用于治疗的gm-csf和il-17抑制剂的制作方法

专利名称：用于治疗的gm-csf和il-17抑制剂的制作方法
用于治疗的GM-CSF和IL-17抑制剂本发明涉及炎性疾病的治疗。本发明的另一方面涉及肿瘤性疾病(如癌症)的 治疗。本发明的另一方面涉及一种用于治疗炎性和/或肿瘤性疾病的药物组合物。根据 本申请提交地的法律，本发明同样可能涉及两种特殊物质在制备用于治疗上述疾病的药 物中的用途。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，最初被确定为一种造血细胞生长因 子，最近被表明为一种在炎症和自身免疫中的重要细胞因子。在包括过敏和银屑病患 者、关节炎和哮喘患者中的各种炎性部位中检测到高水平的GM-CSF mRNA或蛋白质。在过去的几年来，许多体内研究表明，通过中和抗体阻断GM-CSF能够在一系 列炎症模型中(包括在关节炎实验性自身免疫性脑炎、银屑病和肺部疾病模型中)预防 甚至治愈促炎性疾病。GM-CSF通过刺激成熟中性粒细胞和巨噬细胞的增殖和活化，在 先天免疫中起着重要的作用。另外，已证明GM-CSF通过体外调节树突细胞的分化和成 熟在抗原呈递反应中的关键作用。已有报导GM-CSF在体内通过人类外周血单核细胞 (PBMC)、T细胞和抗原呈递细胞(APC)优先诱导I型促炎性细胞因子。白介素17(IL_17)是一类获得性免疫系统细胞因子家族，目前主要由六个成员组 成，从IL-17A到IL-17F。据描述，IL-17与IL-17受体结合，IL-17受体家族目前包含 五个成员，IL-17RA到IL-17RE，它们相互之间共享相当大的序列同源性。IL-17受体家 族成员是I型跨膜蛋白。目前人们一般认可IL-17受体在所有免疫系统细胞中大量表达， 并且对含IL-17A、IL-17F和IL-17D的不同细胞类型进行刺激可以诱导其它细胞因子如 IL-I β、TNF α和IL_6和趋化因子IL_8和MIP-I α的表达。与其受体相反，IL-17主 要由近来发现的Thl7细胞产生，并且其表达经常与感染和自身免疫相关。类风湿性关节炎(RA)是一种慢性的、炎性和系统性自身免疫疾病。尽管RA的 病因和发病机制仍然不完全清楚，这种疾病被表征为是侵袭性滑膜增生(血管翳形成)和 炎症(滑膜炎)，这导致渐进性关节软骨和骨骼的破坏。RA是由属于先天性和获得性免 疫系统中的许多细胞类型和因子之间的复杂相互作用导致的。例如，已报导在RA病人 中观察到不同细胞因子表达的普遍提高，如IL-2、IL-4、IL-5、IL_7、IL_10、IL-13、 IFN Y、G-CSF、GM-CSF > MCP-1禾Π MIP-1 β与对照组相比有高得多的表达水平。此 外，已经确认IL-1、TNFa和IL-18是RA中刺激T细胞的重要炎性因子。已发表报导提 出了一种在RA中GM-CSF的致病作用的假说。支持该假说的证据如下(i)GM-CSF是 在RA病人的滑膜中产生，并且可以在病人的滑液中检测到该细胞因子表达水平的增加； (ii)在胶原诱导的关节炎小鼠模型(CIA)中，使用中和抗GM-CSF单克隆抗体(mAb)可 以降低疾病的严重程度；(iii)GM-CSF缺陷小鼠对于胶原和mBSA诱导疾病的敏感性降 低；Gv)在CIA小鼠中注射重组GM-CSF可以使疾病恶化；(ν)化疗后接受GM-CSF的 RA患者表现出显示关节炎严重程度的潮红。除了上述已鉴定的不同细胞因子，IL-17也显示与RA病理学相关，因为IL_17 在RA滑膜和滑液中表达水平提高，并且在实验模型中，IL-17的阻断可以减轻关节炎 中的炎症和破坏。另外，IL-17基因缺陷小鼠表现出胶原诱导关节炎的抑制，并且当将IL-17-/"小鼠与IL-IRa-/-小鼠交配时，IL-17-/-小鼠完全缺乏在IL-I受体拮抗剂缺陷 Balb/c小鼠中通常看到的多关节炎自发启动。还已报导在小鼠体内试验中，IL-17加上 TNFa的局部共同刺激可以通过影响中性粒细胞的招募和生存，导致中性粒细胞在呼吸 道中的GM-CSF依赖性聚集。已在小鼠中使用的用于研究人的类RA疾病的模型之一为链球菌细胞壁(SCW) 关节炎。在所述模型中，向小鼠的一个膝关节中通过关节内(La.)注射细菌细胞壁片段 可以同时诱导急性疾病和慢性复发性关节炎。通过向幼龄小鼠的膝关节中一次注射SCW 片段，可以获得先天免疫起主要致病作用的急性关节炎。通过重复关节内注射SCW片 段，可以建立慢性复发性关节炎模型，其中获得性免疫系统中的介质逐渐取代了先天免 疫反应的最初优势。胶原诱导的关节炎(CIA)是另一种广泛接受的关节炎模型，其基于 对抗软骨胶原II型(CII)的T细胞和抗体介导的自身免疫活性。该小鼠模型与人RA具 有一些临床、组织病理和免疫原性上共同的特点，其主要特征为在滑液炎症之后有严重 的软骨及骨组织的破坏。本发明人在TNF α无关的慢性SCW炎症模型和TNF α依赖的 CIA模型中探索了中和GM-CSF的治疗效果。另外，他们也研究了通过抑制GM-CSF 和IL-17通路阻断先天性和获得性免疫系统的影响。这是通过在IL-17受体基因缺陷小 鼠(IL-17R-KO小鼠)中中和GM-CSF，或是通过使用中和GM-CSF和IL-17的化合物 进行联合治疗来执行的。发明人意外观察到，通过联合阻断GM-CSF和IL-17通路， 两种炎性疾病均能以高效方式治疗。在CIA模型中，联合施予GM-CSF抑制化合物和 IL-17抑制化合物可以极大降低胶原诱导的关节炎的临床评分，而单独施予给药GM-CSF 抑制化合物或IL-17抑制化合物不能显著减轻关节炎的严重程度。此外，详细的组织学 分析表明，对关节炎症和软骨及骨破坏的联合治疗有着协同效应。因此，对两条通路的 联合阻断可以导致对炎症和关节破坏的高效保护。这些结果特别让人意外，这是因为直 到最近还假设GM-CSF处于IL-17的下游(参见文献Kawaguchi M.et al.