灭菌的麦麸、树叶和锯末上播种种子为对照，在培养室中培养，培养温度为23-27'C，每日光照12小时，光照强度为1200Lx,两个月时调查种子萌发情况，结果为接种Bsgl4真菌处理的铁皮石斛种子萌发率为67.3%，不接真菌处理的铁皮石斛种子萌发率为0.0%。实施例3Bsgl4对铁皮石斛种子的萌发效果把铁皮石斛种子播种到已经长满Bsgl4真菌菌丝的麦麸、树叶和锯末上，以灭菌的麦麸、树叶和锯末上播种种子为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C,自然光照，每日光照时间为8-IO小时，两个月时调查种子萌发情况，结果为接种Bsgl4真菌处理的铁皮石斛种子萌发率为65.1%，不接真菌处理的铁皮石斛种子萌发率为0.0%。实施例4Bsgl4对铁皮石斛种子的萌发效果把真菌菌丝接种到麦麸、树皮和锯末上，待长满菌丝后，把以上接菌材料撒到大田，在这些菌材上播种种子，然后覆盖一层枯枝落叶，保持湿度；以不接种真菌，其他条件相同的处理为对照，三个月时调査种子萌发情况，结果为接种Bsgl4真菌处理的铁皮石斛种子萌发率为56.9%，不接真菌处理的铁皮石斛种子萌发率为0.0%。实施例5Bsgl4对白芨种子的萌发效果把白芨种子播种到已经长满Bsgl4真菌菌丝的麦麸、土壤和锯末上，以灭菌的麦麸、土壤和锯末上播种为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C,自然光照，每日光照时间为8-10小时，三个月时调查萌发率，结果为接种Bsgl4真菌处理的白芨种子萌发率为61.2%，不接真菌处理的白芨种子萌发率为O.0%。实施例6Bsgll对白芨种子的萌发效果把白芨种子播种到己经长满Bsgll真菌菌丝的麦麸、土壤和锯末上，以灭菌的麦麸、土壤和锯末上播种为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C，自然光照，每日光照时间为8-10小时，三个月时调查萌发率，结果为接种Bsgl4真菌处理的白芨种子萌发率为45.2%，不接真菌处理的白芨种子萌发率为O.0%。实施例7MF24对白芨种子的萌发效果把白芨种子播种到已经长满MF24真菌菌丝的麦麸、土壤和锯末上，以灭菌的麦麸、土壤和锯末上播种为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C，自然光照，每日光照时间为8-10小时，三个月时调查萌发率，结果为接种Mf24真菌处理的白芨种子萌发率为36.9%，不接真菌处理的白芨种子萌发率为O.0%。实施例6Bsgl4对束花石斛种子的萌发效果把束花石斛种子播种到已经长满Bsgl4真菌菌丝的麦麸、树叶或锯末上，以灭菌的麦麸、树叶或锯末上播种为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C,自然光照，每日光照时间为8-10小时,两个月时调査种子萌发情况，结果为接种Bsgl4真菌处理的束花石斛种子萌发率为73.2%，不接真菌处理的束花石斛种子萌发率为0.0%。实施例7Bsgl4对齿瓣石斛种子的萌发效果把齿瓣石斛种子播种到已经长满Bsgl4真菌菌丝的麦麸、树叶或锯末上，以灭菌的麦麸、树叶或锯末上播种为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C,自然光照，每日光照时间为8-10小时，两个月时调査种子萌发情况，结果为接种Bsgl4真菌处理的齿瓣石斛种子萌发率为65.1%，不接真菌处理的齿瓣石斛种子萌发率为0.0%。实施例8Bsgl4对兜唇石斛种子的萌发效果把兜唇石斛种子播种到已经长满Bsgl4真菌菌丝的麦麸、树叶或锯末上，以灭菌的麦麸、树叶或锯末上播种为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C，自然光照，每日光照时间为8-10小时,两个月时调查种子萌发情况，结果为接种Bsgl4真菌处理的兜唇石斛种子萌发率为16.4%，不接真菌处理的兜唇石斛种子萌发率为0.0%。实施例9Bsgl4对黑毛石斛种子的萌发效果把黑毛石斛种子播种到巳经长满Bsgl4真菌菌丝的麦麸、树叶或锯末上，以灭菌的麦麸、树叶或锯末上播种为对照，在温室中培养，培养温度为15-26'C,自然光照，每日光照时间为8-10小时，两个月时调查种子萌发情况，结果为接种Bsgl4真菌处理的黑毛石斛种子萌发率为85.4%，不接真菌处理的黑毛石斛种子萌发率为0.0%。比较例l光照对真菌Bsgl4与铁皮石斛种子共生萌发的影响采用菌叶法进行实验，把真菌接种到灭菌的栗树叶上，待树叶表面长满菌丝后把铁皮石斛种子播种到树叶表面，于25土2'C的环境中共培养。光照条件设以下2种处理(1)光照培养光照强度为1200Lx，光周期为12小时。在此条件下，与真菌Bsgl4共生培养的处理组记作L，不接真菌的对照组记作LCK。(2)黑暗培养在此条件下，与真菌Bsgl4共生培养的处理组记作D，不接真菌的对照组记作DCK。以上各组均设4次重复。从培养的第l周开始，每周调查各组种子的萌发率。结果见表l。表l.光照对真菌Bsgl4与铁皮石斛种子共生萌发率的影响处理组萌发率(％)第l周第2周第3周第4周第5周第6周第7周第8周第9周第10周00007.1628.1560.8467.2867.2867.28LCK0000000000D00004.4216.2335.8969.472.6772.67DCK0000000000光照能够促进真菌与铁皮石斛种子的共生萌发，表现为在种子萌发初期L处理组的萌发率高于D处理组，培养第7周时，L处理组的萌发率极显著高于D处理组(PO.01);黑暗更有利于铁皮石斛种子的萌发，表现为D处理组的最终萌发率高于L处理组，培养第10周时，D处理组的萌发率显著的高于L处理组的萌发率。