专利名称：对于糖尿病的动物模型的制作方法
对于糖尿病的动物模型本发明涉及产生一种糖尿病小鼠的方法，这种小鼠可以用在鉴别可以逆转糖尿 病并且适合用于糖尿病及其并发症的介入治疗的化合物的方法中。在过去的几十年中已经见证了，肥胖症(obesity)和2型糖尿病 (type-2-diabete) (T2D)的流行剧烈增长，主要在美国并且还有在欧洲和发展中国 家发展。在世界各地，T2D代表了 85-90 %的所有糖尿病例(遗传的胰岛素依赖 性糖尿病(inherited insulin-dependent diabete)或TlD以及非胰岛素依赖性糖尿病 (non-insulin-dependent-diabetes Mellitus)或 T2D)。虽然一些突变影响了 瘦蛋白途径， 已经鉴别了胰岛素分泌物或其受体、或GLUT4(对胰岛素敏感的葡萄糖运输)，肥胖症和 T2D的大多数情况是非遗产来源的并且由生活方式(身体活动的减少，高卡路里饮食等 等)引起。T2D和肥胖症两者都关联了高的发病率、死亡率以及医疗保健成本，这是由 于它们的微血管以及大血管并发症。T2D的主要特征是胰岛素抗性以及胰岛素分泌缺陷。胰岛素是由胰岛β细胞合 成并且分泌的关键激素，这种激素刺激了葡萄糖在各种器官(特别是肌肉、肝脏、以及 脂肪组织)中的吸收。胰岛素通过控制编码葡萄糖-6-磷酸酶的基因的表达还调节了肝 糖生成(HGP)，并且抑制了脂肪组织中的脂肪分解。当目标组织不能对正常浓度胰岛素 作出反应时，发生受损的胰岛素功能(即胰岛素抗性)。
一旦开始了这种失调并且在缺少治疗下，β细胞分泌了增加量的胰岛素(=血 胰岛素过多症)以维持血糖正常(正常循环的葡萄糖水平)。然而，在缺少治疗下，β细 胞不能产生足够的胰岛素，导致了循环葡萄糖的增加(高血糖症(hyperglycaemia))。只 要足够的β细胞是有生存力的，并且会分泌适当速率的胰岛素以维持血糖正常，T2D不 会发生。很多集团在过去的几十年中已经广泛探究了导致胰岛素抗性的机制。所广泛接 受的是，游离脂肪酸(FFA)在胰岛素敏感的非脂肪组织(肝脏&肌肉)中的积累可以损 害在这些组织中的胰岛素介导的葡萄糖吸收。而且，通过肝脏的增加的脂类产生增强了 脂肪酸氧化作用，降低了肝脏葡萄糖产生的胰岛素依赖性抑制并且因此增加了糖异生作 用(gluconeogenesis) (GNG)，进一步恶化了高血糖症。T2D的发展与其他代谢紊乱相关联。胰岛素抗性簇、受损的葡萄糖耐受、动脉 高血压、腹部肥胖以及血脂障碍(dyslipidemia)，称为代谢性综合征(综合征X)，已经 被成人治疗组IlKAdult Treatment Panel III) (ATPIII)定义为构成主要的心血管危险的基础 的一组因素。许多临床前研究显示出胰岛素在T2D患者中的高血压的发展中起到主要作 用。然而，临床护理的首要焦点是诊断并且治疗在葡萄糖代谢中的异常情况。的确，如 由英国前瞻性糖尿病研究(UKProspective Diabetes Study) (UKPDS, 1998)所报道，高血 糖是微脉管系统并发症的一个主要危险因素。显示出，在T2D患者中，接近正常的葡萄 糖水平的维持预防了如神经病变(neuropathy)(发生在50%至60%的T2D患者中)、视网 膜病(retinopathy)以及肾病(nephropathy)(糖尿病在美国是盲和末期肾功能衰竭的最重要 原因)的缺陷的发作。来自噻唑烷二酮(thiazolidinediones) (TZDs)类(自从I"7，在美国可得)(现在由罗格列酮(Rosiglitazone) ( Avandia )、吡格列酮(Pioglitazone) ( Actos )、以 及曲格列酮(Troglitazone) (Rezulin )代表)的抗糖尿病药物在提高外周的胰岛素介 导的葡萄糖吸收中是有效的药物。TZDs是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-Y)的 药理学激动剂，过氧化物酶体增殖物激活受体是核激素受体家族的转录因子，其控制了 在葡萄糖和脂类代谢中的基因表达。