，J.Allergy Clin. Immunol. 114 (2004)，444-450 ； Starnes T.et al., The Journal of Immunology 169 (2002)， 642-646 ; Laan M.et al.，Eur.Respir.J.21 (2003)，387-393)。因此，人们尚未预期到结合 了中和GM-CSF和IL-17的化合物的治疗会有额外或协同的效果。本申请首次表明了体 内联合阻断IL-17和GM-CSF的有益效果。本申请所示数据强烈支持这样一个观点，抗 GM-CSF和抗IL-17的联合治疗不只在RA中同时还在其它自身免疫和炎性疾病(如下文 所述定义)情况中有非常重大的治疗效果。因此，本发明所述的药物方法和手段特别针对关节炎的治疗，但也可能用 于其它炎性疾病，包括多发性硬化症、银屑病和肺部炎症如哮喘和慢性阻塞性肺病 (COPD)。定义本文所用术语“个体”指的是动物。术语“动物”包括但不限于哺乳动物， 如实验性动物(啮齿动物，如大鼠、豚鼠、仓鼠或小鼠；非人类灵长类动物，如食蟹猴 或猕猴)、家畜或宠物(如狗或猫)、农场或农业动物(如牛、绵羊、山羊和猪)、和/或 人。优选地，所述动物为人或非人类灵长类动物。本文所用术语“GM-CSF”代指人(智人(Homo sapiens))或非人类灵长类动物 的GM-CSF (如文献中定义)，并且包括其变体(同系物)。本术语也包括人和非人类灵长类动物的GM-CSF受体及其变体(同系物)。特别优选的非人类灵长类GM-CSF或非 人类灵长类GM-CSF受体的变体(同系物)包括长臂猿(nomascus concolor,也称为西黑 冠长臂猿)和猕猴属家族(如恒河猴(Macacamulatta)和食蟹猴(Macacafascicularis))的 GM-CSF受体及其变体(同系物)。本文所用术语“结合GM-CSF或GM-CSF受体的抗体”或其功能片段，包括具 有结合动物GM-CSF或GM-CSF受体能力的任何抗体或抗体片段。特别地，它包括在 人类和至少一种上述猴子物种中表现出交叉反应性(在结合GM-CSF或GM-CSF受体方 面)的任何抗体或其功能片段。例如，所述抗体或其功能片段能够结合(和中和)人类 GM-CSF和食蟹猴(Macaca fascicularis) GM-CSF。这对于要向人类个体治疗性施予抗体 分子是尤其有益的，这是因为这种抗体通常在进行行政审批前必须经过大量试验，其中 某些早期试验涉及非人动物物种。进行这些试验时，一般希望用与人遗传上高度相似的 非人物种(如，非人类灵长类如食蟹猴)，这是因为由此获得的结果一般将高度预示出将 相同分子向人给药时可预期的相应结果。可是，这种基于动物试验的预测能力至少部分 取决于分子的相似性，并且如果由于物种交叉反应性可将相同的治疗分子向人和动物给 药，其预测能力就非常高。相应地，如果抗体分子对人和其它物种中的相同抗原能交叉 反应，就可以使用在人和其它物种(例如上述猴物种中的一种)中相同的抗体分子进行试 验。这增加了试验本身的效率以及这些试验对这些抗体在人(从治疗角度最终兴趣所在 的物种)中行为的预测能力。本文所用术语“结合GM-CSF或GM-CSF受体的抗体”还包括具有这种结合能 力的GM-CSF或GM-CSF受体的单克隆抗体或其功能片段。本发明第一个方面涉及一种在患有炎性疾病的个体中治疗炎性疾病的方法，所 述方法包含施予中和GM-CSF的化合物(简述为GM-CSF抑制化合物)和中和IL-17的 化合物(简述为IL-17抑制化合物)。根据技术人员公知的参数，所述化合物可为一种组 合物的部分，或者它们可为分开的药物。所述方法的优选实施方案如下(a) —种方法，其中在施予中和IL-17的化合物之前或之后对个体施予中和 GM-CSF的化合物，或者同时施予两种化合物；(b)根据本发明的第一个方面或(a)所述的方法，其中所述治疗个体为上述定义 的动物；(c)根据本发明的第一个方面或(a)或(b)的方法，其中GM-CSF中和化合物为 多肽、模拟肽、核酸或小分子；(d)根据(c)所述的方法，其中所述多肽为结合GM-CSF或GM-CSF受体的抗 体或其功能片段；优选地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段；(e)根据(d)所述的方法，其中所述抗体为人类单克隆抗体或其功能片段；(f)根据(d)或(e)所述的方法，其中所述抗体或其功能片段结合于人类和非人 类灵长类动物GM-CSF的表位。所述表位优选为人类和非人类灵长类动物GM-CSF的 不连续表位，所述表位优选为包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位 (GLR/QGSLTKLKGPL)。第65-77位氨基酸序列段中第67位的变异性反映出在作为一 方面的人和长臂猿GM-CSF (其中第67位为R)与作为另一方面的猕猴科猴子(例如食蟹猴和恒河猴)GM-CSF (其中第67位为Q)之间GM-CSF的这个位置的异质性；(g)根据(f)所述的方法，其中所述不连续表位进一步包含氨基酸第28-31位 (LSRD)，氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(h)根据(e)、(f)和(g)中任一所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能 片段在其重链可变区包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13或56所示氨基酸序 列中的任一个；(i)根据(h)所述的方法，其中所述重链可变区CDR3序列中的任一个与SEQ ID NO 14所示重链可变区CDRl序列和SEQ ID NO 15所示重链可变区CDR2序列一起