继续培养观察发现，黑暗条件下萌发的种子不能形成幼苗，而光照条件下的萌发的种子在2-3个月就可以形成幼苗。铁皮石斛种子不能在无菌的树叶上萌发，表明菌叶法中真菌Bsgl4是诱导铁皮石斛种子萌发的唯一因素，说明真菌Bsgl4具有促进铁皮石斛种子萌发的生理功能。比较例2光照对真菌Bsgl4与白芨种子共生萌发的影响采用菌叶法进行实验，把灭菌的栗树叶置于真菌培养基表面，接种真菌，树叶表面长满菌丝后把白芨种子播种在树叶表面，于25士2'C的环境中共培养。光照条件设以下2种处理(1)光照培养光照强度为1200Lx，光周期为12小时。在此条件下，与真菌Bsgl4共生培养的处理组记作L，不接真菌的对照组记作LCK。(2)黑暗培养在此条件下，与真菌Bsgl4共生培养的处理组记作D，不接真菌的对照组记作DCK。以上各组均设4次重复。从培养的第l周开始，每周调査各组种子的萌发率。结果见表2。表2.光照对真菌Bsgl4与白芨种子共生萌发率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>光照能够促进真菌与白芨种子的共生萌发，表现为在种子萌发初期L处理组的萌发率高于D处理组，培养第6周时，L处理组的萌发率显著高于D处理组(PO.05);最终萌发率仍然是L处理组高于D处理组，培养第8周时，L处理组的萌发率高于D处理组的萌发率。白芨种子不能在无菌的树叶上萌发，表明菌叶法中真菌Bsgl4是诱导白芨种子萌发的唯一因素，说明真菌Bsgl4具有促进白芨种子萌发的生理功能。比较例33株真菌对白芨种子萌发的影响。该实验与比较例2的试验时间及所用的种子不同。实验方法为把白芨种子播种到已经长满真菌菌丝的树叶上，真菌选用三种，分别为Bsgl4，Bsgll，MF24。以无菌的树叶上播种为对照，在温室条件下培养，培养温度为20-27'C，从培养的第l周开始，每周调査各组种子的萌发情况，结果见表3。以上每种处理重复4次。表3.3株真菌对白芨种子萌发率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3种真菌菌株都对白芨种子有很好的萌发效果。不加真菌的对照组种子萌发率始终为0%，而加入真菌以后的试验处理组都有很高的萌发率，萌发的速度也很快，在第8周达到了最大萌发率。不同真菌菌株与白芨种子互作使白芨种子共生萌发的效果有些差别，3株真菌中，Bsgl4促进白芨种子萌发的效果最好，种子的最终萌发率最高，而且萌发的速度较快。三株真菌的内转录间隔区核糖体DNA的序列，又称为ITS序列，分别如下Bsgll:60120180240300360420480540AAATTTTAAAATCTGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAABsgl4:60120180240300360420480GCTCGCGTCACCAAGTCCTCGTCCTTTGGGATGCTGMF24:60120180240300360420480540权利要求1、促进兰科植物种子萌发的三株真菌菌株，它们的分类命名分别为保藏编号为CGMCCNo.2450的丝核菌属真菌Bsg11(Rhizoctoniasp.)，保藏编号为CGMCCNo.2451的胶膜菌属真菌Bsg14(Tulasnellasp.)和保藏编号为CGMCCNo.1350的小菇属真菌MF24(mycenasp.)，三株真菌的保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2、如权利要求1所述的3株真菌，其特征在于它们的内转录间隔区核糖体DNA的序列，又称为ITS序列，如下Bsgll:60120180240300360420480540AAATTTTAAAATCTGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAABsgl4:60120180240300360420480GCTCGCGTCACCAAGTCCTCGTCCTTTGGGATGCTGMF24:601201802403003603、如权利要求1所述的3株真菌的用途，其特征在于兰科植物可以为铁皮石斛，兜唇石斛，黑毛石斛，束花石斛，齿瓣石斛，白芨。4、如权利要求1所述的3株真菌，其特征在于可以用于兰科植物种子共生萌发的研究，或与兰科植物种子伴播，用于育苗盘或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。全文摘要本发明公开了促进兰科植物种子萌发的三株真菌菌株，它们的分类命名分别为保藏编号为CGMCCNo.2450的丝核菌属真菌Bsg11(Rhizoctoniasp.)，保藏编号为CGMCCNo.2451的胶膜菌属真菌Bsg14(Tulasnellasp.)和保藏编号为CGMCCNo.1350的小菇属真菌MF24(Mycenasp.)，上述三株有效真菌菌株对于解决兰科植物种子的萌发问题具有重要意义；这三株有效真菌菌株可以与兰科植物种子伴播，用于育苗盘或花盆或苗床的育苗或大田的栽培，具有代替组织培养获得种苗的应用价值。文档编号A01P21/00GK101565676SQ20081009395公开日2009年10月28日申请日期2008年4月24日优先权日2008年4月24日发明者房慧勇,肖培根,郭顺星,陈晓梅申请人:中国医学科学院药用植物研究所