专利名称：：一种提高小麦纹枯病抗性的方法
技术领域：
：本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，通过采用基因工程方法将天麻的抗真菌蛋白基因和防御素基因导入常规小麦并表达，增加小麦的纹枯病抗性。
背景技术：
：小麦纹枯病，又称麦尖眼点病(Wheatsharpeyespot)，是由禾谷丝核菌(RhizoctoniacerealisVanderhoeven)禾口立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKuhn)弓l起的一种重要的世界性土传真菌病害，早在1934年国外即有报道。1973年，我国也发现此病。20世纪80年代以来，随着施肥水平的不断提高，耕作制度的改变和感病品种的大面积推广，纹枯病已成为我国长江流域麦区的主要病害，并逐渐蔓延到黄淮麦区，近年来以鲁、豫、陕、苏、皖等麦区发生较为严重(姚金保等，2007)。小麦纹枯病一般病田病株率为10-20%，重病田块可达60-80%以上，由此造成的产量损失严重，轻的减产5-10%，重的减产40%，甚至颗粒无收，并且小麦纹枯病发病越早，损失越重(张会云等，2007)。目前，我国小麦纹枯病的防治依然以化学防治为主，化学防治不仅增加农本，而且会造成环境污染，化防的效果还直接受到施药的时期、天气等诸多环境因素的影响。培育并推广小麦纹枯病抗病品种无疑是控制该病害最经济和最有效的途径。但多年的种质材料鉴定研究也发现，在已经筛选的近千份材料中，没有发现对该病害免疫的小麦品种(系)，高抗的材料也较少。对主要纹枯病抗源的抗性遗传和抗病QTL(数量性状位点)分析结果表明，小麦纹枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的数量性状，并且存在复杂的基因互作(汤颞等，2004;吴纪中等，2005;张小村等，2005;任丽娟等，2007)。由于遗传方式的复杂，给常规育种带来诸多困难，如周期性强、预见性差等，直接影响了小麦纹枯病抗性改良的进度。近年来，转基因技术由于周期短、可用的抗性基因多、针对性强等优点，已经成为提高作物抗病能力的新手段。采用这一方法，来自于小麦近缘种中间偃麦草的乙烯反应因子(ERF)基因已经被导入小麦并获得纹枯病抗性显著提高的转基因小麦植株(ChenLiang等，2008)。天麻抗真菌蛋白(Gastrodiaantifungalprotien，GAFP)位于天麻次生土央茎的表皮和皮层，对天麻次生块茎阻抑蜜环菌侵染有关，离体抑菌实验表明天麻抗真菌蛋白对多种真菌均有抑菌活性(胡忠等，1988)，该基因已经被克隆(http:〃丽w.ncbi.nlm.nih.gov/;GenBank:AF225410)。防御素是一类广泛存在于生物体内的富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽，其作用机理特殊带正电荷的防御素分子与带负电荷的靶细胞膜接触后，通过靶细胞膜产生的电动势将形成疏水面的防御素二聚体注入细胞膜，多个二聚体可形成跨膜离子通道，扰乱细胞膜通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作用受抑制以及细胞ATP含量下降，最终使靶细胞死亡；防御素抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导致病毒失去生物活性(童青春等，1999;龙晶等，2007)。防御素的抗菌谱广，不但对细菌、真菌、和被膜病毒有广谱的毒杀效应，对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用。来自于兔的防御素NP-l已进行氨基酸序列测定(GenBank:AAB21588)。本发明采用基因工程方法将天麻抗真菌蛋白基因以及兔防御素NP-l基因导入普通小麦，提高了小麦的纹枯病抗性。
发明内容本发明目的在于针对目前小麦纹枯病抗性种质资源贫乏状况，采用转基因方法将抗小麦纹枯病病原菌的天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因导入感纹枯病的小麦品种，从而提高小麦的纹枯病抗性。本发明目的是这样实现的构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体；采用基因枪方法将构建的表达载体导入受体小麦幼胚细胞；通过组织培养过程筛选，获得转基因待选植株；对待选植株进行PCR(聚合酶链式反应)分析，获得整合并表达天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的转基因植株；对纯合的转基因植株后代株系进行纹枯病抗性鉴定，筛选并获得纹枯病抗性提高的小麦转基因株系。