专利名称：一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方法
技术领域：
本发明涉及一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方法，更具体地 说，是涉及一种分子标记辅助选择法选育幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的育 种方法。
背景技术：
养蚕缫丝在我国已经有五千多年的历史，是我国最具特色的传统优势产业之 一，也是我国能够主导国际市场的少数产品之一，目前，我国的蚕茧和生丝产量
均居世界第一，分别占世界总产量的75%左右。
蚕丝业不仅对增加农民收入和扩大劳动就业方面具有重要的作用，而且蚕的 食物-桑树在环境保护、退耕还林等方面也具有重要的作用和意义，因此，许多 地区在生态保护和退耕还林中，把发展蚕桑业作为首选和重点项目。
家蚕新品种选育是蚕丝业科技进步的基础和核心之一，在新中国成立后，我 国的家蚕品种选育取得了巨大的成就，在全国范围内先后进行了 4-5次蚕品种的 更新换代，极大地促进了蚕丝业的发展。然而，随着我国经济的快速发展，劳动 力成本也随之增加，环境污染尤其是氟化物污染严重危害蚕业生产，选育经济性 状优良，抗性强的家蚕品种已经是迫在眉睫，也是稳定蚕丝业的重要举措之一。 随着分子标记技术的发展，本课题组利用自行筛选的家蚕耐主基因Def(白 会钗等，蚕业科学，2008， 34: 191-196)和无鳞毛基因nlw的SSR分子标记， 及其他研究人员公布的与nlw紧密连锁的STS位点，进行了分子标记辅助选择家 蚕耐氟且成虫无鳞毛的新品种筛选工作，为稳定氟污染地区的蚕业生产及保障蚕 种制造从业者的身体健康，减少病源传播与扩散等奠定物质基础。到目前为止， 还没有该类型分子标记用于家蚕辅助育种，加速育种进程的报道。
发明内容
技术问题本发明的目的是为了解决分子标记用于家蚕辅助育种选择的技术 问题，提供一种采用分子标记辅助选择法选育幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛的家蚕品
3种的育种方法。
技术方案为了实现上述目标，本发明的一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕 品种的选育方法，其技术方案包括如下步骤
(1)用全国推广量最大的菁松(中系)为轮回亲本，基因突变品系U13无 鳞毛优质目标性状供体亲本进行杂交，得杂交1代；再用杂交1代与耐氟优质目 标性状供体亲本T6杂交，获得杂交2代，之后用轮回亲本与杂交2代连续回交， 获得回交6代；对每一世代在饲育过程中进行农艺性状选择，留种个体采用分子 标记选择其基因型，获得遗传背景与菁松相同，全龄耐氟100mg/kg且成虫翅无 鳞毛的目标材料JsFnlw;
(2) 用全国推广量最大的皓月(日系)为轮回亲本，基因突变品系U13无 鳞毛优质目标性状供体亲本进行杂交，得杂交1代；再用杂交1代与耐氟优质目 标性状供体亲本T6杂交，获得杂交2代，之后用轮回亲本与杂交2代连续回交， 获得回交6代；对每一世代在饲育过程中进行农艺性状选择，留种个体采用分子 标记选择其基因型，获得遗传背景与菁松相同，全龄耐氟100mg/kg且成虫翅无 鳞毛的目标材料HyFnlw;
(3) 将目标材料JsFnlw与目标材料HyFnlw进行杂交，获得杂交1代，即 为全龄耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种。
上述步骤(1)所述的菁松为中国系统； 上述步骤(2)所述的皓月为日本系统；
上述步骤(3)所述的幼虫耐氟为全龄耐腐100mg/kg;所述成虫翅无鳞毛为 成虫翅没有鳞毛或鳞毛很少。
有益效果本发明所提供的一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方
法与传统的杂交回交育种技术相比具有如下优点
传统的杂交育种技术存在工作量大，选择可靠性差，特别是对于耐氟性选育 必须累代添食氟化物的方法来保证目标性状不丢失，而无鳞毛性状为隐性单基
因，必须用F,杂交后才能从F2代中筛选目标性状，选育周期长，劳动量大，而
本发明通过分子标记辅助选择轮回亲本的遗传背景和供体亲本的目标性状，可在
3_4年内快速高效培育出高产、优质、幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛的家蚕新品系。 本发明方法育成的品种"JsFnlw";主要特征为，中系二化性四眠品种，幼虫为素斑，蚕体粗壮，食桑旺盛，发 育整齐，老熟齐涌，体质强健，全龄耐氟100mg/kg (桑叶含氟量)，成虫翅透明 无鳞毛或很少鳞毛。催青经过10日，幼虫期经过23-24天，蛹期经过14-15天， 茧形椭圆，茧色洁白，縮皱中等，全茧量1.8-2.0g，茧层率23%左右，茧丝长1250 米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活泼、交配性能好，雌蛾产卵性能良好，单蛾 卵数500-600粒，与HyFnlw对交需推迟2日开始词养。
