专利名称：：鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于一种生物代谢物与化学复配的杀菌剂及其应用，尤其是涉及一种有效活性成分为鲍曼菌液活性粗浸膏和嘧霉胺的复配杀菌剂及其应用。
背景技术：
：梨黑斑病是梨三大病害之一，由丝孢纲丝孢目链格孢属真菌(y4/ter憩r/a"/terwatoJapanesepearpathotype)危害弓I起。梨黑斑病是一种广泛发生的世界性病害，尤其在亚洲的日本、韩国和中国梨发病最为严重。近年，在法国也发现有梨黑斑病的发生与危害。该病主要侵染果实、叶片和新梢。幼叶最早发病，严重时病叶上病斑连片，叶片铍縮畸形并枯焦脱落。果实受害，病斑处产生龟裂，易引起早期落果。黑斑病不仅影响梨树早期落叶和果实品质及产量，还造成贮藏期病果。并且在梨的进出口贸易中受到进口国的严密关注。目前在生产上防治梨黑斑病多采用代森锰锌、百菌清等化学杀菌剂，由于常用的保护性杀菌剂只能起预防作用，内吸性杀菌剂长期使用易产生抗药性，且农药残留大，效果不好，因此生产上急需开发新型广谱、高效、低毒的生物杀菌剂作为替代。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的微生物。随着近年来研究的深入，越来越多的抗菌物质从内生菌代谢产物中分离出来，包括肽类、有机酸、萘等。如5.s"6ft7/s能够产生的几十种不同结构的抗生素。非核糖体合成的脂肽类抗生素是其中最常见的一类，主要包括iturin、surfactin和fengycin3个家族。脂肽类抗生素由氨基酸链和脂肪酸侧链组成，稳定性好，对人畜无害不污染环境，是具有重要开发价值的新型生物源农药。其中iturin家族是一类含有7个氨基酸的环状脂肽，具有强烈的抗真菌作用。研究表明，iturin抗菌作用的机理是将疏水性尾巴插入细胞质膜，并自动聚集形成离子通道，从而使细胞质发生泄漏。此外iturinA还能释放电解质和高分子集合物，增加生物质膜的电导率和通透性，影响细胞膜的表面张力抑制病原菌孢子的形成。国外有报道iturin成功应用于生物防治的例子，国内对脂肽的研究主要集中在表面活性素surfactin，而对iturin的研究相对较少。鲍曼菌液C4c/從to6acfer6做/m2mw7)是南京大学从药用植物樟树内生细菌中分离出来的一株鲍曼菌株(LCH0606)，它是一种植物生防菌,已经由CN1973631号专利文献公开(保藏号为CGMCCNo1752)。采用该菌株离心后获得的鲍曼菌液对小麦赤霉病等病害具有很好的防治效果。针对鲍曼菌液产生的抗生素种类和活性物质量的分析，用鲍曼菌液经离心、大孔树脂吸附浓縮后得到0.53g/L鲍曼菌活性粗浸膏，再硅胶柱层析、葡聚糖凝胶Sephadex-LH20反复纯化鲍曼菌液中的抗菌活性物质，并经核磁、质谱等分析，得出鲍曼菌液的抗菌成分为脂肽类物质iturinA2、iturinA3和IturinA6，且三者含量比为1:1:1，其中的活性化合物3mg/L。故LCH0606是一株具有较大开发潜力的农用生防菌。LCH0606，在PSA平板上37。C培养24h后的菌落呈现规则圆形、灰白色、表面低凹、不透明、干燥易挑取、无粘性、边缘光滑。该菌各种染色的显微观察结果显示为短杆状、无芽孢、无鞭毛；革蓝氏染色呈阴性；直径约1.01.5Um。其活性成分为IturinA，在中性和碱性以及〈10(TC条件下相对稳定，抗菌活性可保持80%以上、在酸性条件下鲍曼菌液活性粗浸膏的抗菌活性易受破坏。加入C^+可显著提高抗菌活性。易容于水。经处理后病原菌表现为孢子不萌发，菌丝短小,细胞破裂而内含物流出。嘧霉胺(Pyrimethanil)，化学名称N-(4,6-二甲基嘧啶-2-基)苯胺。理化性质，白色或白色带微黄色结晶。能溶于有机溶剂，微溶于水，室温下(25°C)在水中溶解度为0.121g/L，熔点96.3°C(纯品)，蒸气压2.2xlO-3Pa(25°C)，在弱酸-弱碱性条件下稳定。