一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法

专利名称：一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法
技术领域：
本发明属于作物抗病性鉴定技术领域，具体涉及一种烟草青枯病抗性的苗 期鉴定方法。
背景技术：
烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(i "/Wow'"so/a"ace"n/m，简称青枯菌)引起 的一种主要从根部侵入的土传病害，在我国南方烟区普遍发生，对烟草生产具 有很大威胁。选育与种植抗病品种是控制青枯病发生与流行的经济有效防治措 施。但在抗病育种相关研究中，需要准确快速评价大量材料的抗性表现。现有 的烟草青枯病抗性鉴定方法主要有以下两种l)大田病圃人工接种方法。该方法 可以较好地反应品种的抗性。但是该方法存在以下缺点鉴定周期长，每年只 能鉴定一次；所需病圃面积大，用于鉴定的烟草材料数量少；青枯菌菌悬液需 要数量大；发病不均匀。而且还存在供试材料的抗性表现年份间和地点间差异 较大等问题。2)苗期盆栽人工接种方法。该方法有利于解决病圃面积不够的问 题。青枯病苗期接种方法主要有伤根灌注法、浸根法、毛细管刺茎渗透法、剪 叶接种法及离体水培法等。其中伤根灌注法接种能引起严重的侵染，接种效果 相对稳定，与病区自然发病鉴定结果之间的相关性高，剪叶接种法和离体水培 法与病害自然侵染过程的差异大，毛细管刺茎渗透法和剪叶接种法的接种效果 不稳定，且与品种在病区的抗性表现的相关性偏低。伤根灌注法接种实验中， 土壤温度和接种菌浓度显著影响烟苗的发病程度。苗期土壤盆栽抗性鉴定，在 无控温设备的塑料拱棚温室中，当实验期间气温偏低时，经常出现发病缓慢、 发病不严重等问题。苗期水培抗性鉴定在茄子、番茄抗青枯病研究中得到成功 应用，在中国发明专利"鉴定植物抗青枯病能力的水培接菌法"，(专利号ZL 00117404.5)中有介绍。我国烟草行业普遍采用漂浮育苗，因此，在漂浮育苗基 础上，建立烟草青枯病抗性的漂浮池水培接种鉴定方法，对抗病种质资源筛选、 抗性遗传特性研究和抗病育种具有重要意义。

发明内容
本发明的目的在于提供一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法，以弥补现有 技术的不足。该方法用漂浮池恒温水培接种鉴定结果代替传统的士壤盆栽和大 田鉴定结果，消除环境温度和湿度对鉴定结果的影响，避免其他病害对鉴定结果的干扰。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现-1)建造保温循环漂浮池
在玻璃温室或塑料大棚温室内建造，在常规漂浮池的池底垫一层厚约4cm 的泡沫塑料板，铺2层塑料膜，整个池壁四周用泡沫塑料板保温。苗池一端设 控温电加热棒(中山超信电器厂产品)和池水循环泵(广东海利集团有限公司 产品)。控温电加热棒和池水循环泵构成的加加控温设备通过控温装置联动。 池水采用深井水或自来水。水深5cm 20cm。根据青枯病适宜发病温度和云南 病区土温设置水温为25.(TC 28.0。C。
2) 烟苗移植及日常管理
烟苗两次剪叶后，株高9cm llcm，苗龄45d 55d，每个待鉴定材料挑选 15 200株，移植到新的漂浮盘中。以NC95品种为抗病对照，以Hicks品种为 感病对照。漂浮池营养液的氮素浓度控制在100mg/kg 250mg/kg。为排除黑胫 病的影响，在水中施入58%甲霜灵锰锌。根据池水蒸发量，经常补充池水至初 始水深。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每小时记录一次水》显。
3) 接种体制备及接种
将保存的青枯菌菌株使用前在TTC培养基上活化48h，挑典型单菌落至TTC 平板培养基上，28。C培养48h。将菌苔刮下，接种到1/10BG培养液，28。C震荡 培养36h至48h。培养液于5000xg离心15 min收集菌体，用井水或过夜自来 水配成菌悬液。接种时在漂浮池中加入青枯菌悬液，根据菌悬液OD6。o值，调整 池水中菌浓度至1 X 107cfli/mL l X 108cfu/ mL。
4)病情调査与分级