育成的品种"HyFnlw";
主要特征为，日系二化性四眠品种，幼虫为普斑，蚕体粗壮，食桑旺盛，发 育整齐，老熟较齐，体质强健，全龄耐氟100mg/kg (桑叶含氟量)，成虫翅透明 无鳞毛或很少鳞毛。催青经过10日，幼虫期经过24-25天，蛹期经过15-16天， 茧形束腰，茧色洁白，缩皱中等，全茧量1.8-2.0g，茧层率23%左右，茧丝长1200 米左右，解舒好。羽化集中，雄蛾活泼、交配性能好，雌蛾产卵性能良好，单蛾 卵数500-600粒，与JsFnlw对交需提前2日开始饲养。
具体实施例方式
一、对采用材料的说明
已有的研究结果表明，家蚕成虫翅无鳞毛性状由隐性单基因nhv控制，只有 在基因纯合情况下才能表现成虫翅无鳞毛性状(张志芳，秦俭.蚕蛾瑪明翅的研 究.蚕业科学，1991, 17(3): 186-187.);家蚕对氟化物的耐受性由显性主效基因De/ 控制(耐氟阈值为200mg/kg)(林昌麟，糜懿殿，姚勤,等.家蚕耐氟显性主效基因 的发现，蚕业科学,1997 ，23(4) :237-239)，只要该基因存在，无论是杂合型还是 纯合型，都表现出对氟化物的耐受性。
(一)、家蚕无鳞毛突变体亲本U13 (公知公用，张志芳，秦俭.蚕蛾透明 翅的研究.蚕业科学 ， 1991, 17(3): 186-187 ; http:〃www.cnsilkworm.com/Html/Main.asp， 品系名为U13)
1、 来源中国农业科学院蚕业研究所收集保存的家蚕品种，并通过国家经济昆 虫资源平台对外共享。
2、 主要特征特性中国系统、 一化性三眠品种，幼虫素斑，蚕体细小，发育整
5齐，体质强，老熟齐涌，多营上层茧。催青经过10日，幼虫期经过16日左 右，蛹期经过12日左右，茧形小椭圆，茧色白，縮皱细，全茧量0.6g左右， 茧层率10%左右，茧丝长250米左右，解舒良好，羽化集中，单蛾产卵粒数 320粒左右，成虫翅无鳞毛。
(二) 、家蚕耐氟亲本品种T6 (公知公用，见参考文献林昌麟，糜懿殿, 姚勤,等.家蚕耐氟显性主效基因的发现，蚕业科学,1997 ，23(4) :237-239)，
1、 来源中国农业科学院收集保存的家蚕品种，并对外合作共享。
2、 主要特征特性日本系统二化性四眠品种，幼虫普斑，蚕体细长，食桑快， 发育整齐，体质强，老熟齐涌，多营上层茧。催青经过10日，幼虫期经过 26天左右小时，蛹期经过15-16天，茧形长筒浅束，茧色白，縮皱中等，全 茧量1.6-1.8g,茧层率24%左右，羽化集中，单蛾产卵粒数500粒左右，高 度耐氟(阈值200mg/kg)。
(三) 、轮回亲本菁松、皓月 菁松X皓月是我国使用最为广泛的一对家蚕杂交组合，它的产量高、丝质优、
体质强健，成虫翅膀鳞毛正常密布，耐氟能力差。
二、具体实施步骤
(1) 、用菁松为轮回亲本，U13为无鳞毛基因供体，T6为耐氟主效基因供 体，用菁松与U13进行杂交后，得其F1再与T6杂交，即(菁松XU13) XT6， 之后用菁松连续回交，词育过程中对品种的农艺性状进行综合筛选，采用分子标 记对目标性状进行筛选，获得遗传背景与菁松相同，幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛的 JsFnlw。
(2) 用皓月为轮回亲本，U13为无鳞毛基因供体，T6为耐氟主效基因供体， 用皓月与U13进行杂交后，得其F1再与T6杂交，即(皓月XU13) XT6，之 后用皓月连续回交，饲育过程中对品种的农艺性状进行综合筛选，采用分子标记 对目标性状进行筛选，获得遗传背景与皓月相同，幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛的 HyFnlw。
(3) 用JsFnlw与HyFnlw进行杂交，获得杂交1代，即为幼虫耐氟且成虫 翅无鳞毛的家蚕品种。三、对无鳞毛基因及耐氟主基因的PCR检测
提取待检测的家蚕蛾的基因组DNA，取20-50ng作模板，用与nlw基因连 锁的SSR标记引物S1303 (公众公用，见参考文献Miao Xue-Xia等，Simple sequence repeat-based consensus linkage map of Bombyx mori. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2005, 102(45):16303陽16308.)及STS标记 Cash2p (公知公用，见参考文献周庆祥，家蚕无鳞片翅突变体scaleless产生 机理的研究.中国农业科学院研究生院博士论文，2007年6月)；用与Def基因 连锁的SSR标记引物S1214和S121201进行扩增(2对引物均为公知公用，见 文献白会钗等，利用SSR标记对家蚕耐氟基因进行连锁定位分析蚕业科学，2008， 34: 191-196)。 SI303引物序列
左端引物序列5、- GCATCCCCACTATCGTCAACT-3、 右端引物序列5- TCCGTTCAGGCTTATCGTCAGTA-3'
