专利名称：春兰杂交种子与细菌共生萌发方法
技术领域：
本发明涉及植物栽培技术领域，具体是一种春兰杂交种子与细菌的萌发方法。
背景技术：
杂交育种是培育国兰新品种的重要手段和途径。但是国兰种子十分细小，发育不健全，缺乏给幼苗提供营养物质的胚乳，只有几百个尚未分化的胚细胞组成的种胚，且种皮厚，难吸水。自然状态下，国兰种子只有与菌根真菌共生，才能发芽长成幼苗。国内外关于菌根真菌与兰科植物相互关系的研究已有近百年的历史，分离出不少对兰花种子萌发和生长有促进作用的菌根真菌并生产出相应的菌根制剂，如"兰菌王"等。但菌根真菌对兰花种子的萌发存在不少问题，主要是真菌的侵染与种子萌发有某种程度的相对专一性和选择性，即某种真菌只对一种或几种兰花种子的萌发有促进作用。除非找到一种或多种兰菌对多数兰花的种子都有促进萌发的作用，大规模的推广才有可能。因此目前共生萌发技术对国兰种子萌发而言具有很大的局限性，必须分离出众多兰菌与某种国兰种子作共生萌发试验，选出共生真菌，而这种真菌未必对其他国兰种子萌发有促进作用，真菌分离过程复杂，操作难度大，效果不理想，技术尚不成熟。
应用无菌萌发技术进行国兰及其杂交种子萌发，已取得突破，但同时仍存在一些问题。主要是现有技术还不能使大多数国兰及其杂交种子顺利萌发，并且存在萌发所需时间长，萌发率低，萌发不整齐，持续时间太长的问题。縮短国兰种子的萌发时间和提高萌发率，是縮短国兰杂交育种周期的关键，也是国兰杂交育种的关键技术之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺憾而提出一种春兰杂交种子与细菌共生萌发方法，
它在春兰杂交种子萌发时，感染一种芽孢杆菌Bacillus sp，縮写为Bs细菌，为兰科植物中采用无菌萌发技术也难萌发或萌发效果不理想的地生兰类种子提供了一种具有普遍性、简便、快捷、有效的种子与Bs细菌共生萌发方法。
本发明提出的春兰杂交种子与Bs细菌共生萌发方法的具体步骤如下a.将人工授粉，果实生长七至九成熟的朔果从母株剪下，清理干净枯残花瓣，蘸洗衣粉水仔细刷洗，自来水下冲洗干净；超净工作台上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1%升汞液中 消毒15 20分钟，无菌水洗两遍，无菌滤纸或纱布擦干蒴果表面水分。
b. 在超净工作台无菌器皿上切掉蒴果两头，沿蒴果脊线切开果壳，掰开取出种子， 将种子均匀播种到事先准备好的1 / 2MS +蔗糖20g / L+AC lg / L+琼脂粉8g / L， pH 值5.6的固体培养基中，播种量根据种子量和需要而定。无菌萌发的应滴入适量无菌水，以 润湿种子。
c. 接种Bs细菌用1/2MS + 土豆(50g / L)提取液+蔗糖20g / L， pH值5.6的液体 培养基进行培养，常温保存90天仍有效。共生萌发接种分三种情况进行-
c-l:在播种完种子后随即接种细菌，即用吸管吸取细菌液，分别滴入各培养瓶中，接种 量10滴左右。播种后随即接种细菌，可缩短种子萌发时间，种子萌发较早，萌发率高，萌发 整齐。不同杂交组合，其杂交种子发育情况、种子质量不一样，其种子萌发所需时间、萌发 率、萌发整齐度不同。 一般而言，只要种子具有生活力，接种4个月至13个月，种子即开始 萌发，持续萌发时间4 ~10个月。
c-2:无菌播种效果不好，即一年以上无种子萌发，或种子萌发少，萌发不整齐，此时接 种细菌，即用吸管吸取细菌液，分别滴入各培养瓶中，接种量10滴左右，只要种子没有丧失 生活力，接种4个月至13个月，种子即开始大量萌发，持续萌发时间4 ~10个月。
c-3:播种时同时采用无菌萌发和细菌共生萌发，即:部分种子做无菌萌发，部分种子做共 生萌发，方法同c-l、 c-2。同时采用两种萌发方法，对于容易萌发的杂交种子，可同时得到 无菌中间繁殖体，便于进行无菌培养，而对于难萌发，或萌发效果不好的杂交种子，也可保 证以最短时间获得理想的萌发效果。
整个接种过程都在超净工作台上进行。