存在于重链可变区；(j)根据(h)或(i)所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序 列，CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基
酸序列；(k)根据(j)所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区进一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；⑴根据(h)或(i)所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重 链可变区包含如SEQ IDNOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；(m)根据(h)到⑴任一所述的方法，其中人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重链可变区包含CDRl区、CDR2区和CDR3，其中CDRl 区包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2区具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；(η)根据(h)到(m)任一所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包 含如SEQ ID NO: 34所示的轻链氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重链氨基酸序列；(ο)根据(h)到(η)任一所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包 含与如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70%同源性的氨 基酸序列。同源性可通过标准序列比对程序(如Vector NTI (InforMax , Maryland,美 国))来确定。该程序在一个氨基酸一个氨基酸的基础上比较被比对的序列，并能设置各 种水平的比较严谨度(如等同氨基酸、保守氨基酸替换等)。作为本文中所用的术语， 如果所论及的两个氨基酸中的每一个都属于相同的化学组别，即酸性、非极性、不带电 荷的极性和碱性，则它们被认为是互相的“保守替换”。例如而不限于，两个属于非 极性氨基酸组的不同氨基酸被认为是互相的“保守替换”，即使这两个氨基酸不相同， 而一个是非极性氨基酸另一个是碱性氨基酸，则不会被认为是“保守替换”。Alberts， Johnson, Lewis, Raff, Roberts 和 Walter 的 “Molecular Biology of the Cell”(第 4版 (2002))的第3.1节把氨基酸分成四个主要的组酸性、非极性、不带电荷的极性和碱 性。该分组方式可用于在本发明中确定特定氨基酸是否是另一个所论及的氨基酸的保守 替换；
10
(P)根据本发明的第一个方面或(a)到(O)中任一所述的方法，其中所述中和 IL-17的化合物为多肽、模拟肽、核酸或小分子；(q)根据(ρ)所述的方法，其中所述多肽为可以结合IL-17或IL_17受体的抗体 或其功能片段，优选地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段。(r)根据(q)所述的方法，其中所述抗体为人类单克隆抗体或其功能片段；以及(s)根据本发明的第一个方面或ω到ω中任一所述的方法，其中炎性疾病 为类风湿性关节炎(RA)(包含对TNF-α中和剂治疗有抗药性的RA)、哮喘、多发性 硬化症(MS)、慢性阻碍性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤 维化(IPF)、炎性肠道疾病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn，s disease)、葡萄膜炎、黄斑变 性、结肠炎、银屑病、沃勒变性、抗磷脂抗体综合征(APS)、急性冠脉综合征、再狭窄 (restinosis),动脉粥样硬化、复发性多发软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外 科植入、血管球性肾炎、狼疮或其它自身免疫性疾病。本发明第二个方面涉及一种在患有肿瘤性疾病的个体中治疗肿瘤性疾病的方 法，所述方法包括施予一种中和GM-CSF的化合物和一种中和IL-17的化合物。根据技 术人员公知的参数，所述化合物可为一种组合物的部分，或者它们可为分开的药物。根据第二个方面，所述方法的优选实施方案如下(a) 一种方法，其中在施予中和IL-17的化合物之前或之后对个体施予所述中和 GM-CSF的化合物，或一种方法，其中同时给药两种化合物；(b)根据本发明的第二个方面或(a)所述的方法，其中所述治疗个体为上述定义 的动物；优选地，所述个体为人类或非人类灵长类动物；(C)根据本发明的第二个方面或(a)或(b)的方法，其中中和GM-CSF的化合物 为多肽、模拟肽、核酸或小分子；(d)根据(c)所述的方法，其中所述多肽为结合GM-CSF或GM-CSF受体的抗 体或其功能片段，优选地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段；(e)根据(d)所述的方法，其中所述抗体为人类单克隆抗体或其功能片段；(f)根据(d)或(e)所述的方法，其中所述抗体或其功能片段结合于人类和非人 类灵长类动物GM-CSF的表位。