暗褐网柄牛肝菌菌种的培养方法

专利名称：暗褐网柄牛肝菌菌种的培养方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是暗褐网柄牛肝菌菌种的培养方法。
背景技术：
暗褐网柄牛肝菌(Phleb叩usportentosus)是一种味道鲜美，营养价值丰富，深受产地 消费者喜爱的美味食用菌，目前仍不能人工栽培，市场上销售的暗褐网柄牛肝菌子实体均 采自野生自然生长。
多数牛肝菌为菌根食用菌，目前菌根食用菌栽培研究多为半人工模拟栽培及菌塘人工 促繁。半人工模拟栽培需要将人工分离的纯培养菌种或天然菌种接种在相应树苗的根部进 行"菌根化"，再栽培"菌根化"的苗木培养子实体生长。分布于土壤中的暗褐网柄牛肝 菌的菌丝体、菌索、子实体、孢子等天然菌种，因受季节条件的限制，不可能常年找到， 不方便于应用，且易带其他杂菌，接种效果不稳定。人工纯培养的菌种，不受环境、季节 与气候条件的影响、限制，工艺易于放大，重复性、安全性好，短时间内可获得大量的纯 菌种，是规模扩大生产的基本方法。纯培养固体菌种，便于运输，贮存，用于半人工模拟 栽培的接种效果较液体菌种及天然菌种稳定，是接种用的首选菌种。
产自于云南的暗褐网柄牛肝菌味道鲜美，营养价值丰富，有较好的食用及药用价值， 是一种较好的保建食品。由于受气候季节条件的限制产量有限，需通过半人工模拟栽培增 加产量满足人们需求。因此，迫切需要提供一种有效的从母种、液体菌种至固体菌种的菌 种培养方法。

发明内容
本发明的目的是提供暗褐网柄牛肝菌菌种培养从母种、液体菌种至固体菌种的快速培 养方法。
本发明的技术方案为暗褐网柄牛肝菌菌种的培养方法按以下步骤进行 a、用母种培养基培养暗褐网柄牛肝菌子实体组织块制备母种，母种培养基的制备由下 述原料及方法配制而成
马铃薯 150.0 200.0g 葡萄糖 15.0 20.0g酵母膏 L0 2力g MgS04 1.0 2.0g
KH2P04 1.0 2.0g 琼脂 15.0 20.0g 水 1000ml
配制方法
al)将新鲜马铃薯洗净、去皮、称量、切成薄片放入大烧杯中，加入定量的水，煮沸 20分钟过滤取滤液，加入葡萄糖、琼脂、酵母膏、MgS04、 KH2P04，煮沸至琼脂完全溶 化，pH值4.0 6.0，得母种培养基；将培养基分装于三角瓶中，12(TC灭菌30分钟，待 冷却后倒入培养皿中即可使用；
a2)用解剖刀分离暗褐网柄牛肝菌野生子实体组织块，置于有母种培养基的培养皿中 培养菌丝体生长并扩繁；
a3)采集野生的暗褐网柄牛肝菌子实体，用清水冲洗净、凉干，用75%酒精溶液消毒 子实体表面，将子实体一掰为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交界的中间部位2-3mm的菌肉组 织块放于倒有母种培养基的培养皿中，置于28'C的培养箱中培养30天，菌丝体长满培养 皿，得母种；
b、用液体培养基培养液体菌种，液体培养基的原料组成如下
马铃薯 150.0 200.0g
蔗糖 15.0 20.0g
酵母膏 1.0 2.0 g
MsS04 1.0 2.0g
KH2P04 1.0 2.0g
水 1000ml
配制方法
bl)将新鲜马铃薯洗净、去皮、称量，切成薄片放入大烧杯中，加入定量的水，煮沸
20分钟过滤取滤液，在滤液中加入蔗糖、酵母膏、MgS04、 KH2P04，混匀，pH值4.0 6.0， 得液体培养基；将配制好的液体培养基分装于三角瓶中，每瓶300ml， 12(TC灭菌30分钟， 待冷却后备用；
b2)将在上述步骤a3)中获得的母种转管活化后，将菌丝体连同培养基切成2mm 4
5mm的碎菌块接种于歩骤bl中瓶装的培养基中，在28'C， 125r/min回旋式摇床中振荡培养， 培养8天得到液体菌种；
C、用固体培养基培养固体菌种，固体培养基的原料组成如下
锯木屑 10. 0 kg
谷粒 4. 0 6.0 kg
MgS0j 10. C) 20.0g
KH2P(^ 10.0 20.0g 配制方法-
cl)将谷粒称量放入桶中，加水浸泡10 12小时，滤除多余水份备用，将MgSCU 、 KH2P04溶解于适量的水中喷洒入锯木屑料堆中，再加入浸泡滤水后的谷粒，拌料混合均 匀，最后调培养料含水量至60.0%, pH4.0 6.0，得固体培养基；将配制好的固体培养基 分装于广瓶中或菌种袋中，每瓶或每袋700ml， 12(TC灭菌60分钟，待冷却后备用；