嘧霉胺杀菌剂，是法国安万特作物科学公司1998年在我国登记商品名为施佳乐40%悬浮剂，防治黄瓜、番茄灰霉病，该药是一种高效、低毒的苯胺基嘧啶新型杀菌剂对灰霉病防治活性最高。对病菌具有内吸传导和熏蒸作用，施药后可迅速传到植物体内各部位，有效抑制病原菌侵染酶的产生，从而阻止病菌侵染，彻底杀死病菌。现今由于环境的恶化和农业生产水平的不断提高，植物病害的种类和数量也相应不断增加，尤其是耐药或抗药性病原菌的出现等问题，使人们对各种能够有效抑制或杀死各类致病菌的药物的需求量不断上升，寻找新型有效药物，特别是生物药物，已成为当今研究的热点之一。生物与化学方法相结合是提高防效和扩大防治对象、减缓病虫抗药性、减少污染、降低农药残留的一种有效方法，目前，针对鲍曼菌液活性粗浸膏和嘧霉胺的复配杀菌剂国内外还未见报道。
发明内容本发明的目的在于针对嘧霉胺单剂使用成本较高问题，提供一种由鲍曼菌液活性粗浸膏和嘧霉胺复配的复配杀菌剂。本发明这样实现的一种鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及溶剂，其特征在于有效活性成分占成品药剂的重量百分比为1~50%，所述的有效活性成分由鲍曼菌液活性粗浸膏和嘧霉胺组成，其中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为10~80%。在本发明中在有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为20~70%。在本发明中在有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏分比为5070%。在本发明上述方案中在成品药剂中助剂和溶剂的重量百分比分别为5~40%和1090%。本发明中所述成品药剂的剂型为水悬浮剂。一种如上所述的复配杀菌剂的应用，其特征在于将成品药剂稀释后喷洒在梨树上用于防治梨黑斑病。在复配杀菌剂的具体应用中，可以将成品药剂稀释50-2000倍，稀释后有效药物成分的含量至少为200mg/L。本发明的优点在于将鲍曼菌液活性粗浸膏与嘧霉胺进行复配后，与现有单剂使用相比，明显增效，大大提高了杀菌活性，减小了病菌抗药性;采用植物病害生防菌与化学农药复配，大幅度降低了化学农药的用量，尤其是鲍曼菌液活性粗浸膏在环境中较易降解，不仅降低了化学农药使用成本，而且减少了化学农药的残留以及它对环境的污染。具体实施例方式实施例l:供试药剂鲍曼菌液由南京大学提供，99%鲍曼菌液活性粗浸膏是通过鲍曼菌液经离心、大孔树脂吸附浓縮后得到(自制，每升鲍曼菌液可以获得0.53g)。95%嘧霉胺原药由南京盼丰化工有限公司提供。供试病菌梨黑斑病病原菌链格孢菌(江苏省农业科学院植保研究所提供)；测定方法平皿菌丝生长抑制法。在预备试验的基础上，选择两种药剂对病菌菌丝生长抑制率在10%90%范围内的5个剂量梯度(鲍曼菌液活性粗浸膏剂量分别为0.2635、0.1054、0.0263、0.0105、0.0053mg/L;嘧霉胺剂量分别为2.6346、1.0538、0.2635、0.1054、0.0527mg/L)的含药PSA平板，以加入等体积无菌水PSA平板为空白对照，然后用直径为5mm的打孔器在预培养4^5d黑斑病菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，菌丝面朝下接种到含药培养基平板中央，重复5次，置于(25il)'C下进行暗培养，待对照的菌落边缘接近皿壁时用十字交叉法测量菌落直径并计算抑菌率。采用毒力曲线法即取剂量对数为横坐标(x)，抑菌百分率值为纵坐标(y)，在计算机上绘制毒力曲线，求出两种药剂毒力回归方程("a十bx)、相关系数(r)，进而计算出ECso值。菌落直径(mm)-实际测量的菌落直径(mm)—5.00(mm)抑菌率(％)=[(对照菌落直径一处理菌落直径)/对照菌落直径]X100鲍曼菌液活性粗浸膏与密霉胺不同配比混剂对梨黑斑病病菌的联合毒力测定。