所述表位优选为人类和非人类灵长类动物GM-CSF的 不连续表位，所述表位优选包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位 (GLR/QGSLTKLKGPL)；(g)根据(f)所述的方法，其中所述不连续表位进一步包含氨基酸第28-31位 (LSRD)、氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(h)根据(e)、(f)和(g)中任一所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能 片段在其重链可变区包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13和56所示氨基酸序 列中的任一个；(i)根据(h)所述的方法，其中所述重链可变区CDR3序列中的任一个与SEQ ID NO 14所示重链可变区CDRl序列和SEQ ID NO 15所示重链可变区CDR2序列一起
存在于重链可变区；(j)根据(h)或(i)所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列，CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基
酸序列；(k)根据(j)所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区进一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；⑴根据(h)或(i)所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重 链可变区包含如SEQ IDNOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；(m)根据(h)到⑴任一所述的方法，其中人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重链可变区包含CDRl区、CDR2区和CDR3，其中CDRl 区包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2区具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；(η)根据(h)到(m)任一所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包 含如SEQ ID NO: 34所示的轻链氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重链氨基酸序列；(ο)根据(h)到(η)任一所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包 含分别与如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70%同源性 的氨基酸序列。此处定义的同源性与前述本发明的第一个方面的实施方案(ο)相同；(ρ)根据本发明的第二个方面或(a)到(ο)中任一所述的方法，其中所述中和 IL-17的化合物为多肽、模拟肽、核酸或小分子；(q)根据(ρ)所述的方法，其中所述多肽为可以结合IL-17或IL_17受体的抗体 或其功能片段，优选地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段。(r)根据(q)所述的方法，其中所述抗体为人类单克隆抗体或其功能片段；和(s)根据本发明的第二个方面或(a)到(r)任一所述的方法，其中所述肿瘤性疾 病为癌症；以及(t)根据(S)所述的方法，其中所述癌症为白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。本发明的第三个方面为一种用于人类医学和/或兽医学的药品组合物，特别是 用于在上述定义的人类和/或动物中治疗炎性疾病或肿瘤性疾病的药品组合物。所述组 合物包含一种GM-CSF中和化合物(简述为GM-CSF抑制化合物)和一种IL-17中和化 合物(简述为IL-17抑制化合物)。根据本发明的第三个方面，所述组合物的优选实施方 案如下(a) —种组合物，其中所述GM-CSF抑制化合物为多肽、模拟肽、核酸或小分 子；(b)根据(a)所述的组合物，其中所述多肽为结合GM-CSF或GM-CSF受体的 抗体或其功能片段；优选地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段；(c)根据(b)所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段为人类单克隆抗体或其 功能片段；(d)根据(b)或(C)所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段结合于人类和非
12人类灵长类动物GM-CSF的表位。所述表位优选为人类和非人类灵长类动物GM-CSF的 不连续表位，所述表位优选为包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨基酸第65-77位 (GLR/QGSLTKLKGPL)。(e)根据(d)所述的组合物，其中所述不连续表位进一步包含氨基酸第28-31位 (LSRD)，氨基酸第32-33位(TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(f)根据(c)、(d)和(e)中任一所述的组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功 能片段在其重链可变区包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13和56所示氨基酸 序列中的任一个；(g)根据(f)所述的组合物，其中所述重链可变区CDR3序列中的任一个与SEQ ID NO 14所示重链可变区CDRl序列和SEQ IDNO 15所示重链可变区CDR2序列一
