专利名称：一种西索霉素发酵过程中补入种子液的方法
技术领域：
本发明涉及一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，它是以玉米淀粉、黄豆饼粉等为原材料，在微生物伊尼奥小单孢放线菌的作用下，种子经过三级扩大培养，在已发酵培养20—24小时的发酵罐中补入种子进行再发酵，当发酵培养48小时后，进行一次半料补入，当发酵培养80小时后，进行一次到二次的补水，来制备较高和稳定的西索霉素发酵液。
背景技术：
西索霉素英文名Sisomicin，分子式=C19H37N5O7，分子量447. 53，西索霉素为白色或类白色粉末，无臭，有引湿性。在水中易溶，在乙醇、丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶，西索霉素常以盐酸盐存在。西索霉素(Sisomicin，SIS0)是典型的次级代谢产物合成过程，是一种重要的含有双键的水溶性、多元弱碱性氨基糖苷类抗生素，属庆大霉素-西索霉素型的假三糖庆大霉胺类抗生素，为抗生素JI-20A的脱羟基化衍生物，西索霉素还是合成药物奈替米星 (Netilmicin, NET)和新型化合物氢化西索霉素(即5‘-差向庆大霉素Cla)的生产原料， 中国生产的西索霉素约占世界产量的80%。现有生产西索霉素发酵液的方法是以玉米淀粉、黄豆饼粉等为原材料，在微生物伊尼奥小单孢放线菌的作用下，多采用三级发酵，在发酵过程中进行适时补料生产西索霉素发酵液，利用薄层层析生物显影测定西索霉素效价，西索霉素的生物效价一般在 700-1200ug / ml，西索霉素主组份在70-80%，提取纯化收率只能达到50-60%，发酵周期长144小时左右。现有生产西索霉素发酵液的方法，其不足之处在于
1、西索霉素生产过程中发酵液生物效价较低，高低悬殊较大，生产不稳定，西索霉素的主组份不高，提取纯化收率低；
2、西索霉素生产过程中发酵周期较长，水、电等能源浪费，生产成本高。
发明内容
本发明一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，它是以玉米淀粉、黄豆饼粉等为原材料，在微生物伊尼奥小单孢放线菌的作用下，种子经过三级扩大培养，在已发酵培养 20-24小时的发酵罐中补入种子进行再发酵，当发酵培养48小时后，进行一次半料补入， 当发酵培养80小时后，进行一次到二次的补水，来制备较高和稳定的西索霉素发酵液。其目的在于克服上述的不足之处，提供一种能降低生产成本、又能提高西索霉素效价，利用在已发酵培养20— 24小时的发酵罐中补入种子进行双种再发酵的方法。本发明补入种子(即双种发酵法)进行发酵再培养后生产的西索霉素发酵液，解决了现有技术中存在的西索霉素效价高低不一的难题，提高了西索霉素的效价，效价稳定在 1300-1500ug / ml,西索霉素的主组份由现有技术的70-80%提高到了 80-90%，提取纯化收率由现有技术的50-60%提高到了 60-70%，西索霉素平均效价比现有技术提高了 20%。本发明由于发酵周期缩短了 24小时左右，发酵过程中水、电用量也就相应地得到减少，节约了能源，降低了生产成本。本发明一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，它是以双种子发酵培养，生产较高和稳定的西索霉素发酵液。本发明设计的各培养组成分别为
1、摇瓶种子培养基组成玉米淀粉0.8 1. 2%、黄豆饼粉0. 8 1. 2%、酵母粉0. 08 0. 12%、硫酸镁 0. 03 0. 07%,玉米菜 0. 03 0. 07%、淀粉酶 0. 0008 0. 0012%;
2、一级种子培养基组成玉米淀粉2.8 3. 2%、黄豆饼粉0. 6 1. 0%、玉米浆0. 03 0. 07%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸镁0. 03 0. 07%、碳酸钙0. 3 0. 7%、淀粉酶0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;
3、二级种子培养基组成玉米淀粉5.8 6. 2%、黄豆饼粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸镁0. 03 0. 07%、玉米菜0. 03 0. 07%、碳酸钙0. 3 0. 7%、氯化钴0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;
