专利名称：：壳聚糖在防治植物青枯病中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物保护技术的生物防治领域，尤其涉及壳聚糖在防治植物青枯病中的应用。
背景技术：
：作物细菌性青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacear咖)(俗称青枯菌)引起的一种系统侵染的毁灭性土传病害，俗称"植物瘟病"。发病作物茎叶萎蔫下垂至全株枯死，一般田块的发病率为10%_15%，重病田的发病率高达80%_99%，导致作物产量的严重下降，甚至绝收。病原的寄主范围广泛，可侵染44个科的数百种植物，包括番茄、茄子、烟草、花生、马铃薯、香蕉等。虽然不同植物在不同环境条件下的症状和危害程度表现若干差异，但共同特点是细菌从植株根部侵入，通过增殖和一系列生化活动损坏寄主维管束输导组织，导致植株失水枯萎，死亡。迄今为止，通过采用抗青枯的作物品种去防治青枯病的做法是很少的，因为已出现的品种不仅抗性低而且抗性容易丧失，其他的农业防治手段因受地域条件的限制，也难以大面积推广。化学防治上，虽然有农用链霉素、铜制剂等药物的出现，但均不是针对青枯病的防治农药，而且防效差，不稳定，病原菌极易产生抗药性，因此市场上尚无防治植物青枯病的有效药剂。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，通常将脱乙酰度大于55%的甲壳素称作壳聚糖，其学名为聚氨基葡萄糖，化学名(1，4)-2-氨基-2-脱氧-13-D-葡萄糖，广泛存在于虾、蟹等动物外壳和藻类、真菌的细胞壁中。壳聚糖是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、酵母菌和真菌等均有不同程度的抑制作用。壳聚糖具有良好的生物相溶性，可生物降解性以及无毒副作用，其分子内含有-0H和_朋2-活性基团，易与多种有机物发生反应，目前广泛应用在工业、农业、医药、化工、环境保护和水处理等领域。
发明内容本发明提供了一种壳聚糖防治植物青枯病中的应用，解决了现有药剂防效差，不稳定，病原菌易产生抗药性的问题。本发明还提供了一种防治植物青枯病的药剂，该药剂以壳聚糖为主要成份，添加常规的药用赋形剂，如水、乙酸等，制成水剂、粉剂等剂型。壳聚糖在防治植物青枯病中的应用，尤其是在防治番茄、茄子、烟草、花生、马铃薯或香蕉青枯病中的应用，将植物种子浸泡在上述壳聚糖溶液中或用上述壳聚糖溶液对种植土壤进行浇灌。所选用的壳聚糖的脱乙酰度优选大于75%，易获得，成本低。壳聚糖溶液的制备方法，包括以下步骤将壳聚糖粉末溶于体积百分比为1%的乙酸溶液中，然后添加水配制成浓度为110mg/mL的壳聚糖溶液。乙酸主要是用于调节pH至5.6，使得壳聚糖溶解，其用量和浓度可以根据需要进行调整。壳聚糖在促进番茄生长和提高番茄抗青枯病性能中的应用，将番茄种子浸泡在上述壳聚糖溶液中或用上述壳聚糖溶液对种植土壤进行浇灌，能够提高番茄叶片中几丁质酶和P-l，3-葡聚糖酶的活性，以及提高番茄植株高度、鲜重和干重。采用上述壳聚糖溶液不仅在离体条件下能抑制青枯菌的生长，而且在番茄活体上也使植株产生诱导抗性，并能有效降低青枯病的发生率。图1为实施例4中种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组未接种青枯病菌的条件下的几丁质酶活性对照图；图2为实施例4中种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组接种了青枯病菌的条件下的几丁质酶活性对照图；图3为实施例5中种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组未接种青枯病菌的条件下的P-l，3-葡聚糖酶活性对照图；图4为实施例5中种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组接种了青枯病菌的条件下的P-l，3-葡聚糖酶活性对照图。