起存在于重链可变区；(h)根据(f)或(g)所述的组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其 轻链可变区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸 序列，CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨
基酸序列；⑴根据(h)所述的组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可 变区进一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；(j)根据(f)或(g)所述的组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其 重链可变区包含如SEQ IDNOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；(k)根据(f)到(j)任一所述的组合物，其中人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区包含CDRl、CDR2和CDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重链可变区包含CDRl区、CDR2区和CDR3，其中CDRl 区包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2区具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；⑴根据(f)到(k)任一所述的组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段 包含如SEQ ID NO 34所示的轻链氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示 的重链氨基酸序列；(m)根据(f)到⑴任一所述的组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段 包含分别与如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70%同源 性的氨基酸序列，此处定义的同源性与前述本发明的第一个方面的实施方案(ο)相同；(η)根据(a)到(m)中任一所述的组合物，其中所述IL_17抑制化合物为多肽、 模拟肽、核酸或小分子；(ο)根据(η)所述的组合物，其中所述多肽为结合IL-17或IL_17受体的抗体或 其功能片段，优选地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段；(ρ)根据(ο)所述的组合物，其中所述抗体或其功能片段分别为人类单克隆抗体 或其功能片段；(q)根据(a)到(ρ)中任一所述的组合物，其中所述组合物用于治疗炎性疾病和 /或肿瘤性疾病，特别地，其中所述炎性疾病为类风湿性关节炎(RA)(包含对TNF-α中和剂治疗有抗药性的RA)、哮喘、多发性硬化症(MS)、慢性阻碍性肺病(COPD)、急性 呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化(IPF)、炎性肠道疾病(IBD)、克罗恩氏病、 葡萄膜炎、黄斑变性、结肠炎、银屑病、沃勒变性、抗磷脂抗体综合征(APS)、急性冠 脉综合征、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多发软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的 整形外科植入、血管球性肾炎、狼疮或自身免疫性疾病；并且/或者所述肿瘤性疾病为 癌症例如白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。根据本申请提交地的法律，本发明的第四个方面可为GM-CSF抑制化合物和 IL-17抑制化合物在制备治疗如上进一步说明的炎性疾病和肿瘤性疾病的药物中的联合用 途。因此，在本发明第四个方面的优选实施方案中，可以配制包含GM-CSF抑制化合物 和IL-17抑制化合物的药物，该药物用于如下给药方式(1)首先施予GM-CSF抑制化合物，然后施予IL-17抑制化合物；(2)首先施予 IL-17抑制化合物，然后施予GM-CSF抑制化合物；以及(3)同时施予GM-CSF抑制化 合物和IL-17抑制化合物。因此，根据技术人员公知的参数，所述化合物可为一种组合 物的部分，或者它们可为分开的药物。可选地，本发明的第五个方面可以为用于治疗上述任何疾病的GM-CSF和IL-17 抑制化合物。再一次说明，所述化合物的给药方式可以为以任何顺序一个接一个地给药 或者可以为同时给药。同样，根据技术人员公知的参数，所述化合物可为一种组合物的 部分，或者它们可为分开的药物。对于使用GM-CSF和IL-17抑制化合物制备药物的情况，和对于用于治疗任意 所述疾病的GM-CSF和IL-17抑制化合物的情况，优选的实施方案如下(a)所述接受治疗的个体如上定义；(b)所述GM-CSF抑制化合物为多肽、模拟肽、核酸或小分子；(c)根据(b)所述的多肽为结合GM-CSF或GM-CSF受体的抗体或其功能片段； 优选地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段；(d)如(C)定义的所述抗体或其功能片段为人类单克隆抗体或其功能片段；(e)所述抗体或其功能片段结合于人和非人类灵长类动物GM-CSF的表位。