4、三级种子培养基组成玉米淀粉5.8 6. 2%、黄豆饼粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、玉米菜0. 03 0. 07%、硫酸镁0. 03 0. 07%、碳酸钙0. 3 0. 7%、氯化钴0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;
5、发酵培养基组成玉米淀粉5.8 6. 2%、黄豆饼粉1. 8 2. 2%、玉米浆0. 03 0. 07%、碳酸钙0. 03 0. 07%.、蛋氨酸0. 003 0. 007%.、氯化钴0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;
6、半料培养基组成玉米淀粉2.8 3. 2%、黄豆饼粉0.6 1.0%、玉米浆0.01 0. 05%、碳酸钙0. 01 0. 05%、蛋氨酸0. 001 0. 005%、氯化钴0. 0001 0. 0005%、淀粉酶 0. 00003 0. 00005%、泡敌 0. 008 0. 012%。其发酵生产工艺主要分为以下四步
1、单种子发酵制备将上一级的种子经过培养合格后移入下一级种子罐中培养，最终移入发酵罐中，操作步骤如下
1.1摇瓶种子的制备摇瓶种子培养基经过灭菌冷却后，在无菌条件下，用接种针刮下斜面菌丝体于种子瓶中，置34士 1°C摇床上培养40-48小时后，下摇床备用；
1. 2 一级种子的制备一级种子培养基经过灭菌冷却后，在无菌条件下将摇瓶种子接入一级种子罐中34士 1°C培养24-36小时；
1. 3 二级种子的制备二级种子培养基经过灭菌冷却后，通过已灭菌过的移种管道将一级种子移入二级种子罐中培养，培养温度34士 1°C，培养时间18-24小时；
1.4三级种子的制备三级种子培养基经过灭菌冷却后，通过已灭菌过的移种管道将二级种子移入三级种子罐中培养，培养温度34士 1°C，通气量1 :1 v/v / min,培养时间 18-24小时；
1.5发酵罐培养基的制备发酵培养基经过灭菌冷却后，通过已灭菌过的移种管道将三级种子移入发酵罐中培养，培养温度34士 1°C，通气量1 :1 v/v / min,培养时间100-120 小时；
2、备用种子的制备间隔20-24小时重复制备步骤1中所述工序1.1到1. 4的各级种子的制备，将培养好的备用种子移入步骤1中所述工序1. 5已发酵培养20-24小时的发酵
5罐中再培养80-100小时；
3、半料培养基补入上述步骤1中所述1.5工序中发酵液培养48小时后，将已灭菌冷却后的半料培养基一次或多次性补入，优先选择48—55小时补入；
4、无菌水的补入上述1中所述1.5工序中发酵液培养80小时后，将已灭菌冷却后的无菌水无菌水一次或多次补入，优先选择80小时和88小时补入。与现有单种发酵技术相比，本发明(可以简称为双种发酵法)具有显著的优点
1、由于西索霉素发酵是产物合成和菌体生长非耦联型，产物合成期维持高浓度的菌体量对西索霉素产物的合成有利，采用双种发酵工艺即将备用种子移入已培养20-24小时的发酵罐中再培养，能有效提高菌体量同时对产抗有利；
2、由于西索霉素的菌体长菌期和产抗期都需要消耗大量的碳源和氮源，当发酵在双种子条件下培养48小时后，在显微镜下观察菌丝体粗壮，大部分菌丝体已经进入产抗，可发酵糖浓度下降较大，需要进行一次半料培养基补入来提供菌丝体的碳源和氮源以及菌丝体产抗所必须的氨基酸和微量元素等；
3、由于西索霉素发酵过程中存在明显的产物抑制效应，西索霉素浓度大于0.050g/ L 将明显抑制产物合成，当发酵在双种子条件下培养80小时后，由于淀粉酶酶活力不足，菌丝体已进入衰退期，大量的西索霉素产物吸附在菌丝体上，进行一次到二次的补水有利于降低菌体上西索霉素产物的吸附量，削弱西索霉素产物的抑制效应，来获取较高和稳定的西索霉素发酵液，获得较高的效价和较高的产量。
具体实施例方式为了更好的阐述本发明一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。实施例1
以35立方米发酵罐为例作进一步的说明，具体实施以下步骤 1、12L摇瓶种子的制备
1.1菌种的选择我公司使用的菌种是伊尼奥小单孢放线菌；
1.2摇瓶种子培养基组成玉米淀粉1. 0%、黄豆饼粉1. 0%、酵母粉0. 1%、硫酸镁0. 05%, 玉米浆0. 05%、淀粉酶0. 001%,按以上配方准确称取所需原材料，加水定容至所需体积，分装于3000ml三角瓶中80士2ml/瓶，瓶口塞蘑菇塞，外包牛皮纸。置于压力0. 10-0. IlMPa, 温度120—121°C消毒锅中维持30分钟，冷却待用。在无菌条件下，用接种针刮下斜面菌丝体于种子瓶中，置34士 1 °C，摇床培养40-48小时；
