专利名称：产原花色素微生物的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及生物化学和微生物学领域，特别是涉及检测产原花色素微生物的方法。
背景技术：
原花色素(Proathocyanidins)，也叫原花青素，是类黄酮的一种。原花色素是清除自由基最强的抗氧化剂之一，能保护大脑与神经组织，改善血液循环，灵活关节和年轻皮肤的作用。长期食用高含原花色素的食品，可以缓解心血管等疾病，原花色素还可以作为天然的食品添加剂。随着人类对健康的日益关注，含原花色素的产品消费需求越来越大，因此原花色素具有广泛的应用前景。
目前原花色素的来源主要是从植物中提取的，如松树皮，葡萄籽、桑葚、草莓、茶叶和油菜种皮等是原花色素提取的来源，但这些来源植物生产周期长，大量种植和收集这些植物材料需要大面积的耕地和较高的成本，同时植物来源的原花色素的提取工艺也比较复杂，不利于原花色素的大规模产业化生产。微生物生长快，繁殖周期短，可以很方便的应用于工厂化生产，因此开发能产原花色素的微生物资源是原花色素大规模生产的一个重要方向，但目前未见有简便快速检测产原花色素微生物的报道。
原花色素合成的前体物质和原花色素都是无色的，因此靠肉眼很难发现哪些微生物能产原花色素。我们的研究发现，在酸性条件下原花色素可与香草醛发生缩合反应，产生红色物质，可以利用这种现象很方便地发现产原花色素的微生物，同时香草醛染色法还可以测定原花色素的含量。本发明为产原花色素微生物的寻找和检测提供了一种新的方法。发明内容
本发明的目的在于提供一种直观、经济、简便的寻找产原花色素微生物的方法，同时也可应用于检测微生物中原花色素的含量。本发明方法使用试剂价格低廉，操作简单，效果明显，见效快。
本发明的技术方案在常温下，把待检测的微生物菌体放置在载玻片上，用酸性香草醛(Vanillin)醇类溶液浸泡微生物菌体15-60分钟，若菌体中含有原花色素，则菌会被染上红色，且原花色素含量越高，颜色越红，从而达到快速检测微生物中是否产原花色素的目的。
所述香草醛酸性醇类溶液为香草醛盐酸-乙醇溶液或香草醛盐酸-甲醇溶液。
所述的香草醛盐酸-乙醇溶液中，香草醛的浓度为0. 5-1%，盐酸浓度为5-10%，乙醇浓度为45-50%。
所述的香草醛盐酸-甲醇溶液中，香草醛的浓度0. 5-1%，盐酸浓度为5-10%，甲醇浓度为55-60%。
发明申请人根据微生物的特点和原花色素的化学性质，在本发明中采用酸破坏微生物菌体并提供酸性环境，有利于染色剂进入细胞与原花色素反应，微生物中原花色素含量越高，颜色越红，从而能简便、直观地检测微生物中原花色素的有无和含量的高低。
具体实施方式
实施例1(1)取原花色素标准品(购自南京替斯艾么中药研究所)，分别配制成以下浓度的原花色素溶液0. 5mg/ml、l. Omg/mlU. 5mg/ml、2. Omg/ml，分别取0. 5毫升原花色素溶液置于透明容器中；(2)把0.5克香草醛加入100毫升盐酸-乙醇溶液中，其中盐酸浓度为5%，乙醇浓度为 50%，充分溶解，得香草醛盐酸-乙醇溶液。
(3)分别在装有原花色素溶液的透明容器中加入0. 5毫升上述香草醛盐酸-乙醇溶液，在常温下染色15分钟后观察颜色，所有溶液中都产生红色，且红色的程度随着原花色素浓度的增加依次增加。
实施例2(1)取两种不同类型的大肠杆菌，其中一个为正常的大肠杆菌，文献报道该菌不能合成原花色素，另一个是含有质粒(该质粒上含有花色素合成酶基因和类黄酮3-0-葡萄糖基转移酶基因)的转基因大肠杆菌，文献报道该菌能够产原花色素。