在本发明中所述的构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体是这样实现的，以pAHC25(附图一)为基础质粒，采用限制性内切酶XbaI和Bgl1I对pAHC25质粒DNA进行部分酶切，切除质粒含有的bar基因，0.8%琼脂糖电泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，与起始密码子ATG前和终止密码子TGA后分别添加XbaI和BglII酶切位点的兔防御素NP-l基因(由GenBank:AAB21588氨基酸序列推导的DNA碱基序列添加ATG起始密码子和终止密码子TGA，完整DNA序列见Seql)DNA片段，采用T4DNA连接酶16。C连接过夜(25ul反应体系含1XT4DNA连接酶缓冲液，质粒大片段0.3pmo1，兔防御素NP_1基因片段0.03pmol，350uT4DNA连接酶，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(转化方法参照《分子克隆实验指南》第二版，P55-56页，科学出版社，1992)，转化后的大肠杆菌DH5a细胞悬液涂布含100mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC-NP;pAHC-NP质粒DNA采用限制性内切酶SmaI和SacI完全酶切，切除质粒含有的GUS基因，0.8%琼脂糖电泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，再与起始密码子ATG前和终止密码子TGA后分别添加SmaI和SacI酶切位点的天麻抗真菌蛋白基因(GenBank:AF225410添加起始密码子ATG和终止密码子TGA，完整DNA序列见seq2)DNA片段采用T4DNA连接酶按上文连接条件进行连接，连接产物按上文方法转化大肠杆菌，对抗100mg/L氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC-NP-GAFP即为天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体(见附图二)。采用基因枪转基因方法将构建的表达载体导入受体小麦幼胚细胞，通过愈伤诱导、植株再生获得转基因待选植株(参照周淼平等，小麦基因枪法转化技术的改进，江苏农业学报，1999，15(1):62-64);所述的受体小麦是指六倍体常规小麦；所述的幼胚是指开花后12-14天的幼胚。在本发明的应用中对待选植株进行分子检测，获得整合并表达天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的阳性转基因植株，阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T5代转基因纯合株系；对T5代转基因纯合株系后代系进行纹枯病抗性筛选，获得纹枯病抗性提高的转基因植株。所述的分子检测为PCR分析方法。PCR分析是指提取待选转基因小麦及其后代的基因组DNA(脱氧核糖核酸)，以此为模板对天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因片段进行PCR扩增，能扩增出相应基因片段的植株为阳性转基因植株。天麻抗真菌蛋白基因的PCR检测引物为5'CTAGCACAAGGCGGCTACCTATTC3'和5'GCAGTGATTTCAGCATTTCCAACG3'，扩增条件95。C3分钟；94。C1分钟，62。C45秒，72。C30秒，共30个循环；最后72。C延伸5分钟。扩增片段大小为305bp，检测电泳图见附图3。兔防御素基因的PCR检测引物为5，ATGGTTGTTTGTGCATGTAG3，禾P5，CAACGACGACAACAAAGTGG3'，扩增条件95。C3分钟；94。C1分钟，60。C45秒，72。C30秒，共35个循环；最后72。C延伸5分钟。扩增片段大小为104bp，检测电泳图见附图4。纹枯病抗性鉴定是指采用具有较强致病力的纹枯病病原菌进行牙签嵌入法接种(具体鉴定方法参照蔡士宾等，小麦抗纹枯病种质创新及QTL定位的初步研究，中国农业科学，2006，39(5):928-934)，根据病情指数判定其纹枯病抗性。具体做法如下将长1.OcM左右的牙签水浸30分钟后，铺于烧杯底部，加入适量PDA培养基，经高温湿热灭菌后，接种具有较强致病力的纹枯菌菌丝块，25t:恒温培养30天，待菌丝密集布满短牙签表面。小麦拔节期将经上述方法处理的牙签嵌入到小麦植株贴近地面的基部第12叶鞘之间，每株系接种15个茎秆，喷雾保湿7天。于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况，计算病情指数，根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。病情严重度判定标准如下0级无病症；1级叶鞘有典型的纹枯病病斑，但不侵茎；2级病菌侵人茎秆，病斑宽度环茎不超过茎秆周长的1/2;3级病菌侵人茎秆，茎秆上病斑环茎宽度在1/2-3/4茎秆周长之间；4级病菌侵人茎秆，茎秆上病斑绕茎秆3/4以上，或茎秆已软腐；5级枯孕穗或枯白穗。