PPAR-Y药物通过增加前脂肪细胞分化并增殖成 为成熟的脂肪细胞，减少了高血糖症、高血脂症(hyperlipidemia)以及血胰岛素过多症 (hyperinsulinemia)并且改进了胰岛素敏感性，尤其在外周脂肪贮藏所。因此，PPAR-Y 激活增加了外周脂肪细胞中的脂肪酸贮藏，降低了循环的脂肪酸并且减少了肌肉和肝脏 中的甘油三酯。PPAR-Y药物改变了一些循环因子的表达，所述循环因子如脂连蛋白、 TNFa以及抵抗素，它们的水平与胰岛素抗性以及治疗响应高度相关。T2D以及胰岛素抗性的适当动物模型是用于表征治疗剂体内疗效的基本临床前 工具。在过去的20年中已经开发的大部分T2D动物模型是基于遗传突变。在药物发现 中，自发糖尿病(或胰岛素抗性和肥胖)啮齿动物模型如db/db以及ob/ob小鼠，GK， ZDF以及fa/fa大鼠在世界范围内是最通常使用的。由于这种快速的代谢恶化，在ZDF大鼠中T2D的主要特征的复原不能通过市场 化的抗糖尿病药(罗格列酮(Rosiglitazone) (PPAR- Y )以及 Raziglitazar (PPAR α γ))来 达到的。然而，显示出，在慢性治疗下的ZDF大鼠(13周)(Shibata etal.，2000)中或在 非常幼小的并且仅仅适度糖尿病动物(Brand etal.，2003 ； Pickavance etal., 2005)中达到 了 T2D的预防。一个团队报道了，在被使用DPPIV抑制剂的介入治疗使用的轻微不同 的 T2D 模型(称为 VDF 大鼠(Vancouver Diabetic Fatty,源于 Zucker 和 fa/fa 品系)中， 能够部分地改进葡萄糖耐受、外周胰岛素敏感度、以及β细胞功能。已经注意到，这种 模型不是糖尿病的，其特征在于不存在高血糖症、弱的葡萄糖无耐受力并且没有外周胰 岛素抗性。本发明的目标在于开发对于胰岛素抗性、肥胖症、2型糖尿病及其并发症的动物 模型，所述动物模型克服了在现有技术中描述的动物模型的至少一些缺点，主要是突变 的途径对目标途径的潜在干扰，即瘦蛋白途径或其他。本发明的一个目的在于提供产生对于胰岛素抗性、肥胖症、2型糖尿病的非人动 物模型的方法。所述方法包括以下步骤用高脂肪高糖饮食饲养大约9周龄的小鼠大约 20周。 在一个优选的实施方案中，所述小鼠是雄性小鼠。在另一个优选的实施方案中，所述小鼠是C57BL/6J小鼠。在另一个优选的实施方案中，高脂肪高糖饮食的饲养进行了大约22周。在另一个优选的实施方案中，该小鼠处于正常食物饮食直到开始饲养高脂肪高 蔗糖饮食。在又一个优选实施方案中，所述食物饮食包括KLIBA 3436饮食。图4中给出了 KLIVA 3436饮食的详细组成。在另一个优选的实施方案中，所述高脂肪高糖饮食是定制的SSNIFFD12492改 进的60%千卡脂肪饮食。图5中给出了 SSNIFF D12492改进的60%千卡饮食的详细组 成。
在第二个方面，本发明提供了用于产生对于2型糖尿病并发症的非人动物模型 的方法，所述方法包括用高脂肪高糖饮食饲养大约9周龄的小鼠大约30周。用高脂肪高 糖饮食饲养了大约30周的小鼠是对于胰岛素抗性、肥胖症、2型糖尿病以及2型糖尿病并 发症的合适的动物模型。在一个优选的实施方案中，高脂肪高糖饮食的饲养进行了大约32周。在第二个方面，本发明提供了鉴别和/或测试用于治疗2型糖尿病和/或其并发 症的化合物的方法。所述方法包括向由本发明的方法产生的小鼠给予目的化合物并且确 定糖尿病和/或至少一种2型糖尿病并发症是否由所述化合物逆转的步骤。术语“2型糖尿病并发症”包括疾病如心血管病、视网膜病、神经病变、肾病以 及NAFLD (非酒精性脂肪肝病)。在用于鉴别和/或测试用于治疗2型糖尿病的化合物的方法的示例性实施方案 中，向根据本发明产生的小鼠给予候选化合物，任何在所述小鼠中测量与胰岛素抗性、 肥胖和/或2型糖尿病相关的指示值(例如，血糖水平、或在血液或其他组织中的胰岛 素水平)。此后，将得到的指示值与对照动物的指示值相比。基于比较的结果，证实所 述候选化合物是否能够缓解或消除2型糖尿病的症状。具体地，测量被给予了候选化合 物的本发明的小鼠的血糖水平。