(2)把1克香草醛加入100毫升盐酸-乙醇溶液中，其中盐酸浓度为8%，乙醇浓度为45%，充分溶解，得香草醛盐酸-乙醇溶液。
(3)将上述2种大肠杆菌分别接种到固体LB(Luria-Bertani)培养基的表面，37°C 培养M小时后，取部分菌体于载玻片上，用上述香草醛盐酸-乙醇溶液完全覆盖，常温下染色15分钟后，含有质粒的BL21菌体被染成红色，而正常BL21菌体没有被染上红色。
实施例3(1)取两种不同类型的放线菌，通过HPLC检测发现，其中一个能产原花色素，另一个不能产原花色素。
(2)把0. 8克香草醛加入100毫升盐酸-乙醇溶液中，其中盐酸浓度为10%，乙醇浓度为48%，充分溶解，得香草醛盐酸-乙醇溶液。
(3)将上述2种菌分别接种到放线菌固体培养基上，28°C培养48小时后，取部分菌体于载玻片上，用上述香草醛盐酸-乙醇溶液完全覆盖，常温下染色60分钟后，能产原花色素的放线菌被染成红色，而不产原花色素的放线菌不被染上色。
实施例4把0. 5克香草醛加入100毫升盐酸-甲醇溶液中，其中盐酸浓度为5%，甲醇浓度为55%， 充分溶解，得香草醛盐酸-甲醇溶液；分别在装有原花色素溶液的透明容器中加入0. 5毫升上述香草醛盐酸-甲醇溶液，其它同实施例1。
实施例5把1克香草醛加入100毫升盐酸-甲醇溶液中，其中盐酸浓度为8%，甲醇浓度为60%， 充分溶解，得香草醛盐酸-甲醇溶液；将两种大肠杆菌分别接种到固体LBauria-Bertani) 培养基的表面，37°C培养M小时后，取部分菌体于载玻片上，用上述香草醛盐酸-甲醇溶液完全覆盖。其它同实施例2。
实施例64把0. 8克香草醛加入100毫升盐酸-甲醇溶液中，其中盐酸浓度为10%，甲醇浓度为 58%，充分溶解，得香草醛盐酸-甲醇溶液。将两种菌分别接种到放线菌固体培养基上，28°C 培养48小时后，取部分菌体于载玻片上，用上述香草醛盐酸-甲醇溶液完全覆盖。其它同实施例3。
权利要求
1.一种产原花色素(Proanthocyanidins)微生物的快速检测方法，其特征为在常温下，用香草醛酸性醇类溶液浸泡待检测的微生物菌体15-60分钟，若微生物中含有原花色素则会被染上红色，且原花色素含量越高，颜色越红；若微生物样品中不含原花色素则不被染上红色，从而达到快速检测微生物样品中是否含有原花色素的目的。
2.根据权利要求1所述的微生物中原花色素的快速检测方法，其特征为，所述香草醛酸性醇类溶液为香草醛盐酸-乙醇溶液。
3.根据权利要求1所述的微生物中原花色素的快速检测方法，其特征为，所述香草醛酸性醇类溶液为香草醛盐酸-甲醇溶液。
4.根据权利要求2所述的微生物中原花色素的快速检测方法，其特征为，所述的香草醛盐酸-乙醇溶液中，香草醛的浓度为0. 5-1%，盐酸浓度为5-10%，乙醇浓度为45-50%。
5.根据权利要求3所述的微生物中原花色素的快速检测方法，其特征为，所述的香草醛盐酸-甲醇溶液中，香草醛的浓度0. 5-1%，盐酸浓度为5-10%，甲醇浓度为55-60%。
全文摘要
一种产原花色素微生物的快速检测方法，利用化学染色法，加入能与原花色素反应的染料对微生物进行染色来检测微生物是否产原花色素。香草醛的酸性-醇类溶液可以使含有原花色素的微生物菌体变为红色，原花色素含量越高，颜色越红，而不含原花色素的微生物则不产生红色，利用该方法可以简便快速地筛选和检测微生物是否产原花色素。
文档编号C12Q1/04GK102507558SQ20111034173
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者严明理, 刘丽莉, 张明明, 文桂艳, 李林蔚, 王帅斌, 药圆圆 申请人:湖南科技大学