具体实施例方式实施例l制备壳聚糖溶液将脱乙酰度为75%的壳聚糖粉末溶解于体积百分比为1%的乙酸中，配制成浓度为10mg/mL的壳聚糖溶液，调节pH至5.6，用高压灭菌锅12rC灭菌20分钟，待用。pH为5.6、体积百分比为1%的乙酸溶液作为所有涉及壳聚糖处理的对照。当然壳聚糖的脱乙酰度也可以大于75%。实施例2检测壳聚糖对青枯菌的拮抗活性本实施例的青枯菌Rs-f.91由福建农业科学研究院提供，该菌株为试验材料，其特性对试验结果没有影响。本实施例采用平板对峙法和滤纸片法检测壳聚糖对青枯菌的拮抗活性，具体方法如下青枯菌Rs-f.91在CPG培养液(蛋白胨10.0g;水解酪蛋白1.Og;葡萄糖5.Og;水1000mL;pH7.0-7.2)上170r/min、3(TC条件下振荡培养过夜，制得菌悬液。吸取lmL青枯菌菌悬液(108CFU/mL)与15mLCPG固体培养基(蛋白胨10.Og;水解酪蛋白1.Og;葡萄糖5.Og;琼脂20.Og;水1000mL;pH7.0-7.2)混匀，倒平板待用。平板对峙法在每个平板上用直径为10mm的打孔器打4个孔，每个孔里加实施例1制得的10mg/mL的壳聚糖溶液(如未特别说明，实施例27的壳聚糖溶液均指实施例1制得的壳聚糖溶液)50yL。滤纸片法将直径为5mm的无菌滤纸片在10mg/mL的壳聚糖溶液中浸泡10分钟，每个平板上放4个滤纸片。上述两种方法均用pH为5.6的体积百分比为1%的乙酸溶液作为空白对照。处理后的平板置于3(TC温箱培养48小时，待青枯菌大量长起后测量抑菌圈大小，每处理设4个重复。结果显示，用这两种方法检测壳聚糖对青枯菌的拮抗活性都有显著的效果。其中用滤纸片法的实验显示，10mg/mL的壳聚糖在平板上对青枯菌的平均抑制直径为8.Omm，而采用平板对峙法时，其平均抑制直径达11.Omm。实施例3温室种植番茄植株种子处理组番茄种子先用2%的次氯酸钠表面消毒2分钟，用无菌水洗3次后在10mg/mL的壳聚糖溶液中浸泡2小时，过夜风干，置于用无菌水打湿的无菌滤纸上，室温培养5天使其预萌发，最后播种在20cm直径X20cm高的装有未灭菌蔬菜土的盆子中，随机放在12小时光照/12小时黑暗、80%相对湿度、28"的温室中。对照组用体积百分比为1%的乙酸溶液浸泡番茄种子。每个处理4个重复，每盆5棵植物。土壤浇灌组番茄种子先用2%的次氯酸钠表面消毒2分钟，用无菌水洗3次后过夜风干，然后置于用无菌水打湿的无菌滤纸上，室温培养5天使其预萌发，最后播种在20cm直径X20cm高的装有未灭菌蔬菜土的盆子中，随机放在12小时光照/12小时黑暗、80%相对湿度、28t:的温室中。播种3天前，每个盆子中浇灌50mL的10mg/mL的壳聚糖溶液。对照组用50mL体积百分比为1%的乙酸溶液浇灌每个盆子。每个处理4个重复，每盆5棵植物。青枯菌Rs-f.91在CPG培养液(蛋白胨10.0g;水解酪蛋白1.Og;葡萄糖5.Og;水1000mL;pH7.0-7.2)中于3(TC下过夜培养，制得菌悬液。在播种预萌发的番茄种子2周后，种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组均取一半接种50mL青枯菌悬浮液(108CFU/mL)，另一半盆子接种50mL无菌水，接种后每株植株用塑料袋套袋24小时，以保持一个相对高的湿度。