接种后10d调査发病情况，以后每隔2 3d调査一次发病情况。记录发病率 及病情指数。以感病对照发病率达到80 %左右的病情指数作为品种抗性评价 标准。
本发明与现有技术相比具有如下的优点和有益效果1)在塑料拱棚温室中 均匀提高土壤温度难度大，恒温温室造价高。本发明通过在普通漂浮池基础上， 增加简单的保温材料、加热控温设备和水循环泵，以低成本成功解决了温度问
题。2)采用市售的肥料和自来水配制营养液，与MS营养液和无菌水相比，成 本大幅度降低。3)漂浮池恒温水培鉴定可在一个月之内完成，使得提高烟苗密 度、减少水培面积可行，从而大幅度减少接种菌的数量；4)在整个鉴定过程中、
4池水中青枯菌浓度和温度均匀一致，保证了重复间发病的均匀性。5)病原菌从 根部侵入，接近病害田间自然侵染过程，保证了抗性鉴定结果的可靠性。6)通 过调整水温和池水接种青枯菌数量，可灵活控制烟苗发病的速度，满足不同实 验需要。
漂浮池恒温水培鉴定方法的实用性在于实现了用苗期鉴定结果代替传统 大田鉴定结果，在较小面积上鉴定大量材料、 一年多次鉴定。提高了结果的可 靠性、縮短了鉴定周期、节省场地和试验成本，从接种到调查结束可在一个月 内完成；占地面积小，在几十平方米的面积上一次可同时鉴定上千株烟苗；具 有发病迅速、结果重复性好、结果可靠高等特点。能有效排除土壤温度差异、 菌株致病力差异、菌量差异和其他病害对抗性结果的千扰，有利于年度间和不 同实验室间结果重现和比较；抗感品种的发病率和病情指数差异明显，品种的 抗性评价结果与他人多年的抗性评价结果基本一致。该方法在抗病资源和育种 中间材料的抗性鉴定、抗性遗传规律研究中应用潜力较大。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但实施例不是对本发明的 限定。 实施例1
一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法，在玻璃温室或塑料大棚温室内建造 保温加热漂浮池。池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺2层塑料膜，整个池 壁四周用泡沫塑料板保温。苗池一端设控温电加热棒(中山超信电器厂产品) 和池水循环泵(广东海利集团有限公司产品)。控温电加热棒和池水循环泵通 过控温装置联动。池水为深井水或自来水。水深10cm。根据青枯病适宜发病温 度和云南病区土温设置水温为26.5。C。烟苗两次剪叶后，株高10cm，苗龄50d， 每个待鉴定材料挑选45株，用漂浮盘移植到新建的漂浮池中。以NC95品种为 抗病对照，以Hicks品种为感病对照。漂浮池营养液的氮素浓度控制在150 mg/kg。为排除黑胫病的影响，在水中施入58%甲霜灵锰锌。根据池水蒸发量， 经常补充池水至初始水深。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每 小时记录一次水温。将保存的青枯菌菌株使用前在TTC培养基上活化48h，挑 典型单菌落至TTC平板培养基上，28。C培养48h。将菌苔刮下，接种到1/10 BG 培养液，28。C震荡培养48h。培养液于5000xg离心15min收集菌体，用井水或 过夜自来水配成菌悬液。接种时在漂浮池中加入青枯菌悬液，根据菌悬液OD,值，调整池水中菌浓度至lX108cfii/mL。接种后10d调查发病情况，以后每隔 2 3d调査一次发病情况。记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到80 %左右的病情指数作为品种抗性评价标准。 实施例2
重复实施例1，有以下不同点池水水深5cm，温度设置为25°C。烟苗两 次剪叶后，株高9cm，苗龄45d，每个待鉴定材料挑选25株。漂浮池营养液的 氮素浓度控制在100mg/kg。菌苔刮下，接种到1/10BG培养液，2『C震荡培养 36h。
重复实施例l，有以下不同点池水水深20cm，温度设置为28。C。烟苗两 次剪叶后，株高llcm，苗龄55d，每个待鉴定材料挑选200株。漂浮池营养液 的氮素浓度控制在250 mg/kg。
下面为青枯病苗期恒温水培鉴定与苗期盆栽鉴定、大田自然发病鉴定结果 的相关性分析 实施例4 1材料与方法 1.1供试材料