d. 处理接种完毕的培养瓶，置于温度23^±3培养室的培养架上，不补充光照，在室 内散射光下进行萌发，随时观察种子萌发情况。如果培养基水分蒸发，及时添加无菌水。
e. 与Bs细菌共生萌发后发育成的中间繁殖体即根茎状，可以带菌培养，也可以除菌后 无菌培养。进行带菌培养的培养基，不添加土豆、香蕉提取液和椰乳有机物。无菌培养的除 菌方法先将带菌根状茎，用无菌水涮洗2 4遍，去除部分细菌，再根据根状茎大小，用 0.1%升汞药液浸泡4~8分钟，其间充分摇晃几次，最后用无菌水涮洗4 6遍即可。
本发明的方法萌发率很高，萌发很整齐。反复试验证明 采用的Bs细菌对所做的大多 数春兰杂交种子萌发试验的促萌作用都是显著的，有效率达89.3%，这就为解决菌根真菌存在的专一性和选择性问题提供了另外一条途径，具备推广应用的前提条件。经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
根据本发明所述的方法，对于无菌萌发效果不理想的国兰杂交种子，与Bs细菌共生萌发是一种简便、快捷、有效的方法。
具体实施例方式
本发明主要涉及莲瓣兰、豆瓣兰、朵香三个种5种杂交组合种子的萌发方法，但该发明并不局限这5种杂交组合种子的萌发方法。实施例1:
本发明的一种朵香X —种豆瓣兰杂交种子与BS细菌共生萌发方法的具体步骤如下
a. 将人工授粉，果实生长233天八成熟朔果从母株剪下，清理干净枯残花瓣，蘸洗衣粉水仔细刷洗，自来水下冲洗干净；超净工作台上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1%升汞液中消毒15分钟，无菌水洗两遍，无菌纱布擦干蒴果表面水分。
b. 在灭菌培养皿里切掉蒴果两头，沿蒴果脊线切开果壳，掰开将种子全部取出，置于另一培养皿里，用镊子充分拌匀。
c. 将种子全部均匀播种到事先准备好的1/2MS +蔗糖20g / L+AC lg / L+琼脂粉8g/L， pH值5.6的固体培养基中，共20瓶。其中15瓶做无菌萌发，每瓶滴入12滴无菌水，以润湿种子；另外5瓶做Bs细菌共生萌发，每瓶滴入10滴用1/2MS + 土豆(50g/L)提取液+蔗糖20g / L， pH值5.6的液体培养基培养的细菌液。
d. 处理接种完毕的培养瓶，置于温度23^±3培养室的培养架上，不补充光照，在室内散射光下进行萌发，随时观察种子萌发情况。
e. 播种8个月，受细菌侵染的种子开始萌发，待种子发育为lmm及以上大小的根状茎时，分期分批将其取出，处理转入其他培养基继续培养，而无菌播种的没有萌发。共生萌发持续时间8个月，5瓶(包括一瓶污染的)共得到中间繁殖体1221个，无菌萌发的15瓶种子始终没有萌发。
f. 分批取出的带菌小根状茎分别进行带菌培养和除菌无菌培养。带菌培养将带菌小根状茎，茎长lmm及以上大小，直接接种到无土豆、香蕉提取液和椰乳有机物的各阶段培养基中，根状茎正常生长、增殖、分化、成苗。除菌无菌培养将带菌根状茎，用无菌水涮洗2遍，去除部分细菌，lmm大小根状茎，用0.1%升汞药液浸泡4分钟；2mm大小根状茎，用0.1%升汞药液浸泡6分钟；3mm及以上大小根状茎，用0.1%升汞药液浸泡8分钟，其间充分摇晃几次，最后用无菌水涮洗4遍，滤干水分，接种于各阶段并添加土豆(50g/L)提 取液的培养基中，根状茎正常生长、增殖、分化、成苗。
采用与Bs细菌共生萌发的方法，使朵香X豆瓣兰这一组合杂交种子的培养获得成功。 实施例2:
本发明的一种莲瓣兰X —种豆瓣兰杂交种子与Bs细菌共生萌发方法的具体步骤如下
a. 将人工授粉，果实生长303天九成熟朔果从母株剪下，清理干净枯残花瓣，蘸洗衣粉 水仔细刷洗，自来水下冲洗干净；超净工作台上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1%升汞液中 消毒15分钟，无菌水洗两遍，无菌纱布擦干蒴果表面水分。
b. 在灭菌培养皿里切掉蒴果两头，沿蒴果脊线切开果壳，掰开将种子全部取出，置于另 一培养皿里，用镊子充分拌匀。