实施例4番茄叶子中几丁质酶活性分析在实施例3的基础上，接种7天后，从种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组的番茄植株中采集长度为35cm的叶子。采集后，从每组处理中取lg新鲜的样本，分别用液氮在研钵里捣碎，然后加5mL0.lmol/L的乙酸缓冲液(pH5.0)，在10000r/min、4t:条件下离心IO分钟，分离上清液。取0.4mL上清液(即酶液)，加入40iiL1%蜗牛酶，37"水浴反应30分钟后，加入0.2mL饱和硼砂，放在沸水浴中加热7分钟，冷却后加入2mL冰醋酸和lmL1%对二甲氨基苯甲醛(DMAB)，37。C保温15分钟，585nm下测定其吸光值(PerkinElmer(珀金-i矣尔默)公司生产的lambda35UV/Visspectrometer)，测得每组处理的叶子中几丁质酶的活性。一个几丁质酶活性单位定义为每克番茄叶子在上述条件下每分钟产生lmmolN-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量。如图1和图2所示，无论是否有青枯病菌的存在，壳聚糖都能提高番茄植株体内的几丁质酶活性。如图l所示，在没有青枯病菌存在的条件下，壳聚糖作为土壤浇灌液或种子浸泡剂，能够分别增加几丁质酶13.14%和11.15%的活性，如图2所示，青枯病菌存在的条件下，壳聚糖作为土壤浇灌液或种子浸泡剂，增加几丁质酶的活性分别超过95.99%和61.97%。实施例5番茄叶子中P-l，3-葡聚糖酶活性分析在实施例3的基础上，接种7天后，从种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组的番茄植株中采集长度为35cm的叶子。采集后，从每组处理中取lg新鲜的样本，分别用液氮在研钵里捣碎，然后加入5mL0.05mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.0)，在10000r/min、fC条件下离心10分钟，分离上清液。取62.5iiL的上清液，加入62.5iiL浓度为4%的海带多糖溶液，4(TC水浴10分钟后加入375uL二硝基试剂，再沸水浴中加热5分钟。反应结束后用4.5mL的蒸馏水稀释反应液，500nm处测定其吸光值(PerkinElmer(珀金-埃尔默)公司生产的lambda35UV/Visspectrometer)，得到每组处理的番茄叶子中P_1，3_葡聚糖酶的活性。一个酶活性单位定义为每克番茄叶子在上述条件下每分钟产生lmmol葡萄糖所需的酶量。如图3所示，在没有青枯病菌存在的条件下，壳聚糖作为土壤浇灌液或种子浸泡剂，能够分别增加P-1，3-葡聚糖酶6.66%和2.35%的活性，如图4所示，在青枯病菌存在的条件下，壳聚糖作为土壤浇灌液或种子浸泡剂，增加13-1，3-葡聚糖酶的活性分别超过68.05%和47.30%。实施例4和实施例5的结果表明，无论是否存在青枯菌，壳聚糖都能诱导植物体内几丁质酶和P-l，3-葡聚糖酶活性的上升。在植物抗病防御系统中，几丁质酶和P-l，3-葡聚糖酶起到非常重要的作用，这两种酶活性的提高，能增强植物的抗病性。实施例6番茄植株病害评价观察记录实施例3中种子处理组、土壤浇灌组以及它们的对照组接种了青枯菌后的番茄植株的病害严重程度，病害严重度根据番茄植株接种病原菌8周后叶片枯萎严重程度进行记录，分为如下5级标准O级无症状，植株健康；1级1%_15%的叶片萎蔫；2级16%_30%的叶片萎蔫；3级31%_60%的叶片萎蔫；4级61%以上的叶片萎蔫，但植株还没死亡或全株枯萎；5级植株萎蔫或死亡。同时枯萎发生率和病害控制效率按下列公式计算病害发生率(％)={(病级X相应级别感染植物的数量)/(最高级别X总的植物数量)}XIOO，最高级别表示该处理组病害严重度的最高级别。