专利名称：新的甲壳类动物雄腺激素的制作方法
新的甲壳类动物雄腺激素本发明涉及一种新的甲壳类动物雄腺激素。更特定地，本发明涉及一种产自斑节对虾的雄腺激素。本发明进一步涉及所述激素在影响对虾和虾类培养以及建立单性养殖中 的应用。本发明还涉及所述激素及其基因或基因片段在性别决定中的应用。虾类和对虾的养殖及贸易在全世界范围内都是一项很重要的活动。所培育的主要 品种为斑节对虾(Penaeus monodon)(斑筛对虾，珍宝对虾，珍宝虎虾，黑虎对虾，蓝虎对虾，
草虾......)，主要培育地在亚洲，2003年的水产养殖量为约600，000吨；还有南美白对虾
(白腿虾，白虾)，主要培育产区在美洲、中国和泰国，年水产养殖量与斑节对虾相当。对于 上述品种，水产养殖远重要于捕获。对水产养殖量日益增长的需求意味着在发展更有效的培育系统方面亦有日益增 长的压力。由于多数虾类品种均为性二型的(Hansford and Hewitt，1994)，人们在建立单性 养殖上付出了很多努力。在那方面，若干小组曾尝试建立可靠的性别标记物(Khamnamtong 等，2006)。可选地，单性养殖可经由雄腺体外分泌雄性激素获得，如US6740794中公开的那 样。尽管这可能是一种感兴趣的方法，但由于所述雄腺激素或编码它的基因的结构是未知 的这一事实，该方法受到一定限制。近来Manor等(2007)描述了一种胰岛素样基因，其仅 在雄性澳大利亚螯虾Cherax quadricarinatus的雄腺中表达。它也许是一个感兴趣的候 选基因，可能编码雄腺激素，但其作用尚未阐明。更进一步地，至今尚未知其在对虾或虾类 中的同系物。由于数据库中仅能获得有限数量的对虾和虾类序列，且种间同源性即使存在 其概率可能也较低，因此搜寻同源序列受到一定阻碍。令人吃惊地，在一项黑虎虾(斑节对虾物种)的基于AFLP的转录谱实验中，我们 鉴定出两个雄腺特异的DNA片段，它们分别与等足类动物‘雄腺激素’和螯虾‘胰岛素样雄 腺’因子同源。经由进一步的cDNA测序和RACE实验，我们鉴定出四个mRNA，称为PmAGHl、 PmAGH2、PmAGH3、PmAGH4，最有可能通过选择性拼接而源自单一基因。更令人吃惊的是，对遗 传上雌性的幼虾施用重组Pm_AGHl，Pm_AGH2, Pm_AGH3和/或Pm_AGH4处理有雄性化的效 果。遗传上雄性幼虾可经由dsRNA介导的Pm_AGHl，Pm_AGH2，Pm_AGH3和/或Pm_AGH4的击 倒而被雌性化。本发明的第一方面是一种分离的蛋白质，其选自由SEQ ID N0 3、SEQ IDN0 6、 SEQ ID N0 9和SEQ ID N0 12，或其突变型或变体组成的组。优选地，所述蛋白质分离自 对虾属，更优选地分离自斑节对虾。这里描述的突变型和变体是指在BLASTp (Altschul等， 1997)中测定为具有，至少50%—致性的突变型和变体。优选地，所述突变型和变体以其激 素作用(雄性化作用；或当其作为显性阴性化合物起作用时的雌性化作用)来衡量的话，在 生物学上是具有活性的。更优选地，所述突变型和变体仍保留有具有SEQ ID N0 3,SEQ ID N0 6、SEQ ID N0 9或SEQ ID N0 12的分离蛋白质的雄性化能力。本发明的另一方面是一种核酸片段，其编码本发明所述的蛋白质。此处使用的核 酸片段可以是任意核苷酸，包括但不限于信使RNA、单链DNA、双链DNA，包括基因组DNA，可 能含有其内含子-外显子组织。所述核酸片段的最简形式限定为编码序列，但其可包括其他序列，诸如但不限于5’和3’的非翻译序列，调节序列诸如启动子和终止子序列以及内含子。优选地，所述核酸片段包含SEQ ID N0 2、SEQ ID N0 5、SEQ ID N0 8或SEQ ID N0 11(编码序列)。本发明的又一方面是一种核酸片段，包括SEQ ID N0 1、SEQ ID N0 4、SEQ ID N。7或SEQ ID N。10(mRNA)或SEQ ID N。13 (gDNA)，或其补体，或其功能片段。此处使 用的功能片段，其非限制性的实例有可用作检测引物的片段，或可用作反义RNA或RNAi来 下调表达的片段。