Cash2p引物序列
左端引物序列5'- GTATAACAACTTTGGATTAATTGG -3、 右端引物序列5- GATTGGACTCAGTATATTCG -3、
S121201引物序列
左端引物序列5、-AGTTCTTGCTTGTTTCCGTTCT-3、 右端引物序列5- CGCCGTATGTATTTATTCCTCA-3、
S1214引物序列
左端弓I物序列5 、 - AATGGATGCGTGCCAGTTTG -3 、 右端引物序列5- CGTTAGTTGCTCTACGCTTTTGG-3'
PCR反应程序按照2篇文献的程序95 °C变性3 min, 63 °C退火40 s， 72 °C 延伸1 min; 16个Touchdown循环，94 °C、 45 s，退火温度依次递减0.5°C直到 56 。C 40 s， 72 °C 1 min; 94 °C 40 s， 56 。C 40 s, 72 °C 1 min， 24个循环；72 °C10 min。 PCR产物用eGene的HAD-GT12全自动毛细管核酸分析系统检测。
^^ 4^择的* PeRr产物绘HAD"GTt2全自动毛细管核酸分析系统
检测为2条带的，为杂合型，证明该个体携带目标基因，可以使用，淘汰与轮回
亲本一致带型的个体；
回交后自交的个体，经检测为与U13 (检测无鳞毛基因)或T6 (检测耐氟
基因) 一致的纯合型(一条带)，表明该个体携带的目标基因已经纯合，可以使
用，淘汰带型与轮回亲本相同及杂合型(2条带)的个体。
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权利要求
1、一种家蚕幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛品种的选育方法，其特征在于，包括如下步骤(1)用全国推广量最大的菁松(中系)为轮回亲本，基因突变品系U13无鳞毛优质目标性状供体亲本进行杂交，得杂交1代；再用杂交1代与耐氟优质目标性状供体亲本T6杂交，获得杂交2代，之后用轮回亲本与杂交2代连续回交，获得回交6代；对每一世代在饲育过程中进行农艺性状选择，留种个体采用分子标记选择其基因型，获得遗传背景与菁松相同，全龄耐氟100mg/kg且成虫翅无鳞毛的目标材料JsFnlw；(2)用全国推广量最大的皓月(日系)为轮回亲本，基因突变品系U13无鳞毛优质目标性状供体亲本进行杂交，得杂交1代；再用杂交1代与耐氟优质目标性状供体亲本T6杂交，获得杂交2代，之后用轮回亲本与杂交2代连续回交，获得回交6代；对每一世代在饲育过程中进行农艺性状选择，留种个体采用分子标记选择其基因型，获得遗传背景与菁松相同，全龄耐氟100mg/kg且成虫翅无鳞毛的目标材料HyFnlw；(3)将目标材料JsFnlw与目标材料HyFnlw进行杂交，获得杂交1代，即为全龄耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种。
2、 根据权利要求1所述的一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方 法，其特征在于步骤(1)所述的菁松为中国系统。
3、 根据权利要求1所述的一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方 法，其特征在于步骤(2)所述的皓月为日本系统。
4、 根据权利要求1所述的一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方 法，其特征在于步骤(1)、 (2)所述的连续回交为至少6次。
5、 根据权利要求1所述的一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方 法，其特征在于步骤(3)所述的耐氟为全龄耐氟100mg/kg;成虫翅无鳞毛为 成虫翅没有鳞毛或鳞毛很少。
全文摘要
本发明公开了一种幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛家蚕品种的选育方法，该方法以菁松(中系)、皓月(日系)为轮回亲本，T6为耐氟优质目标性状供体亲本，基因突变品系U13为无鳞毛基因供体。用轮回亲本与U13杂交得杂交1代再与T6杂交，获得的子代与轮回亲本连续回交，每一世代在饲养过程中进行个体选择，选择的个体用分子标记选择其基因型，再自交纯合6代以上，选育出2个幼虫耐氟且成虫翅无鳞毛的家蚕品种“JsFnlw”和“HyFnlw”，该品种体质强健，幼虫全龄耐氟100mg/kg以上，耐氟性能比生产用品种菁松、皓月高出50％，成虫翅无鳞毛，制种过程中产生的微尘比普通家蚕品种减少50％，其经济性状达到生产用品种水平。
文档编号A01K67/00GK101427667SQ20081019525
公开日2009年5月13日 申请日期2008年10月31日 优先权日2008年10月31日
发明者侯成香, 孙平江, 张月华, 徐安英, 李木旺, 郭锡杰, 钱荷英 申请人:江苏科技大学