c2)将在上述步骤b2)中获得的液体菌种接种于步骤cl)中瓶装或袋装的培养基中， 置于28'C培养室中培养40 50天，菌丝体长满培养瓶或培养袋，得固体菌种。
本发明的暗褐网柄牛肝菌从母种、液体菌种至固体菌种的培养方法，为牛肝菌类菌种 培养方法的首创，其优点是①培养基营养成份简单，培养基配方中只用了简单的碳氮源 (马铃薯、葡萄糖、蔗糖、谷粒、酵母膏)， 一般的无机盐(MgS04、 KH2P04 )及橡胶 木或其他杂木的锯木屑即可进行从母种至固体菌种的培养；②培养方法简便，用培养皿、 三角瓶、摇床、菌种瓶(袋)和一般培养室(可加温)即可进行从母种至固体菌种的培养； ③菌丝、菌球生长速度快，28X:温度条件下，培养30天母种即可长满10cm的培养皿。培 养8天液体种的菌丝球均匀分布悬浮于三角瓶的液体培养基中，且生长均匀，大小一致， 色泽金黄。培养50天固体菌种的菌丝体长满700 ml瓶装或袋装的固体培养基质。
具体实施例方式
实施例1
a、用母种培养基培养暗褐网柄牛肝菌子实体组织块制备母种，母种培养基的制备由下
述原料及方法配制而成
原料马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，酵母膏2.0g， MgSO41.0g， KH2P04 l.Og，琼脂 15.0g，水1000ml
制备方法
6al)将新鲜马铃薯洗净，去皮，称量，然后切成薄片，放入大烧杯中，加入定量的水, 煮沸20分钟过滤取滤液，加入葡萄糖、琼脂、酵母膏、MgS04、 KH2P04，煮沸至琼脂完 全溶化，pH值约6.0，得母种培养基；将培养基分装于三角瓶中，12(TC灭菌30分钟，
待冷却后在超净工作台中倒入培养皿中即可使用；
a2)在超净工作台中无菌操作，用解剖刀分离暗褐网柄牛肝菌野生子实体组织块，置 于有母种培养基的培养皿中培养菌丝体生长并扩繁；
a3)采集野生的暗褐网柄牛肝菌子实体，去掉子实体表面的泥沙，先用清水冲洗净、 凉干，用75%酒精溶液消毒子实体表面，在超净工作台中，将子实体一掰为二，用解剖刀 取菌柄与菌盖交界的中间部位2-3ram的菌肉组织块放于倒有母种培养基的培养皿中，置于 28'C的培养箱中培养30天，菌丝体长满培养皿，得母种。
b、用液体培养基发酵培养液体菌种，液体培养基的原料组成如下马铃薯200.0g， 蔗糖20.0g，酵母膏2.0 g， MgSO41.0g， KH2PO41.0g，琼脂15.0g，水1000ml
制备方法
bl)将新鲜马铃薯洗净，去皮，称量，然后切成薄片，放入大烧杯中，加入定量的水，
煮沸20分钟过滤取滤液，在滤液加入蔗糖、酵母膏、MgS04、 KH2P04，混匀，pH值约 6.0，得液体培养基；将配制好的液体培养基分装于三角瓶中，每瓶300ml， 120。C灭菌30 分钟，待冷却后备用；
b2)将在上述歩骤a3中获得的母种转管活化后，将菌丝体连同培养基切成2iM 4咖 的碎菌块接种于步骤bl中瓶装的培养基中，在28i:， 125r/min回旋式摇床中振荡培养， 培养8天得到液体菌种。
C、用固体培养基培养固体菌种，固体培养基的原料组成如下
橡胶木锯木屑10. 0 kg，谷粒6. 0 kg， MgSO420.0 g， KH2P04 20.0g。
cl )将谷粒称量，放入桶中，加水浸泡10 12小时后滤除多余水份，将MgS04 、KH2P04 溶解于适量的水中喷洒入锯木屑料堆中，再加入浸泡滤水后的谷粒，拌料混合均匀，调含 水量60.0%、 pH值约6.0，得固体培养基；将配制好的固体培养基分装于750ml广瓶中或 17cmX30cm的菌种袋中，每瓶或每袋700ml， 120。C灭菌60分钟，待冷却后备用；
c2)将在上述歩骤b2中获得的液体菌种接种于歩骤cl中瓶装或袋装的培养基中，置 于28。C培养室中培养40 50天，菌丝体长满培养瓶或培养袋，得固体菌种。
实施例2:a、 用菌种培养基培养暗褐网柄牛肝菌子实体组织块制备母种，母种培养基的制备由下 述原料及方法配制而成
原料马铃薯150.0g，葡萄糖15 .Og，酵母膏1 .Og， MgS04 2.0 g， KH2P04 2.0g，琼 脂20.0g，水1000ml, pH值约5.0;