按鲍曼菌液活性粗浸膏与密霉胺EC5o剂量比分别为10:0、0:10、5:5、6:4、4:6、7:3、3:7、8:2、2:8、9:1、1:9、O:O进行混配，制成含量PSA平板，以加入等体积无菌水为空白对照，然后用直径为5mm的打孔器在预培养45d黑斑病菌落边缘的同一圆周上打取菌饼，菌丝面朝下接种到含药培养基平板中央，每处理5次重复，置于(25士1)"C下进行暗培养，待对照的菌落边缘接近皿壁时用十字交叉法测量菌落直径，计算各配比混剂实测EC5()，理论EC5Q和增效系数SR。复配剂的理论EC5o-单剂IEC5。X配比数+单剂HECsoX配比数复配剂的实测ECsf混剂IEC5oX配比数+混剂nECsoX配比数增效系数SR二混合物的理论EC5o/混合物的实测EC50参考Wadley公式(增效系数SR〉1.5为增效作用，1.5〉SRM.0为相加作用，SIK1.0为拮抗作用)，求出在各种配比中的类扩展系数(SR)复配增效作用的大小。表l不同配比的鲍曼菌液活性粗浸膏与嘧霉胺对梨黑斑病菌的毒力测定<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2:40%鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺水悬浮剂的配制。杀菌剂的复配增效作用通常使用增效指数SR来衡量。在鲍曼菌液活性粗浸膏与嘧霉胺按各配比复配，以配比为7:3、6:4和5:5为最佳，它们的增效指数分别为6.72、6.96和5.22，鉴于三者增效值相差不大，但在这三种比例中，由于7:3中嘧霉胺的含量最低，在本实施例中，我们特选择7:3作为最佳配比。助剂选择木质素磺酸钠、乳化剂OP-10;CMC;消泡剂有机硅酮；乙二醇；氯化钙。溶剂选择水。将各组分按照下列重量百分比备料鲍曼菌液活性粗浸膏28%;嘧霉胺12%;木质素磺酸钠10.0%;OP-10:5.0%;增稠剂CMC:1.0%;消泡剂有机硅酮0.01%;防冻剂乙二醇10.0%;氯化韩1.0%;水余量。制备过程将鲍曼菌液活性粗浸膏、嘧霉胺、木质素磺酸钠、OP-IO、增稠剂CMC、消泡剂有机硅酮、氯化钙、防冻剂乙二醇按上述比例置于反应釜中，用适量的水混合均匀，再将混合物引入砂磨机中碾磨至物料细度为2-4nm;碾磨后混合均匀即成水悬浮剂。理化性能用量筒混合法测定复配药分散性，在标准硬水条件下，稀释800-2000倍液观察悬浮率均大于78%，可以满足在2000倍的稀释比例内使用。冷贮稳定性在_10i2'C下贮藏无结冰。热贮稳定性将40%鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺水悬浮剂装入50ml瓶中，密封，在54士2'C恒温箱中保存14天，取出冷却。査漏后在24小时内检测有效成份含量符合标准要求。本40%鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺水悬浮剂根据世界卫生组织推荐的农药危害分级标准中分类为低毒级。大鼠雌雄急性经口LDso分别为4590和5800mg/kgb.w.，大鼠雌雄急性经皮LDso均大于2000mg/kgb.w.。对家兔皮肤、眼睛无刺激性。在试验剂量内无致畸、致癌、致突变作用。实施例3:被测农药40%鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺水悬浮剂(实施例2提供)。对照农药99%鲍曼菌液活性粗浸膏(自制)，40%嘧霉胺水悬浮剂(惠州市中迅化工有限公司提供)，50n/。多菌灵WK镇江农药厂有限公司提供)，清水。40%鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺水悬浮剂对梨黑斑病的田间药效试验田间药效试验于2008年6月24日至7月25日在江苏省农业科学院园艺研究所试验田进行。供试品种为丰水梨，9年生，株行距4mx5m。试验共设7个处理，其中4个为对照，每处理4次重复，每重复为一个小区，每小区面积2株树，共计28个小区，随机区组排列。