所 述表位优选为人和非人类灵长类动物GM-CSF的不连续表位，所述表位优选为包含氨基 酸第 23-27 位(RRLLN)和 / 或氨基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)。(f)所述不连续表位进一步包含氨基酸第28-31位(LSRD)、氨基酸第32_33位 (TA)和/或氨基酸第21-22位(EA)；(g)根据(d)、(e)和(f)中任一所述的人类单克隆抗体或其功能片段在其重链可 变区包含CDR3，其中CDR3包含SEQ ID NOs 1-13和56所示氨基酸序列中的任一个；(h)实施方案(g)，其中所述重链可变区CDR3序列中的任一个与SEQ ID NO 14所示重链可变区CDRl序列和SEQ ID NO 15所示重链可变区CDR2序列一起存在于
重链可变区；⑴实施方案(g)或(h)，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基酸序 列；
(j)根据⑴所述的人类单克隆抗体或其功能片段，在其轻链可变区进一步包含 如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列；(k)根据实施方案(h)或(g)所述的人类单克隆抗体或其功能片段，在其重链可 变区包含如SEQ ID NOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列；⑴实施方案(g)到(k)中的任一个，其中人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸 序列，CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NO 18 所示的氨基酸序列；并且在其重链可变区包含CDRl区、CDR2区和CDR3，其中CDRl 区包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，CDR2区具有如SEQ IDNO 15所示的氨 基酸序列，CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序列；(m)实施方案(g)到⑴中的任一个，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包 含如SEQ ID NO: 34所示的轻链氨基酸序列，以及如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重链氨基酸序列；(η)实施方案(g)到(m)中的任一个，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段 包含分别与如SEQ ID NOs 1-48和/或52-56中任一所示的氨基酸序列有至少70% 同源性的氨基酸序列。同源性可通过标准序列比对程序(如Vector NTI (InforMaxTM, Maryland,美国))来确定。该程序在一个氨基酸一个氨基酸的基础上比较被比对的序 列，并能设置各种水平的比较严谨度(如等同氨基酸、保守氨基酸替换等)。作为本文 中所用的术语，如果所论及的两个氨基酸中的每一个都属于相同的化学组别，即酸性、 非极性、不带电荷的极性和碱性，则它们被认为是互相的“保守替换”。例如而不限 于，两个属于非极性氨基酸组的不同氨基酸被认为是互相的“保守替换”，即使这两个 氨基酸不相同，而一个是非极性氨基酸另一个是碱性氨基酸，则不会被认为是“保守替 换”。Alberts, Johnson, Lewis, Raff, Roberts 禾口 Walter 的 “Molecular Biology of the Cell"(第4版(2002))的第3.1节把氨基酸分成四个主要的组酸性、非极性、不带电 荷的极性和碱性。该分组方式可用于在本发明中确定特定氨基酸是否是另一个所论及的 氨基酸的保守替换；(O)实施方案(a)到(η)中的任一个，其中所述IL-17抑制化合物为多肽、模拟 肽、核酸或小分子；(ρ)根据(ο)所述的多肽为结合IL-17或IL-17受体的抗体或其功能片段，优选 地，所述抗体为单克隆抗体或其功能片段；(q)根据(ρ)所述的抗体或其功能片段为人类单克隆抗体或其功能片段；以及(r)所述炎性疾病为类风湿性关节炎(RA)(包含对TNF-α中和剂治疗有抗药 性的RA)、哮喘、多发性硬化症(MS)、慢性阻碍性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)、特发性肺纤维化(IPF)、炎性肠道疾病(IBD)、克罗恩氏病、葡萄膜炎、黄斑 变性、结肠炎、银屑病、沃勒变性、抗磷脂抗体综合征(APS)、急性冠脉综合征、再狭 窄、动脉粥样硬化、复发性多发软骨炎(RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外科植入、 血管球性肾炎、狼疮或自身免疫性疾病；和/或所述肿瘤性疾病为癌症，例如白血病、 多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。如前所述，本文所用术语“IL-17”，是指一类获得性免疫系统细胞因子家族，由IL-17A到IL-17F六个成员组成。该术语的定义还包含异二聚体，如已被报导例如通 过CD4+T细胞生理表达的IL-17A/IL-17F。特别优选的根据本发明被中和的IL-17家族 成员包含IL-17A、IL-17F和IL-17D。更优选地，IL-17A和IL-17F的效应根据本发明 被中和。