c. 将种子全部均匀播种到事先准备好的1/2MS +蔗糖20g / L+AC lg / L+琼脂粉 8g/L， pH值5.6的固体培养基中，共10瓶，均为无菌萌发，播种时每瓶滴入12滴无菌水， 以润湿种子。后污染两瓶，丢弃，现存8瓶。
d.处理接种完毕的培养瓶，置于温度23^±3培养室的培养架上，不补充光照，在室 内散射光下进行萌发，随时观察种子萌发情况。该组合杂交种子于2006年11月7日处理播 种，至2008年8月7日都没有萌发，期间培养基水分蒸发，加过一次无菌水，每瓶20滴。 2008年8月8日，往3个培养瓶中接种Bs细菌，即每瓶滴入10滴用1 /2 MS + 土豆(50g / L)提取液+蔗糖20g / L， pH值5.6的液体培养基培养的Bs细菌液。
e. 接种6个月即2009年2月5日观察到，受细菌侵染的种子呈密集式萌发，2009年6 月24日，从2个萌发瓶中取出约500个小根状茎；2009年7月20日，从3个萌发瓶中取出 约800个小根状茎，萌发仍在继续。而无菌播种的5瓶至今没有一粒萌发。
f. 分2批取出的带菌小根状茎分别进行带菌培养和除菌无菌培养。带菌培养将带菌小 根状茎，茎长lmm及以上大小，直接接种到无土豆、香蕉提取液和椰乳有机物的各阶段培 养基中，根状茎正常生长、增殖。除菌无菌培养将带菌根状茎，用无菌水涮洗3遍，去除 部分细菌，再用0.1%升汞药液浸泡6分钟；期间充分摇晃几次，最后用无菌水涮洗5遍，滤 干水分，接种于添加土豆(50g / L)提取液的增殖生长培养基中，根状茎正常生长、增殖。
采用与Bs细菌共生萌发的方法，使莲瓣兰X豆瓣兰这一组合杂交种子的萌发获得成 功，目前带菌与无菌培养的根状茎正常生长、增殖，尚未分化成苗。 实施例3:
6本发明的一种朵香X朵香杂交种子与BS细菌共生萌发方法的具体步骤如下
a. 将人工授粉，果实生长333天九成熟朔果从母株剪下，清理干净枯残花瓣，蘸洗衣粉水仔细刷洗，自来水下冲洗干净；超净工作台上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1%升荥液中消毒20分钟，无菌水洗两遍，无菌纱布擦干蒴果表面水分。
b. 在灭菌培养皿里切掉蒴果两头，沿蒴果脊线切开果壳，掰开将种子全部取出，置于另一培养皿里，用镊子充分拌匀。
c. 将种子全部均匀播种到事先准备好的1/2MS +蔗糖20g / L+AC lg / L+琼脂粉8g/L， pH值5.6的固体培养基中，共12瓶，均为无菌萌发，播种时每瓶滴入12滴无菌水，以润湿种子。
d.处理接种完毕的培养瓶，置于温度23 QC±3培养室的培养架上，不补充光照，在室内散射光下进行萌发，随时观察种子萌发情况。该组合杂交种子于2006年12月7日处理播种，至2008年8月7日都没有萌发，期间培养基水分蒸发，加过一次无菌水，每瓶20滴。2008年8月8日，往3个培养瓶中接种Bs细菌，即每瓶滴入10滴用1 / 2 MS + 土豆(50g/L)提取液+蔗糖20g / L， pH值5.6的液体培养基培养的细菌液。
e .接种4个多月即2008年12月30日观察到，受细菌侵染的种子呈密集式萌发。从2009年2月20日至6月24日，分三批从3瓶萌发瓶中取出约800个小根状茎；其中2瓶萌发完毕，另一瓶萌发仍在继续。而无菌播种的9瓶至今只陆续萌发5粒。
f.分三批取出的带菌小根状茎分别进行带菌培养和除菌无菌培养。带菌培养将带菌小根状茎，茎长lmm及以上大小，直接接种到无土豆、香蕉提取液和椰乳有机物的各阶段培养基中，根状茎正常生长、增殖。除菌无菌培养将带菌根状茎，用无菌水涮洗4遍，去除部分细菌，再用0.P/。升汞药液浸泡6分钟；其间充分摇晃几次，最后用无菌水涮洗6遍，滤干水分，接种于添加土豆(50g / L)提取液的增殖生长培养基中，根状茎正常生长、增殖、分化、成苗。
采用与Bs细菌共生萌发的方法，使这一朵香X朵香组合杂交种子的培养获得成功。实施例4:
本发明的一种莲瓣兰X莲瓣兰杂交种子与BS细菌共生萌发方法的具体步骤如下
a.将人工授粉，果实生长201天八成熟的朔果从母株剪下，清理干净枯残花瓣，蘸洗衣粉水仔细刷洗，自来水下冲洗干净；超净工作台上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1%升汞液中消毒15分钟，无菌水洗两遍，无菌纱布擦干蒴果表面水分。b. 在灭菌培养皿里切掉蒴果两头，沿蒴果脊线切开果壳，掰开将种子全部取出，置于另 一培养皿里，用镊子充分拌匀。
c. 将种子全部均匀播种到事先准备好的1/2MS +蔗糖20g / L+AC lg / L+琼脂粉 8g/L， pH值5.6的固体培养基中，共16瓶，其中13瓶做无菌萌发，每瓶滴入12滴无菌 水，以润湿种子；3瓶做细菌共生萌发，每瓶滴入10滴用1/2MS + 土豆(50g/L)提取液 +蔗糖20g / L， pH值5.6的液体培养基培养的细菌液。
d. 处理接种完毕的培养瓶，置于温度23^士3培养室的培养架上，不补充光照，在室 内散射光下进行萌发，随时观察种子萌发情况。
e. 播种13个月，受细菌侵染的种子开始萌发，待种子发育为l mm及以上大小的根状 茎时，分期分批将其取出，处理转入其他培养基继续培养，共生萌发持续时间10个月，3瓶 共得到中间繁殖体213个，无菌萌发的13瓶种子只得到41个中间繁殖体，并且萌发尚未结 束，持续萌发时间己达3年，期间培养基水分蒸发，加过两次无菌水，每瓶每次加入20滴。
f. 无菌根状茎做无菌培养，而分批取出的带菌小根状茎分别进行带菌培养和除菌无菌培 养。带菌培养将带菌小根状茎，茎长1 mm及以上大小，直接接种到无土豆、香蕉提取液 和椰乳有机物的各阶段培养基中，根状茎正常生长、增殖、分化、成苗。除菌无菌培养将 带菌根状茎，用无菌水涮洗2遍，去除部分细菌，lmm大小根状茎，用0.1%升荥药液浸泡4 分钟；2mm大小根状茎，用0.1%升汞药液浸泡6分钟；3mm及以上大小根状茎，用0.1% 升汞药液浸泡8分钟，其间充分摇晃几次，最后用无菌水涮洗5遍，滤干水分，接种于各阶 段并添加土豆(50g / L)提取液的培养基中，根状茎正常生长、增殖、分化、成苗。
采用与Bs细菌共生萌发的方法，使莲瓣兰X莲瓣兰这一组合杂交种子的培养获得成功。
实施例5:
本发明的一种朵香X朵香杂交种子与Bs细菌共生萌发方法的具体步骤如下
a. 将人工授粉，果实生长169天七成熟的朔果从母株剪下，清理干净枯残花瓣，蘸洗衣 粉水仔细刷洗，自来水下冲洗干净；超净工作台上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1%升汞液 中消毒20分钟，无菌水洗两遍，无菌纱布擦干蒴果表面水分。
b. 在灭菌培养皿里切掉蒴果两头，沿蒴果脊线切开果壳，掰开将种子全部取出，置于另 一培养皿里，用镊子充分拌匀。
c. 将种子全部均匀播种到事先准备好的1/2MS +蔗糖20g / L+AC lg / L+琼脂粉
88g/L， pH值5.6的固体培养基中，共7瓶，其中5瓶做无菌萌发，每瓶滴入12滴无菌水，以润湿种子；2瓶做细菌共生萌发，每瓶滴入10滴用1/2MS + 土豆(50g/L)提取液+蔗糖20g / L， pH值5.6的液体培养基培养的Bs细菌液。
d. 处理接种完毕的培养瓶，置于温度23^±3培养室的培养架上，不补充光照，在室内散射光下进行萌发，随时观察种子萌发情况。
e. 播种13个月，受细菌侵染的种子整齐萌发，待种子发育为l mm以上大小的根状茎时，取出处理转入其他培养基继续培养，共生萌发持续时间约4个月，2瓶共得到中间繁殖体357个，无菌萌发的5瓶种子得到121个中间繁殖体，持续萌发时间达3年，期间培养基水分蒸发，加过两次无菌水，每瓶每次加入20滴。