供试烟草材料岩烟97、 EnshuFC、 Oxford 207、 K326和红花大金元，为国 内外报道的抗、感青枯病资源。以NC95为抗病对照，Hicks为感病对照。青枯 菌强致病力菌株Y45，分离自云南省文山州麻栗坡县麻栗镇。菌种保存在无菌 水中，使用时在TTC培养基上活化48h，挑典型单菌落至TTC平板培养基上， 28'C培养48 h。将菌苔刮下，接种到1/10 BG培养液，28。C震荡培养36 h至48 h。 培养液于5000xg离心15 min收集菌体，用井水或过夜自来水配成浓度为 108cfii/mL (OD纖K).2)的菌悬液，用于接种。 1.2室内苗期抗性鉴定 1.2.1漂浮池恒温水培接种鉴定
池水保温循环漂浮池建造方法池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺2层池 膜，整个池壁四周用泡沫塑料板保温。苗池一端设控温电加热棒(中山超信电 器厂产品)和池水循环泵(广东海利集团有限公司产品)。电加热棒和池水循 环泵通过控温装置联动。根据青枯病适宜发病温度和云南病区土温设置水温为 26.5°C。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司产品)每小时记录一次水温。
6烟苗两次剪叶后(苗龄50d)，每个材料挑选45株，移植到新的漂浮盘中。在漂 浮池中加入青枯菌悬液，根据菌悬液OD6(K)值，调整池水中菌浓度至l()Scfli/mL。 施入育苗专用肥料(N-P205-K20含量为20-10-20)，控制氮素浓度为150mg/kg。 为排除黑胫病的影响，在水中施入58%甲霜灵锰锌。根据池水蒸发量，经常补充 池水至初始水深。接种后10d调査发病情况，以后每隔2 3 d调査一次发病情况。 记录发病率及病情指数。以感病对照发病率达到80 %左右的调査结果作为品种 抗性评价标准。 1.2.2 土壤盆栽伤根接种鉴定
在塑料拱棚温室内进行。盆栽苗龄55d烟苗，每个材料选30株。采用直径 12cm的一次性黑色塑料花盆，每盆装红壤土约500g。为排除黑胫病的影响，在 土中拌入58%甲霜灵锰锌。移栽成活后，在烟株两侧将刀插入土中伤根，每株 在伤根处浇灌1x108 cfb/mL菌悬液30 ml。通过温室通风帘控制室内白天温度 不超过35°C、傍晚关闭通风帘保温。采用自动温湿度记录仪(杭州哈泰克公司 产品)每小时记录一次气温。接种后每周观察一次发病情况，在感病对照发病 率达到20%左右详细调査病情，以感病对照发病率达到80%左右的调査结果作 为品种抗性评价标准。 1.3病田自然发病鉴定
选择连作有发病史的烟田进行。田间设计顺序排列，4次重复。依次种植 不同品种，每个小区种植40 50株。行株距为1.2mx0.50 m。为了减少黑胫病 对青枯病的干扰，移栽前烟苗用58%甲霜灵锰锌500倍液浸根，并在移栽后10d， 30d， 50d分别用58%甲霜灵锰锌500倍液100毫升灌根。其它田间栽培管理按 当地优质烟生产技术进行。采烤后剖茎调查青枯病的发病情况。 1.4病情调查与抗性评价
病害严重度分级标准参考CORESTA方法0级全株无病；l级茎部褪绿 条斑不超过三分之一株高，或只有一片叶变黄或枯萎；2级多于2片叶变黄或 枯萎且健叶多于3片，或茎部褪绿条斑在三分之一至二分之一株高处；3级健 叶1 3片，或茎部褪绿条斑在二分之一至三分之二株高处；4级植株基本枯死， 茎部褪绿条斑超过三分之二株高，无健叶(指可烤叶)。将病情指数换算为相对 病情指数。相对病情指数-品种病指x校正系数K值，K-感病对照规定病指95.0/ 感病对照实际病指。
抗性评价标准高抗(HR):相对病情指数0 20;抗病(R):相对病情指数21 40;中抗(MR):相对病情指数41 60;中感(MS):相对病情指数61 80;感病 (S):相对病情指数81 90;高感(HS):相对病情指数91 100。 2.结果与分析
2.1苗期恒温水培接种青枯病抗性鉴定方法发病情况