由于优选由IL-17A、IL-17F和IL-17D组成的组，所以也优选中和/抑制IL-17 受体亚组(IL-17R)的信号，如IL-17RA、IL-17RB和IL-17RC信号，更优选IL-17RA 和IL-17RC的信号。本文所用术语“特异结合”或相关表述，如“特异性结合”、“特异地结 合”、“特异结合物”等，指GM-CSF/IL-17抑制化合物以及优选人类单克隆抗体或其 功能片段(如上定义)区分出GM-CSF/IL-17和任何数量的其它不同于GM-CSF/IL-17 的潜在抗原的能力如此之高，从多种作为潜在结合配偶体的不同抗原的集合中，仅结合 或仅显著结合GM-CSF/IL-17。在本发明的范围内，“显著”结合GM-CSF/IL-17，是 指在从作为潜在结合配偶体的同样可接触的多种不同抗原的汇聚物中，比任何其它不同 于GM-CSF/IL-17的抗原高至少10倍、优选50倍、最优选100倍或更高频率(在动力 学意义上)地结合GM-CSF/IL-17。这些动力学测量可在Biacore设备上进行。本文中所用的“中和作用”、“中和剂”、“中和”和其语法上相关的变体指 部分或完全减弱GM-CSF/IL-17的一种或多种生物学效应。该GM-CSF/IL-17的一种 或多种生物学效应的部分或完全减弱可由修饰、阻断和/或消除GM-CSF/IL-17介导的 过程例如信号传导(例如在细胞内信号传递、细胞增殖或释放可溶性物质、上调或下调 细胞内基因活化所显示的)而造成，例如导致除了 GM-CSF之外的配体的表面受体的表 达。所属领域技术人员能理解的是，存在多种模式来确定试剂(例如所论及的抗体或其 功能片段)是否能被划分为中和剂。例如，这一般可通过如下标准体外测试来实现在 第一个增殖试验中，将其增殖程度已知取决于GM-CSF活性的细胞系和一系列含各种浓 度的GM-CSF—起孵育，孵育后测定细胞系的增殖程度。通过这种测量，确定出能使 细胞达到半最大增殖程度的GM-CSF浓度。然后进行第二个增殖实验，其在每一系列 样品中利用第一个增殖实验中所用的相同数量的细胞、以上确定的GM-CSF浓度、以及 此次使用各种浓度的怀疑是GM-CSF中和剂的抗体或其功能片段。再测量细胞增殖以 确定足以导致半最大生长抑制的抗体或其功能片段的浓度。如果得到的生长抑制对抗体 (或其功能片段)浓度的图是乙状的(sigmoidal)，使得随着抗体(或其功能片段)浓度 增加而降低细胞增殖，则在一定程度上导致抗体依赖性生长抑制，即以某种程度中和了 GM-CSF活性。在这种情况下，抗体或其功能片段可被认为是本发明范围内的“中和 剂”。其增殖程度已知取决于GM-CSF活性的细胞系的一个例子是TF-1细胞系，其如 文献 Kitamura，T 等(1989) .J Cell Physiol 140，323-34 所述。如所属领域普通技术人员所理解的，细胞增殖的程度不是确立GM-CSF中和能 力的唯一参数。例如，测定其分泌水平依赖于GM-CSF的信号传递分子(如细胞因子) 的水平，可用于鉴定可疑的GM-CSF中和剂(GM-CSF抑制化合物)。用于确定IL-17 抑制化合物的中和效应的相应细胞实验设定是所属领域技术人员所公知的。可用于确定所论及的抗体或其功能片段是否是GM-CSF活性的中和剂的细胞系 的其它实例包括 AML_193(参见文献 Lange，B.等(1987) .Blood 70，192-9)、GF-D8 (参 见文献 Rambaldi，A.等(1993) .Blood 81，1376-83)、GM/SO (参见文献 Oez，S.等(1990) .Experimental Hematology 18, 1108-11)、M07E (参见文献 Avanzi，G.C.等(1990). Journal of Cellular Physiology 145, 458-64)、TALL-103 (参见文献 Valtieri，M.等(1987). Journal of Immunology 138，4042-50)、UT-7 (参见文献 Komatsu，N.等(1991) .Cancer Research 51, 341-8)。可用于确定所论及的化合物(例如抗体或其功能片段)是否是 IL-17活性的中和剂的基于细胞系/细胞的分析的实例包括IL-17蛋白质的BEAS-2B体 外分析(BEAS-2B，人类支气管上皮细胞(ATCC，CRL-9609))或成纤维细胞的标准IL_6 释放分析(参见文献 Yao 等，1995，Journal of Immunology, 155，5483-5486)。应当理解，在含有GM-CSF和IL-17的受体的细胞之外或细胞之内，根据本发 明的GM-CSF和IL-17的抑制作用/中和作用都能够分别发生。因此，通过化合物产生 的GM-CSF和IL-17的抑制作用/中和作用既可以为抑制或阻止GM-CSF或IL-17与其 特异性受体结合的作用，也可以为抑制这些细胞因子与其受体结合所诱导的细胞内信号 的作用。细胞内作用的IL-17信号的抑制剂/中和剂的实例包括阻断细胞内信号通路的 化合物，包括 JAK/STAT、MAPKp38、NF-kappaB 或 JNK 抑制剂。如上定义，GM-CSF或IL-17的抑制剂可以选自由多肽、模拟肽、核酸和小分子 组成的组。本文所用术语“多肽”描述一组由多于30个氨基酸组成的分子。根据本发明， 所述多肽的组包含由一个或多个多肽组成的“蛋白质”。术语“多肽”还描述蛋白质片 段，只要这些片段由多于30个氨基酸组成。在本领域众所周知，多肽可能形成多聚体， 如二聚体、三聚体和更高寡聚体，即由多于一个多肽分子组成。这样的多聚体也包括在 术语“多肽”的定义中。形成这种二聚物、三聚物等的多肽分子可为相同的或不同的。 于是，这种多聚物的相应的更高级结构，被命名为同或异二聚物，同或异三聚物等。异 多聚物的一个实例为一种由两个相同轻链和两个相同重链组成的天然形式的抗体分子。 