f. 无菌根状茎做无菌培养，而将取出的带菌小根状茎分别做带菌培养和除菌无菌培养。带菌培养将带菌小根状茎，茎长1 mm及以上大小，直接接种到无土豆、香蕉提取液和椰乳有机物的各阶段培养基中，根状茎正常生长、增殖、分化、成苗。除菌无菌培养将带菌根状茎，用无菌水涮洗3遍，去除部分细菌，0.1%汞药液浸泡8分钟，期间充分摇晃几次，最后用无菌水涮洗5遍，滤干水分，接种于各阶段并添加土豆(50g/L)提取液的培养基中，根状茎正常生长、增殖、分化、成苗。
采用与Bs细菌共生萌发的方法，使这一朵香X朵香组合杂交种子的培养获得成功。
权利要求
1、一种春兰杂交种子与细菌共生萌发方法，所说的细菌是芽孢杆菌Bacillus sp，缩写为Bs细菌，其特征在于该方法的具体步骤如下a.将人工授粉，果实生长七至九成熟的朔果从母株剪下，清理干净枯残花瓣，蘸洗衣粉水仔细刷洗，自来水下冲洗干净；超净工作台上用酒精棉球擦拭消毒，再浸入0.1％升汞液中消毒15～20分钟，无菌水洗两遍，无菌滤纸或纱布擦干蒴果表面水分；b.在超净工作台无菌器皿里切掉蒴果两头，沿蒴果脊线切开果壳，掰开取出种子，将种子均匀播种到事先准备好的1/2MS+蔗糖20g/L+AC 1g/L+琼脂粉8g/L，pH值5.6的固体培养基中；c.接种Bs细菌用1/2MS+土豆(50g/L)提取液+蔗糖20g/L，pH值5.6的液体培养基进行培养，常温保存90天仍有效，整个接种过程都在超净工作台上进行；d.处理接种完毕，置于温度23℃±3培养室的培养架上，在室内散射光下进行萌发，随时观察种子萌发情况，如果培养基水分蒸发，及时添加无菌水，获得与Bs细菌共生萌发发育成的中间繁殖体即根茎状。
2、 根据权利要求1所述的春兰杂交种子与细菌共生萌发方法，其特征在于所说的发 育成的中间繁殖体，可以带菌培养，也可以除菌后无菌培养，进行带菌培养的培养基，不 添加土豆、香蕉提取液和椰乳有机物；无菌培养的除菌方法先将带菌根状茎，用无菌水 涮洗2~4遍，去除部分细菌，再根据根状茎大小，用0.1%升汞药液浸泡4~8分钟，其间 充分摇晃几次，最后用无菌水涮洗4 6遍即可。
3、 根据权利要求1所述的春兰杂交种子与细菌共生萌发方法，其特征在于步骤c中， 在播种完种子后随即接种Bs细菌，即用吸管吸取细菌液，分别滴入各培养瓶中，接种量 IO滴左右，播种后随即接种细菌。
4、 根据权利要求1所述的春兰杂交种子与细菌共生萌发方法，其特征在于步骤c中，无菌播种效果不好，即一年以上无种子萌发，或种子萌发少，萌发不整齐时，接种细菌，即用吸管吸取细菌液，分别滴入各培养瓶中，接种量10滴左右，只要种子没有丧失生活力，接种4个月至13个月，种子即开始大量萌发，持续萌发时间4 ~10个月。
5、根据权利要求1所述的春兰杂交种子与细菌共生萌发方法，其特征在于步骤c 中，播种时无菌萌发和Bs细菌共生萌发方法同时进行，即:部分种子做无菌萌发，部分种 子做共生萌发，方法同权利要求3、 4，同时采用无菌萌发和细菌共生萌发，对于容易萌发 的杂交种子，同时得到无菌中间繁殖体，便于进行无菌培养；而对于难萌发，或萌发效果 不好的杂交种子，保证以最短时间获得理想的萌发效果。
全文摘要
一种春兰杂交种子与细菌共生萌发方法，共生萌发接种分三种情况进行a.播种完种子后随即接种细菌，随即接种，可缩短种子萌发时间，种子萌发较早，萌发率高，萌发整齐；b.无菌播种效果不好，即一年以上无种子萌发，或种子萌发少，萌发不整齐时再接种细菌，只要种子没有丧失生活力，接种4个月至13个月，种子即开始大量萌发，持续萌发时间4～10个月；c.播种时同时采用无菌萌发和细菌共生萌发；对于容易萌发的杂交种子，可同时得到无菌中间繁殖体，便于进行无菌培养；而对于难萌发，或萌发效果不好的杂交种子，也可保证以最短时间获得理想的萌发效果；与细菌共生萌发后发育成的中间繁殖体即根茎状，可以带菌培养，也可以除菌后进行无菌培养。
文档编号A01C1/00GK101622922SQ20091009481
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月7日 优先权日2009年8月7日
发明者庞惠仙 申请人:昆明市林业科学研究所