每小E;用水量为4kg。用新加坡利农HD400型背负式手动高压喷雾器常规施药，施药前调査发病基数，6月25日施药，当日平均气温23'C,多云，东风1级，施药后以多云天气为主，施药后第15天调査发病情况，按国家农药田间药效试验准则中分级标准记载并计算病情指数和防治效果。采用邓肯氏新复极差Duncan法对试验数据进行分析(参见表2)。表240%鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺水悬浮剂防治梨黑斑病的田间试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述实施例不是对本发明的限制，具体实施时，在成品药剂中，有效活性成分为1~50%，助剂为5~40%，溶剂为1090%，其中，有效活性成分中有效活性成分由鲍曼菌液活性粗浸膏和嘧霉胺组成，在有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为10~80%。它们可以采用传统的助剂、溶剂配制成水悬浮剂。使用中将成品药剂稀释50-2000倍，稀释后有效药物成分的含量至少为200mg/L，再喷洒在梨树上用于防治梨黑斑病。在试验剂量范围之内对梨树生长安全。权利要求1、一种鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及溶剂，其特征在于有效活性成分占成品药剂的重量百分比为1～50％，所述的有效活性成分由鲍曼菌液活性粗浸膏和嘧霉胺组成，其中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为10～80％。2、根据权利要求1所述的鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂，其特征在于在有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为20~70%。3、根据权利要求1所述的鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂，其特征在于在有效活性成分中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为50~70%04、根据权利要求1或2或3所述的鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂，其特征在于在成品药剂中助剂和溶剂的重量百分比分别为5~40%和10~90%。5、根据权利要求4所述的鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂，其特征在于所述成品药剂的剂型为水悬浮剂。6、一种如权利要求,5所述的复配杀菌剂的应用，其特征在于将成品药剂稀释后喷洒在梨树上用于防治梨黑斑病。7、根据权利要求6所述的复配杀菌剂的应用，其特征在于将成品药剂稀释50-2000倍，稀释后有效药物成分的含量至少为200mg/L。全文摘要一种鲍曼菌液活性粗浸膏嘧霉胺复配杀菌剂及其应用，成品药剂中包括有效活性成分、助剂以及溶剂，其特征在于有效活性成分占成品药剂的重量百分比为1～50％，所述的有效活性成分由鲍曼菌液活性粗浸膏和嘧霉胺组成，其中，鲍曼菌液活性粗浸膏的重量百分比为10～80％。使用中将成品药剂稀释后喷洒在梨树上用于防治梨黑斑病。其优点是鲍曼菌液活性粗浸膏与嘧霉胺复配后，有明显增效作用，且减小了病菌抗药性；由于采用了植物病害生防菌，降低了化学农药的用量，降低了化学农药使用成本，减少了化学农药的残留以及它对环境的污染。文档编号A01N63/00GK101401588SQ20081019521公开日2009年4月8日申请日期2008年11月7日优先权日2008年11月7日发明者余向阳,常有宏,李晓刚,杨青松,经蔺申请人:江苏省农业科学院