当所测量的血糖水平比对照动物(没有与所述候选化合 物接触)的血糖水平低时，所述候选化合物可以被选定为用于治疗2型糖尿病的一种治疗 剂。而且，可以测量被给予候选化合物的本发明的小鼠的胰岛素水平，作为与胰岛 素抗性、肥胖症和/或2型糖尿病相关的指示值。当所测量的胰岛素水平比对照动物(没 有与所述候选化合物接触)的胰岛素水平低时，所述候选化合物可以被选定为用于治疗2 型糖尿病的治疗剂。本发明的动物模型允许测试化合物治疗与2型糖尿病相关的并发症(例如肾毒性 以及NAFLD)的能力，原因在于本发明的小鼠发展了与2型糖尿病相关的并发症(例如 肾毒性以及NAFLD)。例如，通过确定化合物是否能恢复和/或减轻由本发明的动物发 展的2型糖尿病并发症(例如肾毒性和NAFLD)，可以检测测试化合物治疗如上所述2型 糖尿病的能力以及它治疗与2型糖尿病相关的并发症的能力。候选化合物的实例包括肽、蛋白质、非肽化合物、合成的化合物、发酵产物、 细胞提取物、细胞培养上清液、植物提取物、组织提取物以及哺乳动物(例如小鼠、大 鼠、猪、牛、绵羊、猴子、人等等)的血浆。这些化合物可以是新的化合物或已知的化 合物。这些候选化合物可以形成盐。候选化合物的这些盐的实例包括与生理上可接受的 酸(例如有机酸以及无机酸等)或与碱(例如金属盐等)的盐。特别地，生理上可接受 的酸式加成盐是优选的。这些盐的例子包括与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸 等)的盐、或与有机酸(例如乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠 檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸等等)的盐。在第三个方面，本发明提供了本发明的小鼠用于鉴别和/或测试用于治疗2型糖 尿病和/或其并发症的化合物的用途。附图简述
图1展示了用高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠的体重相对于用食物饮食饲养的小鼠的体重。可以看出高脂肪/蔗糖饲养的小鼠发展了肥胖症，图2展示了高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠的血糖浓度相对于食物饮食 饲养的小鼠的血糖浓度。可以看出高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠发展了空腹 高血糖，图3展示了在19-22周特殊饮食后相对于在食物饮食下对比的小鼠空腹血浆胰岛 素水平(DIO =饮食诱导的肥胖症)。可以看出高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠 发展了空腹血胰岛素过多症(hyperinsulinemia)，图4展示了 KLIBA 3436饮食的组成，图5展示了 SSniff EF M D12492mod.60%脂肪能量饮食的组成，图6a展示了 42周龄DIO小鼠(高脂肪饮食)的肝脏的H&E染色。可以看出 高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠发展了严重的肝脂肪变性(steatosis)，图6b展示了 25周龄的食物饮食饲养的小鼠(对照)的肝脏的H&E染色，图7a展示了 42周龄DIO小鼠(高脂肪饮食)的肝脏的天狼星红染色(Sirius red staining),图7b展示了 25周龄的食物饮食饲养的小鼠(对照)的肝脏的天狼星红染色，可 以看出高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠发展了严重的肝纤维化，图7c展示了 42周龄DIO小鼠(高脂肪饮食)的肝脏的马森三色染色(Trichrome Masson staining)。可以看出高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠发展了严重的肝脂 肪变性，图8a展示了 42周龄DIO小鼠(高脂肪饮食)的肾脏的H&E染色。