本发明的另一方面是本发明所述蛋白质在调节对虾或虾类性别比例中的应用。优 选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属，最优选地所述对虾 或虾类是斑节对虾。本发明的又一方面是一种本发明所述的核酸片段在改变对虾或虾类性别比例中 的应用。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属，最优选 地所述对虾或虾类是斑节对虾。本发明的又一方面是一种本发明所述的核苷酸序列在决定对虾或虾类性别中的 应用。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属，最优选地 所述对虾或虾类是斑节对虾。实际上，基于所述序列，本领域技术人员可以显而易见地获 得能用于测定雄腺特异性基因的基因表达的引物。本发明的又一方面是一种建立对虾或虾类单性养殖的方法，包括使用本发明所述 蛋白质和/或核酸。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾 属，最优选地所述对虾或虾类是斑节对虾。实际上，通过将蛋白质注射入幼小的后幼虫动物 体内，雌性可被转化为雄性。相应地，反义RNA、dsRNA和/或RNAi的表达和/或注射将抑 制雄腺特异性蛋白质的表达并导致动物的雌性化。可选地，抗体，优选单链抗体或骆驼抗体 或拮抗本发明蛋白质的抗体片段，诸如纳米体，可用于将对虾或虾类雌性化。使用纯化的蛋 白质或其片段生产抗体的过程是本领域技术人员熟知的。本发明的又一方面是一种建立对虾或虾类单性养殖的方法，包括使用本发明所述 核酸决定性别。优选地，所述对虾或虾类属于对虾科，更优选地所述对虾或虾类是对虾属， 最优选地所述对虾或虾类是斑节对虾。相应地，本发明所述蛋白质也可用于决定性别，特别 是与上文中拮抗本发明蛋白质的抗体联合使用。作为一个非限制性的例子，此类抗体可用 于ELISA实验中检测动物中存在的雄腺特异性蛋白质的浓度。
图1 编码雄腺激素的染色体DNA及其经由选择性拼接得到的信使RNA的示意图 概述。
实施例实施例的材料及方法样品制备从成年雄虾第五步足基部剖取组织，其中雄腺应处于这个位置。对照组织剖取自 雌虾的相同位置。肌肉样品取自成年雄虾和雌虾的尾部。所有样品立即用液氮速冻并保存在-70°C下直至RNA制备。cDNA-AFLP经速冻的雄腺样品(η = 4)，周围组织的对照样品(η = 2)和肌肉样品(η = 6)在液氮条件下用研钵和研棒粉碎。完整的RNA用TRIzol试剂(invitrogen)分离。RNA的质 量采用光谱(Nanodrop)和凝胶电泳来评定。高质量RNA(2. 5 μ g)采用生物素化的寡_dT 引物转化为双链cDNA。在纯化ds cDNA(Qiaquick PCR纯化试剂盒，Qiagen)后，采用凝胶 电泳分析质量和产率。AFLP模板通过使用BstYI对ds cDNA进行限制酶切消化来制备。3，端片段使用 抗生蛋白链菌素包衣的磁珠(Dynal)分离并用Msel.进一步消化。限制位点特异性的适配 体连接到片段末端。适配体-连接混合物被稀释两倍至总体积100 μ 1。采用在3’端有T(BstYI-T+0) 或C(BstYI-C+0)的BstYI特异性引物与Msel特异性引物的组合进行扩增，该扩增将片段 组分为二个。5 μ 1的600倍稀释的预扩增混合物的特异性扩增使用在3’端有一个附加的 选择性核苷酸的33P标记的BstYI-C/T引物与具有两个选择性核苷酸的Msel引物的组合进 行。在这一情况中，需要128个引物组合以筛选全套的转录片段。在扩增后，样品在5%的聚丙烯酰胺测序凝胶上进行分离。所述分离采用33P标记 的IObp大小的标准品。在跑胶并在whatmarm试纸上真空干燥后，将凝胶在磷荧光成像仪 下扫描。cDNA-AFLP片段的序列分析在将cDNA-AFLP片段从凝胶上切下以进行序列分析时，将凝胶置于Biomax MR放 射自显影照片上进行曝光。凝胶上覆盖有已显像的胶片，然后从凝胶上切下相关片段。