专利名称：一种选育高产wf16616的寄生弯颈霉突变株的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种选育高产WF16616的寄生弯颈霉突变株的方法。
背景技术：
WF16616 (FR190293)是 1998 年从真菌寄生弯颈霉(Tolypocladium parasiticumN0.16616)的发酵培养液中分离得到的一种脂肽类物质，其分子式为C51H82N8O21S,经过结构修饰改造可以得到一种新型棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净(Micafungin, MFG, FK-463)。WF16616(FR190293)及 FK463 结构式如下:
权利要求
1.种选育生产WF16616的寄生弯颈霉突变菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将野生型寄生弯颈霉(Tolypocladiumparasiticum)的单孢子悬浮液进行紫外诱变，即将单孢子悬浮液用紫外光照射，然后避光涂布在固体平板上倒置培养至长出菌落，随机挑取单个菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，从中筛选出产量较高的突变株; 2)将步骤I)得到的WF16616高产突变株的单孢子悬浮液进行NTG(二硝基胍)诱变，即在单孢子悬浮液中加入NTG反应，然后涂布在固体平板上倒置培养至长出菌落，挑取菌落颜色形态变化较大的菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，筛选出产量较高的突变株； 3)将步骤2)得到的WF16616高产突变株的单孢子悬浮液进行紫外线和NaCl复合筛选，即将单孢子悬浮液用紫外光照射，然后避光涂布到含有NaCl的固体平板上倒置培养至长出菌落，选取菌落直径中等的菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，筛选出产量较高的突变株； 4)将步骤3)得到的WF16616高产突变株的单孢子悬浮液进行紫外线和发酵产物WF16616复合筛选，即将单孢子悬浮液用紫外光照射，然后避光涂布到含有发酵产物WF16616的固体平板上倒置培养至长出菌落，随机挑取单个菌落进行发酵，检测发酵产物中WF16616的含量，从中筛选出产量较高的突变株。
2.权利要求1所述的方法， 其特征在于，步骤I)所述白色野生型寄生弯颈霉是ATCC52203。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫外诱变的紫外线处理时间为90s 210s。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的NTG加入到单孢子悬浮液后反应终浓度为lmg/ml。
5.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的NTG加入到单孢子悬浮液后反应时间为20 80min。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述菌落颜色形态变化较大的菌落是紧密型，纯白、棕红或者绿色的突变株菌落。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的平板上NaCl的浓度为3 7g/L，步骤3)所述的菌落直径中等的菌落的菌落直径为3 4mm。
8.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的平板上发酵产物WF16616的浓度为I 5 μ g/mlo
9.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)、4)中，紫外线处理时间为90s 210s。
10.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)-4)中所述单个菌落在摇瓶发酵前先进行抑菌圈实验，即挑取菌落，划线于固体平板上，待其长出菌落后，将菌落连同平板一起取出，然后将其转移到含有白色念珠菌的检测平板上培养直至检测平板呈不透明的白色，选择抑菌圈较大的突变株转接斜面，进一步摇瓶复筛。
全文摘要
本发明公开了一种选育生产WF16616的寄生弯颈霉突变菌株的方法，包括1)将野生型寄生弯颈霉(Tolypocladium parasiticum)单孢子悬浮液紫外诱变，避光涂布平板，挑取高产菌落；2)将步骤1)所得突变株单孢子悬浮液NTG(二硝基胍)诱变，涂布固体平板，从菌落颜色形态变化较大的菌落挑取高产菌落；3)将步骤2)所得突变株的单孢子悬浮液紫外线和NaCl复合筛选，避光涂布含NaCl的平板，从直径中等的菌落中挑取高产菌落；4)将步骤3)所得突变株的单孢子悬浮液紫外线和WF16616复合筛选，避光涂布含WF16616的平板，挑取高产菌落。本发明的方法具有突变和筛选的方向性以及选择的高效性，所得突变株的菌落颜色由野生型的白色变为绿色，发酵产物WF16616产量高，效价高达550-600mg/L，具有工业化价值。
文档编号C12N1/20GK103087937SQ20111034182
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者胡海峰, 王利军, 闫涛玲, 朱宝泉 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院