可以看出高 脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠发展了严重的肾小球肥大(glomerular hypertophy) 以及系膜膨胀(mesangial expansion),图8b展示了 25周龄的食物饮食饲养的小鼠(对照)的肾脏的H&E染色，图8c展示了 42周龄DIO小鼠(高脂肪饮食)的肾脏的H&E染色。可以看出 高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠发展了严重的肾小球硬化，图8d展示了 25周龄的食物饮食饲养的小鼠(对照)的肾脏的H&E染色，图8e展示了 42周龄DIO小鼠(高脂肪饮食)的肾脏的马森三色染色。可以看 出高脂肪/蔗糖(HF-HS饮食)饲养的小鼠发展了严重的肾脏炎症，并且图8f展示了 25周龄的食物饮食饲养的小鼠(对照)的肾脏的马森三色染色。实验部分在小鼠中引入糖尿病以及肥胖症-小鼠的供应商CharlesRiver Germany-背景雄性C57BL/6J小鼠-居住条件标准的-12小时光周期，-饮食正常的食物饮食直到9周龄，然后动物处于高脂肪高蔗糖(HF-HS)(能 量60%来自脂肪，20%来自糖-SSNIFF Dl2492mod.)下持续14周并且在23周龄转移 至丨J Roche。-适应周期在Roche的6-20周中，动物维持HF-HS饮食-痩的对照动物10只动物的组保持在标准食物饮食KLIBA3436下
-对于实验准备好的29-31周龄的或42周龄的动物用于糖尿病并发症的研究-在实验阶段维持HF-HS饮食在DIO小鼠中的NASH非酒精性脂肪肝病(NAFLD)估计影响了至少四分之一美国人群并且是异常肝 功能的最常见原因。NAFLD可能起因于作为代谢综合征的成员的肝脂类代谢的调节异 常，它共同地表示为内脏肥胖、血脂障碍(dyslipidemia)、动脉硬化(atherosclerosis)、 以及胰岛素抗性。虽然对于多种情况下的良性预后，NAFLD可以进展至非酒精性 脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化(liver fibrosis)、肝硬化(cirrhosis)、以及肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma)，并且NAFLD-至-NASH的转变机制的理解尚是难懂的。伴随 慢性炎症的脂类代谢的异常是动脉硬化和NASH的发展的中心途径。的确，已经提出了
“二次打击”理论，并且在NAFLD患者中促成NASH的与脂类和胆固醇代谢以及炎症有 关的第二敏感性因素的识别在这种疾病的治疗中是一个重要步骤。对NAFLD和NASH 进展的敏感性可以包括遗传变异、传染、环境暴露、以及饮食贡献，它可以导致慢性炎 症和/或氧化应激。通过组织学评价在42周龄DIO小鼠对25周龄DIO小鼠以及25周龄食物饲养的 瘦小鼠的肝脏中观察到以下损伤(参见图6和7):·中等程度至严重扩散性大血管肝细胞性空泡化，它与扩散性大血管脂类沉积 相关(通过脂肪染色而证实)(图6a对图6b)·最小至轻微胆管以及肝巨噬细胞增生(图6a对图6b)·最小至显著的单核炎症细胞的浸润(图6a对图6b)·最小至中等纤维化(由天狼星红和马森三色染色而证实)(图7a和7c对7b)表 1
42周龄DIO小鼠中的NASH 在DIO小鼠中的相关肝脏变化的发生25周龄 食物25周龄 DIO42周龄 DIO胆管增生0/100/107/10肝巨噬细 胞增生0/100/105/10脂类沉积， 大血管的， 扩散0/108/107/10浸润，单核 的5/107/108/10纤维化1/102/1010/10