DNA 用TE缓冲液(IOmM Tris,0. ImM EDTA)溶解并用选择性BstYI和Msel引物再扩增。扩增 采用凝胶电泳检查，且片段使用选择性BstYI或Msel引物直接测序。使用所得序列进行同源性检索在无多余蛋白序列数据库和内部编译的包含所有可得的无脊椎动物DNA序列的 DNA序列数据库中检索cDNA-AFLP片段序列的同源序列。采用内部开发的算法首先在蛋白 质数据库中检索已翻译的(共有6个可能的读码框)查询序列的同源序列(blastx检索)。 当未发现同源性时，则在无脊椎动物DNA数据库中检索同源DNA序列(bastn检索)。当鉴 定为与DNA序列具有同源性时，针对该hit进行blastx检索。当在无脊椎动物DNA数据库 中没有发现同源性时，进行tblastx检索，其中使用已翻译的查询序列在已翻译的DNA数据 库中搜索同源性。推定雄腺激素基因的RACE分析使用BD SMART RACE cDNA 扩增试剂盒(BD Bioscience)进行 cDNA Ends (RACE) 分析的快速扩增。源自雄腺组织的高质量RNA(Iyg)依照厂商说明书被转化为5’ RACE即 用的 cDNA 和 3，RACE 即用的 cDNA。5，和嵌套的 5，RACE 分别用 AGHRACE_Revl (5，-TATGAC AGAAACCGCCAGGGGAGAC-3，)和 AGHRACE_Rev2 (5，-AGGTACCGGGTCCTCGCAATACTCC-3，)引物 进行。3，和嵌套的 3，RACE 分别用 AGHRCE_Fwl(5，-CTGGCGGTTTCTGTCATATGCGATG-3，)禾口 AGHRACE_Fw2(5，-GTCTCCCCTGGCGGTTTCTGTCATA-3，)引物进行。仅有一个特定片段在 5，禾口 嵌套的5’ RACE中均进行扩增，而在3’和嵌套的3’ RACE中则有两个特定片段均进行扩增。片段由凝胶上分离出来并使用TOPOTA序列克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆。克隆片 段使用标准Τ7和SP6引物进行测序。使用软件包phredPhrap和consed (Ewing等，1998 ； Ewing和Green，1998 ；Gordon等，1998)对序列进行人工策划(curate)和组装。基于在RACE实验中获得的共有cDNA序列，设计引物用于全长型cDNA的扩增。正 向引物 AGHRT_3 (5，-ACACAGGACAGGGCAAGTTC-3，)和 AGHRT_1 (5，-TCCCTCCACAAAAACCACTC-3，)与反向引物 AGHRT_12 (5，-TCTGGGGCCTATTAATCGAA-3，)和 AGHRT_16 (5，-ACGTTCGGAAAA TCGAAAGAT-3’ )组合使用。PCR片段的大小依照从RACE实验所期望获得的大小而确定，所 述片段的测序确定了先前由RACE获得的序列。
推定雄腺激素基因的基因组测序使用弓I物 AGHFULL2_Fff(5' -GTGCTGCCACACACAGGAC-3‘)禾口 AGHPC3_ Fff (5 ‘ -GCACGCCCTCGTCAAG-3，)与引物 AGHFULL2_REV (5，-TCAAGAATTACTCTGGGGCCTA-3，) 的组合，以及引物 AGH_indell(5，-CCAGTACCGCCTGCATCC-3，)与引物 AGH_indel2 (5，-GGC TCACCAGGTGGTCTCT-3，)的组合，我们PCR扩增了基因组DNA上AGH基因的重叠片段。附 加的序列信息使用Genome Walker通用试剂盒(Clontech)获得。基因组DNA从若干雌虾 上分离出来并进行汇集。依照生产商说明书制备DNA库并分别使用引物AGHRACE_REV1和 AGHRACE_Fffl (见上文)进行初始的5’和3’扩增反应。嵌套扩增反应分别使用AGHRACE_ REV2和AGHRACE_FW2 (见上文)进行。部分基因组序列，包括mRNA序列的直至聚-A-尾端 的完整的3’ UTR区域，使用软件包phredPhrap和consed进行组装。推定雄腺激素基因的 克隆及重组蛋白表达全长编码序列在酵母宿主(毕赤酵母)上表达，以确保重组蛋白质的正确折叠和