以下步骤与实施例l相同。
b、 用液体培养基发酵培养液体菌种，液体培养基的原料组成如下马铃薯150.0g， 蔗糖15.0 g，酵母膏1.0g， MgS04 2.0 g, KH2P04 2 . 0g，水1000ml， pH值约5.0;
以下歩骤与实施例l相同。
C、用固体培养基培养固体菌种，固体培养基的原料组成如下杂木锯木屑10.0kg， 谷粒4. Okg， MgSO415.0g， KH2PO415.0g， pH值约5.0; 以下歩骤与实施例1相同。
8
权利要求
1.暗褐网柄牛肝菌菌种培养方法，其特征在于按以下步骤进行a、用母种培养基培养暗褐网柄牛肝菌子实体组织块制备母种，母种培养基的制备由下述原料及方法配制而成马铃薯150.0～200.0g葡萄糖15.0～20.0g酵母膏1.0～2.0gMgSO4 1.0～2.0gKH2PO41.0～2.0g琼脂 15.0～20.0g水1000ml配制方法a1)将新鲜马铃薯洗净、去皮、称量、切成薄片放入大烧杯中，加入定量的水，煮沸20分钟过滤取滤液，加入葡萄糖、琼脂、酵母膏、MgSO4、KH2PO4，煮沸至琼脂完全溶化，pH值4.0～6.0，得母种培养基；将培养基分装于三角瓶中，120℃灭菌30分钟，待冷却后倒入培养皿中即可使用；a2)用解剖刀分离暗褐网柄牛肝菌野生子实体组织块，置于有母种培养基的培养皿中培养菌丝体生长并扩繁；a3)采集野生的暗褐网柄牛肝菌子实体，用清水冲洗净、凉干，用75％酒精溶液消毒子实体表面，将子实体一掰为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交界的中间部位2-3mm的菌肉组织块放于倒有母种培养基的培养皿中，置于28℃的培养箱中培养30天，菌丝体长满培养皿，得母种；b、用液体培养基培养液体菌种，液体培养基的原料组成如下马铃薯150.0～200.0g蔗糖 15.0～20.0g酵母膏1.0～2.0gMgSO4 1.0～2.0gKH2PO41.0～2.0g水1000ml配制方法b1)将新鲜马铃薯洗净、去皮、称量，切成薄片放入大烧杯中，加入定量的水，煮沸20分钟过滤取滤液，在滤液中加入蔗糖、酵母膏、MgSO4、KH2PO4，混匀，pH值4.0～6.0，得液体培养基；将配制好的液体培养基分装于三角瓶中，每瓶300ml，120℃灭菌30分钟，待冷却后备用；b2)将在上述步骤a3)中获得的母种转管活化后，将菌丝体连同培养基切成2mm～4mm的碎菌块接种于步骤b1中瓶装的培养基中，在28℃，125r/min回旋式摇床中振荡培养，培养8天得到液体菌种；c、用固体培养基培养固体菌种，固体培养基的原料组成如下锯木屑10.0kg谷粒 4.0～6.0kgMgSO4 10.0～20.0gKH2PO410.0～20.0g配制方法c1)将谷粒称量放入桶中，加水浸泡10～12小时，滤除多余水份备用，将MgSO4、KH2PO4溶解于适量的水中喷洒入锯木屑料堆中，再加入浸泡滤水后的谷粒，拌料混合均匀，最后调培养料含水量至60.0％，pH 4.0～6.0，得固体培养基；将配制好的固体培养基分装于广瓶中或菌种袋中，每瓶或每袋700ml，120℃灭菌60分钟，待冷却后备用；c2)将在上述步骤b2)中获得的液体菌种接种于步骤c1)中瓶装或袋装的培养基中，置于28℃培养室中培养40～50天，菌丝体长满培养瓶或培养袋，得固体菌种。
全文摘要
本发明是暗褐网柄牛肝菌菌种培养从母种、液体菌种至固体菌种的培养方法。其特征是使用马铃薯、蔗糖、葡萄糖、琼脂、酵母膏、MgSO₄、KH₂PO₄、橡胶木锯木屑或其他杂木屑、谷粒、水等原料按照一定比例配制母种、液体菌种及固体菌种培养基，按照从母种、液体菌种至固体菌种的培养方法，先培养暗褐网柄牛肝菌母种及液体菌种，然后将液体菌种接种于固体培养基上培养成固体菌种。本发明所提供的培养基特别适合暗褐网柄牛肝菌母种、液体菌种及固体菌种的培养。利用该培养方法，可快速进行暗褐网柄牛肝菌从母种、液体菌种至固体菌种的培养。
文档编号A01G1/04GK101491195SQ20091009415
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者何明霞, 静 刘, 张春霞, 旸 曹, 王文兵, 纪开萍 申请人:云南省热带作物科学研究所