2、120L—级种子的制备一级种子培养基组成玉米淀粉3. 0%、黄豆饼粉0. 8%、玉米浆 0. 05%、酵母粉0. 15%、硫酸镁0. 05%、碳酸钙0. 5%、淀粉酶0. 0001%、泡敌0. 01%。经过灭菌的一级种子培养基冷却到34°C后，将培养好的12L摇瓶种子在无菌条件下接入一级种子罐中培养。一级种子培养条件温度34士 1°C，PH6. 8-7.0，通气量1 :1 v/v / min,培养时间 30-36小时；
3.800L 二级种子的制备二级种子培养基组成玉米淀粉6. 0%、黄豆饼粉1. 4%、酵母粉0. 15%、硫酸镁0. 05%、玉米浆0. 05%、碳酸钙0. 5%、氯化钴0. 0005%、淀粉酶0. 0001%、泡敌 0. 01%。经过镜检及无菌检查合格的一级种子罐的种子，经过已灭菌过的移种管道移入已灭菌的二级种子罐中培养。二级种子培养条件培养温度34 士 1°C，PH6. 8-7.0，通气量1 :1 ν/ ν / min,培养时间18-24小时；
4.4000L三级种子的制备三级种子培养基组成玉米淀粉6. 0%、黄豆饼粉1. 4%、酵母粉0. 15%、玉米浆0. 05%、硫酸镁0. 05%、碳酸钙0. 5%、氯化钴0. 0005%、淀粉酶0. 0001%、泡敌 0. 01%。经过镜检及无菌检查合格的二级种子罐的种子，经过已灭菌过的移种管道移入已灭菌的三级种子罐中培养。三级种子培养条件培养温度34士 l°C，PH7.0-7. 1，通气量1 :1 ν/ ν / min,培养时间18-24小时；
5、16000L发酵培养基的制备发酵培养基组成玉米淀粉6. 0%、黄豆饼粉2. 0%、玉米浆 0. 05%、碳酸钙0. 05%.、蛋氨酸0. 005%.、氯化钴0. 0005%、淀粉酶0. 0001%、泡敌0. 01%。经过镜检及无菌检查合格的三级种子移入经灭菌的并冷却到34°C的发酵培养基中培养。培养条件温度34士 1°C，通气量1 1 v/v / min,培养时间100-120小时；
6.4000L备用种子液间隔20-24小时重复上述1_4的工序中进行各级种子的制备，经过镜检及无菌检查合格的4000L备用种子移入上述5工序中已培养20-24小时的发酵罐中再培养80-100小时；
7、4000L半料培养基制备半料培养基组成玉米淀粉3.0%、黄豆饼粉0. 8%、玉米浆 0. 03%、碳酸钙0. 03%、蛋氨酸0. 003%、氯化钴0. 0003%、淀粉酶0. 00005%、泡敌0. 01%。经过灭菌、冷却到34°C后，补入上述5工序中已培养48小时的发酵罐中；
8、3000L无菌水制备3000L自来水经过灭菌、冷却到34°C后，分两次补入上述5工序中已培养80小时和88小时的发酵罐中。发酵罐通过冷却水进行冷却，维持培养基的温度为34°C，发酵培养100-120小时发酵结束。综上所述35立方米发酵罐放罐效价为1500ug / ml，下罐体积为28. 585m3，所得西索霉素理论总亿(十亿)=1500X28. 585/1000=42. 877。实施例2
以35立方米发酵罐为例，其操作步骤与实施例1相同，其不同之处在于步骤5中发酵培养基的制备体积为15000L，最终效价为1550ug / ml，下罐体积为28m3，所得西索霉素理论总亿(十亿)=1550X28/1000=43. 4。
权利要求
1. 一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，它是以双种子发酵培养，生产较高和稳定的西索霉素发酵液，其特征在于包括如下步骤.1、单种子发酵制备将上一级的种子经过培养合格后移入下一级种子罐中培养，最终移入发酵罐中，工序如下.1.1摇瓶种子的制备摇瓶种子培养基经过灭菌冷却后，在无菌条件下，用接种针刮下斜面菌丝体于种子瓶中，置34士 1°C摇床上培养40-48小时后，下摇床备用；.1. 2 一级种子的制备一级种子培养基经过灭菌冷却后，在无菌条件下将摇瓶种子接入一级种子罐中34士 1°C培养24-36小时；.1. 