病情指数按以下公式计算病情指数=[(E各级病株数X各级代表值)/(总株数X最高级代表值)]X100纹枯病抗性判定标准病情指数《20为"高抗"；20<病情指数《50为"抗病"；50<病情指数《80为"感病"；80<病情指数《100为"高感"。本发明的优点在于与常规的种质培育方法相比，选取的目的基因对纹枯病病原菌的生长有抑制作用，针对性强；由转化植株到纯合的转基因株系时间短并且对受体亲本的重要农艺性状影响小，培育的周期短、减少对重要农艺性状选育所需的人工经验的依赖性。图lpAHC25的示意图图2天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体pAHC-NP-GAFP的示意图图3部分转基因待选植株天麻抗真菌蛋白基因的PCR检测的电泳图，其中1:未转基因扬麦158对照。2:质粒pAHC-NP-GAFP。12:DNA分子量标准，条带从上到下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。3-11，13-24:转基因待选植株。其中4-6，8-11，13-18，20-24为转天麻抗真菌蛋白基因的阳性植株。图4为部分转基因待选植株兔防御素基因的PCR检测的电泳图，其中CK+:质粒pAHC-NP-GAFP。CK—:未转基因扬麦158对照。1-16:转基因待选植株。其中1，3-6，10-15为转兔防御素基因的阳性植株。具体实施方式实施例1:以pAHC25为基础质粒，采用限制性内切酶XbaI和BglII对pAHC25质粒DNA进行部分酶切，切除质粒含有的bar基因，O.8%琼脂糖电泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，与起始密码子ATG前和终止密码子TGA后分别添加XbaI和BglII酶切位点的兔防御素NP-1基因(由GenBank:AAB21588氨基酸序列推导的DNA碱基序列添加ATG起始密码子和终止密码子TGA，完整DNA序列见seql)DNA片段，采用T4DNA连接酶16。C连接过夜(25ul反应体系含lXiy)NA连接酶缓冲液，质粒大片段O.3pmol，兔防御素NP-l基因片段0.03pmol，35uT4DNA连接酶，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞(转化方法参照《分子克隆实验指南》第二版，P55-56页，科学出版社，1992)，转化后的大肠杆菌DH5a细胞悬液涂布含100mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC-NP;pAHC-NP质粒DNA采用限制性内切酶SmaI和SacI完全酶切，切除质粒含有的GUS基因，0.8%琼脂糖电泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，再与起始密码子ATG前和终止密码子TGA后分别添加SmaI和SacI酶切位点的天麻抗真菌蛋白基因(GenBank:AF225410添加起始密码子ATG和终止密码子TGA，完整DNA序列见seq2)DNA片段采用T4DNA连接酶按上文连接条件进行连接，连接产物按上文方法转化大肠杆菌，对抗100mg/L氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC-NP-GAFP即为天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体(见附图二)。以扬麦158为受体，采用基因枪法，将天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因同时导入扬麦158幼胚细胞，通过愈伤诱导、植株再生获得转基因待选植株(参照周淼平等，小麦基因枪法转化技术的改进，江苏农业学报，1999，15(1):62-64)，对待选植株进行PCR筛选，天麻抗真菌蛋白基因的PCR检测引物为5'CTAGCACAAGGCGGCTACCTATTC3'和5'GCAGTGATTTCAGCATTTCCAACG3'，扩增条件95°C3分钟；94°C1分钟，62。C45秒，72°C30秒，共30个循环；最后72t:延伸5分钟。扩增片段大小为305bp，检测电泳图见附图3。兔防御素基因的PCR检测引物为5'ATGGTTGTTTGTGCATGTAG3'禾P5'CAACGACGACAACAAAGTGG3，，扩增条件95。C3分钟；94。C1分钟，60°C45秒，72°C30秒，共35个循环；最后72t:延伸5分钟。扩增片段大小为104bp，检测电泳图见附图4。获得整合并表达天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的转基因植株，转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T5代转基因纯合株系，对转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选。