生防效能(％)={(对照处理的病害发生率-壳聚糖处理的病害发生率)/对照处理的病害发生率}X100结果显示，无论是土壤浇灌还是种子浸泡，与对照相比，壳聚糖都能显著降低番茄的病害发生率(表1)，其生防效能分别达到71.99%和48.01%。而不接种青枯病菌的番茄都未显示症状。表1不同处理下，番茄植株的病害评价处理病害发生率(％)生防效能(％)土壤浇灌壳聚糖17.55±5.72a71.99c对照62.66±4.98c0.00a种子处理壳聚糖33.33±7.70b48.01b对照64.11±4.11c0.00a注表中壳聚糖的浓度为10mg/mL，下同。实施例7番茄植株生长促生在播种2个月后，收获所有番茄植株(接种病菌和不接种病菌)，测量所有植株的株高。将植株洗净，吸干，测定其鲜重。将称完鲜重的番茄植株装入信封，放置于烘箱内，6(TC烘干3天后，测定其干重。壳聚糖的相对生长促生率(GPE)按下列公式计算GPE(%)={(壳聚糖处理的植物参数_对照处理的植物参数)/对照处理的植物参数}X100结果显示，在没有青枯病菌存在的条件下，壳聚糖溶液无论是作为土壤浇灌液还是作为种子浸泡剂，都能促进番茄植株生物量的增长。与对照相比，壳聚糖溶液的两种施用方式显著增加株高分别超过55.72%和37.51%，增加植物鲜重分别超过100.92%和91.15%，增加植物干重分别超过85.67%和66.27%(表2)。同样，在青枯病菌存在的条件下，壳聚糖溶液无论是作为土壤浇灌液还是作为种子浸泡剂，都能促进番茄植株生物量的增长。与对照相比，壳聚糖溶液的两种施用方式能显著增加植物的株高分别超过67.87%和39.45%，增加植物的鲜重分别超过97.73%和81.88%，增加植物的干重分别超过76.17%和54.95%(表3)。表2壳聚糖对未接种青枯病菌的番茄植株生物量的影响处理长度(cm)GPE(%)鲜重(g)GPE(%)干重(g)GPE(%)土壤浇灌壳聚糖36.33±0.69d55.72c28.47±0.32b100.92c5.70±0.20cd85.67c对照23.33±1.20b0.00a14.17±0.50a0.00a3.07±0.09a0.00a种子处理壳聚糖29.33±U5c37.51b27.20±0.67b91.15b5.57±0.41c66.27b对照21.33±0.33a0.00a14.23±0.67a0.00a3.35±0.20b0.00a注表中GPE为相对生长促生率，下同。表3壳聚糖对接种青枯病菌的番茄植株生物量的影响7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求壳聚糖在防治植物青枯病中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的植物为番茄、茄子、烟草、花生、马铃薯或香蕉。3.壳聚糖在提高番茄抗青枯病性能中的应用。4.壳聚糖在促进番茄生长中的应用。5.根据权利要求14任一所述的应用，其特征在于所述的壳聚糖脱乙酰度大于75%。6.根据权利要求14任一所述的应用，其特征在于将植物种子浸泡在壳聚糖溶液中或用壳聚糖溶液对种植土壤进行浇灌，所述的壳聚糖溶液的浓度为110mg/ml。全文摘要本发明公开了一种壳聚糖在防治番茄青枯病中的应用。本发明制剂能显著增加番茄植株的诱导抗性，降低番茄青枯病的发生率，同时也能促进番茄植株的生长。采用本发明制剂防治番茄青枯病简单易行，成本较低。文档编号A01P1/00GK101731220SQ20091015574公开日2010年6月16日申请日期2009年12月25日优先权日2009年12月25日发明者周青,李斌,苏婷,谢关林申请人:浙江大学