3 二级种子的制备二级种子培养基经过灭菌冷却后，通过已灭菌过的移种管道将一级种子移入二级种子罐中培养，培养温度34士 1°C，培养时间18-24小时；.1.4三级种子的制备三级种子培养基经过灭菌冷却后，通过已灭菌过的移种管道将二级种子移入三级种子罐中培养，培养温度34士 1°C，通气量1 :1 v/v / min,培养时间 18-24小时；.1、5发酵罐培养基的制备发酵培养基经过灭菌冷却后，通过已灭菌过的移种管道将三级种子移入发酵罐中培养，培养温度34士 1°C，通气量1 :1 v/v / min,培养时间100-120 小时；.2、备用种子的制备间隔20-24小时重复制备步骤1中所述1.1到1. 4的各级种子的制备，将培养好的备用种子移入步骤1中所述工序1. 5已发酵培养20-24小时的发酵罐中再培养80-100小时；.3、半料培养基补入上述步骤1中所述1.5中发酵液培养48小时后，补入半料培养；.4、无菌水的补入上述1中所述1.5中发酵液培养80小时后，补入无菌水。
2.根据权利要求1所述的一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，其特征在于半料培养基补入优先选择48—55小时，将已灭菌冷却后的半料培养基一次或多次性补入。
3.根据权利要求1所述的一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，其特征在于无菌水的补入优先选择81小时和88小时，将已灭菌冷却后的无菌水一次或多次补入。
4.根据权利要求1所述的一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，其特征在于各级培养基的组分如下.1、摇瓶种子培养基组成玉米淀粉0.8 1. 2%、黄豆饼粉0. 8 1. 2%、酵母粉0. 08 0. 12%、硫酸镁 0. 03 0. 07%,玉米菜 0. 03 0. 07%、淀粉酶 0. 0008 0. 0012%;.2、一级种子培养基组成玉米淀粉2.8 3. 2%、黄豆饼粉0. 6 1. 0%、玉米浆0. 03 0. 07%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸镁0. 03 0. 07%、碳酸钙0. 3 0. 7%、淀粉酶0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;.3、二级种子培养基组成玉米淀粉5.8 6. 2%、黄豆饼粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、硫酸镁0. 03 0. 07%、玉米菜0. 03 0. 07%、碳酸钙0. 3 0. 7%、氯化钴0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;.4、三级种子培养基组成玉米淀粉5.8 6. 2%、黄豆饼粉1. 2 1. 6%、酵母粉0. 13 0. 17%、玉米菜0. 03 0. 07%、硫酸镁0. 03 0. 07%、碳酸钙0. 3 0. 7%、氯化钴0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;.5、发酵培养基组成玉米淀粉5.8 6. 2%、黄豆饼粉1. 8 2. 2%、玉米浆0. 03 .0. 07%、碳酸钙0. 03 0. 07%.、蛋氨酸0. 003 0. 007%.、氯化钴0. 0003 0. 0007%、淀粉酶 0. 00008 0. 00012%、泡敌 0. 008 0. 012%;.6、半料培养基组成玉米淀粉2. 8 3. 2%、黄豆饼粉0.6 1.0%、玉米浆0.01 0. 05%、碳酸钙0. 01 0. 05%、蛋氨酸0. 001 0. 005%、氯化钴0. 0001 0. 0005%、淀粉酶 0. 00003 0. 00005%、泡敌 0. 008 0. 012%。
全文摘要
本发明涉及一种西索霉素发酵过程中补入种子的方法，它是以玉米淀粉、黄豆饼粉等为原材料，在微生物伊尼奥小单孢放线菌的作用下，种子经过三级扩大培养，在已发酵培养20-24小时的发酵罐中补入种子进行再发酵，当发酵培养48小时后，进行一次半料补入，当发酵培养80小时后，进行一次到多次的补水，来制备较高和稳定的西索霉素发酵液。本发明使发酵周期缩短了24小时左右，发酵过程中水、电用量也就相应地得到减少，节约了能源，降低了生产成本，有利于工业化大生产。
文档编号C12R1/29GK102505032SQ20111034163
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者胡建明, 薛建建, 陈振河, 陈雄 申请人:福建省建阳武夷味精有限公司