在塑料拱棚温室内，在苗期漂浮池恒温水培接种试验中，感病对照Hicks接 种后第lld开始零星发病，随后发病迅速，且无其他病害干扰。接种后第21d和 第26d感病对照Hicks病指分别达到50.26和71.7。接种后第21d和第26 d抗病对照 NC95病指分别为12.0和15.28。不同抗性品种的病情指数差异明显，见表l。 Oxford207、岩烟97、 Enshu FC、 K326 (低抗 中抗)、红花大金元(高感)的 病情指数分别为12.29、 15.28、 17.00、 51.07、 85.42，病情指数与品种本身抗性 相吻合(表l)。池水温度稳定在26。C以上，保证了青枯病发病迅速、发病。试 验期间未见其他病害的干扰。在塑料拱棚温室(无加热控温设备)内，土壤盆 栽实验期间温室白天(8: 00 20: 00)日平均气温26.7。C、夜晚(21: 00 次 日7: 00)日平均气温19.(TC， 土壤温度和夜晚气温温度与青枯病发病适宜温度 相比偏低。导致接种青枯菌菌液后，烟株青枯病发病缓慢。接种后2个月内，烟 株无明显症状，接种后5个月调査感病对照Hicks病指为68.33。由于烟株密度大， 后期受白粉病的干扰。病田自然发病抗性鉴定实验中，烟株在7月底开始表现症 状，8月下旬到达发病高峰。鉴定材料田间还少量发生黑胫病和空茎病，对青枯 病的调査产生干扰。
表1青枯病抗性的苗期水培接种鉴定结果
调査接种后不同天数的病情指数抗性 分级
种质名称株数lid13d15d17d19d21d24d26d26d相 对病指Oxford 2071200. 000. 000. 000. 550.831. 106,9012. 2916. 28服
岩烟97360. 922, 762, 764. 607. 369. 2014. 7215. 2820. 24R
Enshu FC1250. 000. 001, 322. 123. 183, 977. 9517. 0022. 52R
NC95460. 000. 922. 769. 2011. 9611.9611.9615.2820. 24R
K3261171. 703. 116. 239. 6214, 4425. 4848. 9751. 0767. 65MS
Hicks1141. 451. 748. 7220. 0531. 6750. 2668. 5671. 7195. 00HS
红花大金 元360.000.001.8410. 1227. 6041.4070. 8485. 42100.00HS
第26d以Hicks为感病对照计算相对病指，K=95.0/71.71 = 1.32 2.2恒温水培接种、土壤盆栽接种与病田自然发病的抗性结果比较
在苗期漂浮池恒温水培抗性鉴定中，已知抗青枯病的岩烟97、 Enshu FC、 Oxford207和NC95表现为高抗，低抗至中抗的K326表现为中抗，感病对照Hicks表现为感病，高感的红花大金元表现为高感。在苗期土壤盆栽伤根接种抗性鉴
定中，已知抗青枯病的岩烟97、 EnshuFC、 Oxford 207和NC95表现为抗至高抗， 感病对照Hicks表现为感病，高感的红花大金元表现为高感。苗期漂浮池恒温水 培接种法与苗期土壤盆栽伤根接种法得到的供试品种的病情指数表现为正相 关，相关系数为0.959。病田自然发病抗性鉴定中，已知抗青枯病的岩烟97、Oxford 207和NC95表现为抗病，感病对照Hicks表现为高感，高感的红花大金元表现为 高感。苗期漂浮池恒温水培接种法与病田自然发病法得到的供试品种的病情指 数表现为正相关，相关系数为0.828。漂浮池恒温水培接种、土壤盆栽伤根接种 和病田自然发病鉴定的结果与品种本身抗性基本吻合(表2) 。 NC95在文山州西 畴县的自然发病病圃中，田间抗性表现为中感。这可能与病田青枯菌菌系多样、 受大田黑胫病和空茎病复合侵染有关，见表2。
表2恒温水培接种、土壤盆栽接种与病田自然发病的抗性结果
~" "~" 恒温水培接种 土壤盆栽接种 病田自然发病 —
品种品种特性相对病情指 …相对"iw^ 「e ~~;tt"黑胫病
注ND:表示未测定。以红花大金元为对照计算相对病指。
岩97 Enshu FC Oxford207
K326
红花大金元) NC95
Hicks K值
17.0HR4.1HR29.8R0
18.9HR28.9RNDND0
13.7HR31.0R23.0R0
56.8MRNDND45.7MR2.C
95.0HS95.0HS95.0HS2.;
17.0HR26.9R65.9MS13.i
80.1S84.7S118.9HS2.1
1.12 1.24 1.23
抗辆(R)
抗病(R)
抗病(R)
低抗至中 抗
S)
照
照、
w ￡对s-对w
』感病rc-病rc.