糖基化。dsRNA 生成使用PCR 引物 AGH_CDS_T7Fw(5， -TAATACGACTCACTATAGGGATGCCCACTCAGCTGCT T-3，)禾口 AGH_CDS_T7_Rev(5，-TAATACGACTCACTATAGGGCTAAGGTACCGGGTCCTCG-3，)，我们生成 了两端都掺入 了一个T7启动子序列的PCR片段。该片段在使用MegascriptRNA试剂盒(Ambion)进行 dsRNA生成中用作T7RNA聚合酶模板。通过注射重组AGH反转幼年斑节对虾性别的实验每三天向若干组年轻的后幼虫动物(PL30-PL60)注射120ng重组AGH。组1接受 的注射覆盖PL30至PL60阶段。组2接受的注射覆盖PL30至PL45阶段。最后组3接受的 注射覆盖PL45至PL60阶段。在PL150时，表型性别由肉眼观察和组织学特征来确定，而基 因型性别则使用如PCT/EP2007/054041中公开的基于PCR的性别标记在DNA水平上进行测定。通过注射AGH特异性的dsRNA反转幼年斑节对虾性别的实验每三天向若干组年轻的后幼虫动物(PL30-PL60)注射0. 5 μ gAGH dsRNA。组1接 受的注射覆盖PL30至PL60阶段。组2接受的注射覆盖PL30至PL45阶段。最后组3接受 的注射覆盖PL45至PL60阶段。在PL150时，表型性别由肉眼观察和组织学特征来确定，而 基因型性别则使用如PCT/EP2007/054041中公开的基于PCR的性别标记在DNA水平上进行 测定。
实施例1 斑节对虾雄腺激素的鉴定针对雄腺组织样品(雄性；η = 4)，周围组织对照样品(雌性；η = 2)以及雌性和雄性肌肉样品(每组η = 3)分别进行了所有可能的cDNA-AFLP引物组合(128PC)的转录分 析。通过对cDNA-AFLP凝胶的肉眼观察，我们选取了 355个雄腺特异性片段。我们获得了这 些片段中254个(71.6%)的序列信息。同源性检索显示这些当中至少有47个(18.5%) 与细菌序列(痤疮丙酸杆菌)完全相同(blastx比对显示出至少75%的相同性)。这极有 可能是由于取样动物的雄腺存在细菌感染。两个cDNA-AFLP片段被发现与源自红爪螯虾(红螯螯虾属)的“胰岛素样雄腺因 子”同源BC4M21M263. 5 和 BC4M34M404. 4。RACE分析以及随后进行的的全长cDNA扩增和测序，其结果是鉴定出了四个cDNA 序列 PmAGHl (Seq ID N° 1), PmAGH2 (Seq ID N° 4), PmAGH3 (Seq ID N° 7)和 PmAGH4(Seq ID N0 10)。部分所述基因的基因组测序显示所有这四个cDNA均源自单一基因的选择性拼接。片段BC4M21M263. 5 对应于源自 PmAGHl 和 PmAGH3 的 234bp 的 BstH-Msel 限 制性酶切片段，而片段BC4M21M404. 4则对应于一个源自PmAGH2和PmAGH4的372bp的 BstYI-Msel限制性酶切片段。全cDNA序列的同源性检索显示在核苷酸水平无显著的同源性结果。在蛋白质水 平，则再次发现其与螯虾“胰岛素样雄腺因子”的同源性(32%相同性)，而在较小程度上， 其与源自等足动物armadillidium vulgare,porcelio scaber禾Plporcelio dilatatus 的雄 腺激素也有同源性(同源性在29%到26%之间)。实施例2 使用重组Pm_AGHl，Pm_AGH2， Pm_AGH3，和/或Pm_AGH4对幼年斑节对虾进行性别反转对幼年斑节对虾给予重组PenMon_AGHl和PenMon_AG2可将遗传学上雌性的虾雄 性化。实施例3 使用dsRNA介导的雄腺激素基因击倒对幼年斑节对虾进行性别反转给予靶向dsRNA的PenM0n_AGHl/2可击倒变体与经雌性化的遗传学上雄性的幼年 斑节对虾中的基因表达。参考文献-Altschul，S. F.，Madden, Τ. L.