纹枯病抗性筛选采用江苏省农业科学院植物保护研究所提供的具较强纹枯病致病力菌株R3010接种，接种采用牙签接菌法(具体鉴定方法参照蔡士宾等，小麦抗纹枯病种质创新及QTL定位的初步研究，中国农业科学，2006，39(5):928-934)，将长1.OcM左右的牙签水浸30分钟后，铺于烧杯底部，加入适量PDA培养基，经高温湿热灭菌后，接种具有较强致病力的纹枯菌菌丝块，25t:恒温培养30天，待菌丝密集布满短牙签表面。小麦拔节期将经上述方法处理的牙签嵌入到小麦植株贴近地面的基部第12叶鞘之间，每株系接种15个茎秆，喷雾保湿7天。于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况，计算株系平均病情指数，根据病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。病情严重度判定标准如下0级无病症；1级叶鞘有典型的纹枯病病斑，但不侵茎；2级病菌侵人茎秆，病斑宽度环茎不超过茎秆周长的1/2;3级病菌侵人茎秆，茎秆上病斑环茎宽度在1/2-3/4茎秆周长之间；4级病菌侵人茎秆，茎秆上病斑绕茎秆3/4以上，或茎秆已软腐；5级枯孕穗或枯白穗。病情指数按以下公式计算病情指数=[(E各级病株数X各级代表值)/(总株数X最高级代表值)]X100纹枯病抗性判定标准病情指数《20为"高抗"；20<病情指数《50为"抗病"；50<病情指数《80为"感病"；80<病情指数《100为"高感"。纹枯病抗性鉴定结果见表l，受体对照亲本的病情指数为80.0，属高感类型，23个导入天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的T5代纯合株系的平均病情指数在21.0-46.0之间，都属于抗病类型，表明由于双价基因的导入，可以使转基因植株的纹枯病抗性得到大幅提高。表1扬麦158转基因T5代纯合株系的纹枯病抗性鉴定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序列表〈110〉江苏省农业科学院〈120〉一种提高小麦纹枯病抗性的方法〈130〉〈160>6〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉105〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉1atggttgtttgtgcatgtagacgtgcactttgttteccacgtgaacgtcgtgcaggtttt60tgtagaattcgtggtagaattcatccactttgttgtcgtcgttga105〈210>2〈211〉393〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>2atgagggtacggttgaattcgggccacc朋ggctacctattcateateg;aaaacgattgtgtetgggcatcagg朋cc朋cggaaaggccggcaacctccttetttetegcggtegcaggaacggteactactetctgatccttcagaga朋t朋tgcgatttgggc朋cccacacc朋ccacagc朋cggcacagcggcggcgtctggc〈210>3〈211>24〈212>DNA<213>人工序列〈400>3ctagcacaaggcggctecctattc〈210〉4〈211>24〈212>DNA<213>人工序列〈400>4gcagtgatttcagcatttccaacg〈210〉5〈211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5atggttgtttgtgcatgtag〈210>6〈211>20<212>DNA〈213〉人工序列〈400>6c朋cgacgac朋c朋3gtggcttgataccgggggctcEigtagc卿aggc60aatcttgtcttetetgateacaacagagcg120tetggctgtgtgctteagatgcag朋tgat180gc朋tetgggc朋gc朋cacc朋tcgcc朋240gatcgteacgtcgtcatetecgataattct300gttgg￡l￡l￡ltgctgaaatcactgccatccca360tgEl39324242020权利要求一种提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于以下步骤a、构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体pAHC-NP-GAFP；b、通过基因枪法将天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因表达载体pAHC-NP-GAFP导入受体小麦幼胚细胞；c、对所述的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株；d、对上述转基因待选植株进行分子检测，获得阳性转基因植株，阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T5代转基因纯合株系；e、对T5代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选；f、筛选出纹枯病抗性提高的转基因植株。