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9
权利要求
1、一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法，步骤如下1)建造保温加热循环漂浮池在玻璃温室或塑料大棚温室内建造，池底垫一层厚约4cm的泡沫塑料板，铺2层塑料膜，整个池壁四周用泡沫塑料板保温，池内水深5cm～20cm，一端设控温电加热棒和池水循环泵构成的加热控温设备加热池水，保持水温为25.0℃～28.0℃；2)烟苗移植及日常管理烟苗两次剪叶后，株高9cm～11cm，苗龄45d～55d，每个待鉴定材料挑选15～200株，移植到漂浮池中，以NC95品种为抗病对照，以Hicks品种为感病对照，漂浮池营养液的氮素浓度控制在100mg/kg～250mg/kg，在水中加58％甲霜灵锰锌，根据池水蒸发量，经常补充池水至初始水深，采用自动温湿度记录仪每小时记录一次水温；3)接种体制备及接种将保存的青枯菌菌株使用前在TTC培养基上活化48h，挑典型单菌落至TTC平板培养基上，28℃培养48h，将菌苔刮下，接种到1/10BG培养液，28℃震荡培养36～48h，培养液于5000×g离心15min收集菌体，用井水或过夜自来水配成菌悬液即可接种，接种时在漂浮池中加入青枯菌悬液，根据菌悬液OD600值，调整池水中菌浓度至1×107cfu/mL～1×108cfu/mL；4)病情调查与分级接种后10d调查发病情况，以后每隔2d～3d调查一次发病情况，记录发病率及病情指数，以感病对照发病率达到80％左右的病情指数作为品种抗性评价标准。
2、 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于步骤l)所述的保温循环漂浮池为常规漂浮池增加泡沫塑料板保温层和金鱼缸用加热控温设备，池 水为深井水或自来水。
3、 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于步骤2)所述的漂浮池营养液为市售的烟草漂浮育苗专用肥料配制。
全文摘要
一种烟草青枯病抗性的苗期鉴定方法，包括保温水池建造、池水加热与循环、青枯菌接种、烟苗、病情调查与分级等步骤，本方法用苗期鉴定结果代替传统大田鉴定结果，在较小面积上鉴定大量材料、一年多次鉴定，提高了结果的可靠性、缩短了鉴定周期、节省场地和试验成本，占地面积小；具有发病迅速、结果重复性好等特点；能有效排除土壤温度差异、菌株致病力差异、菌量差异和其他病害对抗性结果的干扰，有利于年度间和不同实验室间结果重现和比较；抗感品种的发病率和病情指数差异明显，品种的抗性评价结果与他人多年的抗性评价结果基本一致；该方法在抗病资源和育种中间材料的抗性鉴定、抗性遗传规律研究中应用潜力较大。
文档编号A01G31/02GK101496481SQ20091009417
公开日2009年8月5日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者勇 刘, 卢秀萍, 徐照丽, 李文正, 李梅云, 李永平, 文 许, 陈学军 申请人:云南省烟草科学研究所