，Schaffer1 Α. Α.，Zhang, J.，Zhan, Ζ.，Miller, W. And Lipman,D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST :a new generation of protein database search programs. Nuc1. Acids Res. 25. 3389-3402.-Ewing,B. and Green,P. (1998) · Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome research 8,186-194.-Ewing, B. ， Hillier, L. ， Wende 1, Μ. C. and Green, P. (1998)Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome research 8，175-185.-Gordon, D. , Abajian, C. and Green, P. (1998) Consed :a graphical tool for sequence finishing. Genome research 8,195-202.-Hansford,S. W. and Hewitt,D. R. (1994). Growth and nut rient digestibility by male and female Penaeus monodon :evidence of sexual dimorphism. Aquaculture125,147-154.
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权利要求
一种分离的蛋白质，选自SEQ ID N°3，SEQ ID N°6，SEQ ID N°9和SEQ ID N°12，或其突变型或变体的组成的组。
2.—种核酸片段，编码权利要求1所述的蛋白质。
3.—种如权利要求2所述的核酸片段，其中所述片段包含SEQ ID N0 2,SEQ ID N0 5， SEQ ID N° 8 或 SEQ ID N° 11。
4.一种核酸片段，包含 SEQ ID N° 1,SEQ ID N° 4，SEQ ID N° 7 或 SEQID N° 10，或 其补体或其功能性片段。
5.如权利要求1所述蛋白质在改变对虾或虾类性别比例中的应用。
6.如权利要求5所述的蛋白质的应用，其中所述对虾或虾类属于对虾科。
7.如权利要求6所述的蛋白质的应用，其中所述对虾或虾类是斑节对虾(Penaeus monodon)0
8.如权利要求24任一项所述核酸片段或其功能性片段在改变对虾和虾类性别比例中 的应用。
9.如权利要求2-4任一项所述核酸片段或其功能性片段在决定对虾或虾类性别中的应用。
10.如权利要求8或9所述的核酸或其功能性片段的应用，其中所述对虾或虾类属于对 虾科。
11.如权利要求10所述的核酸或其功能性片段的应用，其中所述对虾或虾类是斑节对虾。
12.—种在对虾或虾类中建立单性养殖的方法，包括使用如权利要求1所述蛋白质。
13.一种在对虾或虾类中建立单性养殖的方法，包括使用如权利要求2-4任一项所述 的核酸片段。
14.一种在对虾或虾类中建立单性养殖的方法，包括如权利要求9所述的性别决定。
15.如权利要求12-14任一项所述的方法，其中所述对虾或虾类是斑节对虾。
全文摘要
本发明涉及一种新的甲壳类动物雄腺激素。更特定地，本发明涉及一种源自斑节对虾的雄腺激素。本发明还涉及所述激素在影响对虾及虾类养殖中的性别比例以及建立单性养殖中的应用。本发明还涉及激素及其基因或片段在性别决定中的应用。
文档编号A01K67/033GK101969981SQ200980107958
公开日2011年2月9日 申请日期2009年3月5日 优先权日2008年3月5日
发明者F·范布罗赛格姆, J·斯塔埃郎, M·维尔斯特克 申请人:弗拉芒区生物技术研究所;根特大学;比利时穆阿纳股份有限公司