2.根据权利要求1所述的一种提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于所述的天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体pAHC-NP-GAFP通过以下步骤获得A、制备质粒pAHC-NP:以pAHC25为基础质粒，采用限制性内切酶XbaI和BglII对pAHC25质粒DNA进行部分酶切，切除质粒含有的bar基因，0.8%琼脂糖电泳，回收9.1Kb左右DNA酶切大片段，以T4DNA连接酶与seql连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化后的大肠杆菌DH5a细胞悬液涂布含100mg/L氨苄青霉素的平板，对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC-NP;B、制备pAHC-NP-GAFP表达载体pAHC-NP质粒DNA采用限制性内切酶SmaI和SacI完全酶切，切除质粒含有的GUS基因，O.8%琼脂糖电泳，回收7.3Kb左右DNA酶切大片段，以!V)NA连接酶与Seq2连接，转化大肠杆菌，对抗100mg/L氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒，采用测序和酶切的方法验证连接的正确性，获得的质粒命名为pAHC-NP-GAFP即为天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体。3.根据权利要求2所述的一种提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于所述的seq1为ATGGTTGTTTGTGCATGTAGACGTGCACTTTGTTTACCACGTGAACGTCGTGCAGGTTTTTGTAGAATTCGTGGTAGAATTCATCCACTTTGTTGTCGTCGTTGA;所述seq2为ATGAGGGTACGGTTGAATTCGGGCCACCAACTTGATACCGGGGGCTCAGTAGCAGAAGGCGGCTACCTATTCATAATAGMAACGATTGTMTCTTGTCTTATATGATAACMCAGAGCGGTATGGGCATCAGGAACCAACGGAAAGGCCTATGGCTGTGTGCTTAAGATGCAGAATGATGGCAACCTCCTTATTTATAGCGGTAGCAGGGCAATATGGGCAAGCAACACCAATCGCCAAAACGGTAACTACTATCTGATCCTTCAGAGAGATCGTAACGTCGTCATATACGATAATTCTAATAATGCGATTTGGGCAACCCACACCAACGTTGGAAATGCTGMATCACTGCCATCCCACACAGCAACGGCACAGCGGCGGCGTCTGGCTGA。4.根据权利要求1所述的一种提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于所述的分子检测为PCR分析方法。5.根据权利要求1所述的一种提高小麦纹枯病抗性的方法，其特征在于抗小麦纹枯病的应用。全文摘要本发明涉及分子生物学领域，具体涉及通过采用基因工程方法将天麻的抗真菌蛋白基因和兔防御素基因导入常规小麦并表达，增加小麦的纹枯病抗性；一种提高小麦纹枯病抗性的方法，在于以下步骤构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体pAHC-NP-GAFP；通过基因枪法将pAHC-NP-GAFP导入受体小麦幼胚细胞，对小麦幼胚细胞愈伤诱导、植株再生，获得转基因待选植株，通过分子检测，获得阳性转基因植株，阳性转基因植株通过自交和PCR筛选，获得T5代转基因纯合株系；对T5代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选；筛选出纹枯病抗性提高的转基因植株。其优点在于与常规的种质培育方法相比，具有针对性强、培育周期短、对重要农艺性状影响小的特点。文档编号A01H1/02GK101696420SQ200910210538公开日2010年4月21日申请日期2009年11月9日优先权日2009年11月9日发明者任丽娟,余桂红,周淼平,孙晓波,张旭,张鹏,马鸿翔申请人:江苏省农业科学院;