在DIO小鼠中的糖尿病性肾病糖尿病性肾病是由肾小球中的毛细管的血管病引起的进行性肾病。其特征在于 肾病综合征以及结节性肾小球硬化(glomerulosclerosis)。它是由于长期的糖尿病，并且在 许多西方国家是对于透析的首要原因。由于2型糖尿病现今会在较小的年龄发生，同样 预期患者在通常的较大年龄(50岁与70岁之间)之前会发展肾病。该病是进行性的并且 可能在初始损伤后2或3年引起死亡，并且在男性中是更频繁的。糖尿病性肾病在美国是 慢性肾功能衰竭以及末期肾病的最常见原因。患有1型和2型糖尿病两者的人是处于危 险的。如果血糖水平被较差地控制，这种危险是更大的。另外，一旦肾病发展了，进行 的最大速率见于他们的血压受到不足控制的患者中。同样地，在他们的血液中具有高胆 固醇水平的人比其他人具有更大的危险。糖尿病性肾病继续变得逐渐更重。当由糖尿病 引起时，比起其他原因，慢性肾功能衰竭的并发症更可能更早出现，并且进行更快。一 旦发展了末期肾病，透析可能是必要的。在这个时期，必须考虑肾移植。甚至在开始透 析之后或在移植之后，患有糖尿病的人比不患糖尿病的人倾向于情况更严重。治疗的目标是放慢肾损伤的进行并且控制相关的并发症。一旦确定了蛋白尿， 主要可用的治疗是ACE抑制剂以及血管紧张肽受体阻滞剂，它们通常降低了蛋白尿水平 并且放慢了疾病的进展，但是具有一些问题。关键问题是，虽然是有效的治疗，在患有 糖尿病性肾病的患者中对于ESRD(末期肾病)的剩余风险还是高的(大约16%)。如果 一种新药通过延迟肾小球硬化可以提供一种实质上相对的风险减小，这还会导致主要的 绝对风险减小。对于以更有效地方式预防或减慢糖尿病性肾病的发生的药物以及对于被更好地 耐受的并且具有更少的不良作用的治疗存在极大的医学需要。通过组织学评价在42周龄DIO小鼠对25周龄DIO小鼠以及25周龄食物饲养的 瘦小鼠的肾脏中观察到以下损伤(参见图8)·最小至轻微的肾小球肥大(图8a对图8b)·最小至显著的系膜膨胀(图8c对图8d)·最小至轻微的肾小球硬化(图8c对图8d)·最小至中等的单核炎症细胞的浸润(图8e对8f)表2
DIO小鼠中的糖尿病性肾病 相关肾脏变化的发生25周龄 食物25周龄 DIO42周龄 DIO肾小球肥 大0/103/104/10
8
系膜膨胀3/108/1010/10肾小球硬 化0/100/104/10浸润，单核 的4/107/109/10 虽然在此展示并且描述了本发明的优选实施方案，所清楚地理解的是，本发明 不限于此并且另外地在以下权利要求的范围内可以是不同地实施并实践的。
权利要求
1.产生关于胰岛素抗性、肥胖症以及2型糖尿病的非人动物模型的方法，包括用高脂 肪高糖饮食饲养大约9周龄的小鼠大约20周。
2.权利要求1所述的方法，其中所述小鼠是雄性小鼠。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述小鼠是C57BL/6J小鼠。
4.权利要求1至3所述的方法，其中高脂肪高糖饮食的饲养进行大约22周。
5.权利要求1至4所述的方法，其中所述小鼠处于正常食物饮食直到开始饲养高脂肪 高蔗糖饮食。
6.权利要求5所述的方法，其中所述食物饮食包括KLIBA3436饮食。
7.权利要求1至6所述的方法，其中所述高脂肪高糖饮食是定制的SSNIFFD12492改 进的60%千卡脂肪饮食。
8.权利要求1至7的方法，用于产生关于2型糖尿病并发症的非人动物模型，所述方 法包括用高脂肪高糖饮食饲养小鼠大约30周。
9.权利要求8所述的方法，其中高脂肪高糖饮食的饲养进行大约32周。
10.鉴别和/或测试用于治疗2型糖尿病和/或其并发症的化合物的方法，包括向由 权利要求1至9中所述的方法产生的小鼠给予目的化合物和确定糖尿病和/或至少一种其 并发症是否由所述化合物逆转的步骤。
11.权利要求1至9所述的小鼠用于鉴别和/或测试治疗2型糖尿病和/或治疗与2 型糖尿病相关的并发症的化合物的用途。
12.如前所描述的发明。
全文摘要
本发明提供了产生糖尿病小鼠的方法及其在药物开发中的用途。
文档编号A01K67/027GK102014614SQ200980115972
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月27日 优先权日2008年5月6日
发明者斯特凡妮·托佐 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司