术语“多肽”和“蛋白”还指自然或非自然修饰的多肽/蛋白质，其中所述修饰可例如 通过转录后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)产生。这种修饰是本领域公知的。术语“小分子”指的是一组分子量少于1000D、并且优选为300-700D的药物化 合物。相应的小分子可以源于至少部分随机的肽文库。本发明适用的小分子文库是本领 域所公知的，并且/或是可以从经销商购买的。术语“核酸”在本发明范围中定义为由磷酸、糖、嘌呤和嘧啶碱基的多个重复 单元构成的大分子。这些分子的实施方案包括DNA、RNA和PNA。在本发明范围中， 核酸的一个特别优选的实施方案为适体(aptamer)。适体为这样的DNA或RNA分子，其 选自基于与其它分子结合能力的随机库。所选择的适体可以结合核酸、蛋白质、有机小 分子、甚至整个有机体。术语“模拟肽”指的是一种设计用来模拟肽的小蛋白样链。这种分子是为了改 变分子的特性，通过修饰现有肽而人工获得的。例如，修饰亲本现存肽以改变该分子的 稳定性或生物学活性。这些修饰包含改变骨架和加入非天然氨基酸。术语“GM-CSF受体”是指GM-CSF的生理细胞表面受体，在本领域中是指 CD116和常见bata⑶c)亚基形成的异二聚体。术语“IL-17受体”指的是IL-17不同亚 型的生理细胞表面受体的家族。目前所述家族尤其包含以下亚型IL-17RA、IL-17RB、 IL-17RC、IL-17RD 和 IL-17RE。
中和用肽链的一个优选的实施方案为抗体(或其功能片段)，更优选为人类 抗体(或其功能片段)。生产抗体的技术在本领域为公知的且已在例如文献Harlow和 Lane “ Antibodies, A Laboratory Manual “， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 以及文献 Harlow and Lane " Using Antibodies A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999中描述。术语“抗体”包含不同种类(如IgA、IgG、IgM、IgD 和IgE)和亚类(如IgGl、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。本发明所述抗体定义也包含抗 体的衍生物，所述抗体衍生物包括对所述分子的修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化、法 尼基化(famesylation)、羟基化、甲基化或酯化。非人类或人类抗体或其功能片段(具有GM-CSF和IL-17特异性)优选是单克隆 的。制备单克隆的人抗体尤其困难。与用永生化的细胞系融合鼠B细胞相反，融合人B 细胞和永生化的细胞系是不可行的。因此，人单克隆抗体是克服抗体技术领域中现存的 公认的技术障碍的结果。抗体的单克隆性质使其尤其适于用作治疗剂，这是因为该抗体 将作为单一、均一的分子种类而存在，其可以被很好地表征并重复制备并纯化。这些因 素产生的产物，其生物活性可被高精度地预测出，如果要使该分子被管理部门批准可以 向人给药治疗，则这是非常重要的。特别优选地，单克隆抗体(或其相应功能片段)是人抗体(或其相应功能片 段)。为了使抗体试剂能对人给药治疗，抗体为人源的是非常有利的。在对人患者给药 后，人抗体或其功能片段将最可能不引发患者免疫系统的强免疫原性应答，即不会被识 别为“外来的”非人蛋白。这指不产生宿主(即患者)抗体来抗该治疗性抗体，否则宿 主抗体就会阻断治疗性抗体的活性和/或加速患者身体清除治疗性抗体，由此阻止其发 挥所希望的治疗效应。本文中所用的术语“人”抗体应被理解为指具有特异性的抗体或其功能片段， 其包括包含于人的种系抗体群内的一种或多种氨基酸序列。因此为了在本文中定义， 抗体或其片段可被认为是人的，条件是由这样的一种或多种人的种系氨基酸序列组成， 即，条件是所论及的抗体或其功能片段的一种或多种氨基酸序列与表达的一种或多种人 的种系氨基酸序列一致。抗体或其功能片段也可以看成是人的，条件是它由如下序列组 成所述序列与其最接近的人的种系序列的差别不超过由于体细胞超突变印记所带来的 差别。另外，许多非人哺乳动物(例如啮齿动物，如小鼠和大鼠)抗体包含VHCDR3氨 基酸序列，其预计也存在于表达的人抗体群中。可被预计存在于表达的人的所有组成成 分(repertoire)中的人或非人源的一个或多个任何这种序列也可被认为是符合本发明目的 的“人”的。根据本发明的一个优选的实施方式，被用于药学目的的人类单克隆抗体或其功 能片段在人和至少一种猴物种之间显示出交叉反应性。优选所有其它(非抗体或非抗体 来源的)GM_CSF和/或IL-17的中和/抑制化合物具有同样的物种间交叉反应性。由于 该抗体通常将在行政审批前必须经历大量试验，其中某些早期试验涉及非人动物物种， 因此这种交叉反应抗体非常有用。为了进行这些测试，一般希望用与人遗传上高度相似 的非人物种，这是因为由此获得的结果一般将高度预示出将相同分子向人给药时所预期 的相应结果。可是，这种基于动物试验的预测能力至少部分取决于分子的相似性，当由 于物种交叉反应性而可将相同的治疗分子向人和动物模型给药时，其预测能力是非常高的。如在本发明的实施方案中，当抗体分子与人和另一种很相关的物种中的相同抗原交 叉反应时，可以使用该相同抗体分子在人以及该很相关的物种(如上述猴物种)中进行试 验。这增加了测试本身的效率以及这些试验对这些抗体在人(从治疗角度最终兴趣所在 的物种)中行为的所能达到的预测能力。在使用不是抗体(或不是抗体衍生)的中和/ 抑制化合物的可供选用的其它实施方案中也是这样的。根据本发明的另一个具体实施方式
，人单克隆抗体可以是IgG抗体。IgG不仅 包含负责高度区别性地识别和结合抗原的可变抗体区，而且还包含通常在内源产生的抗 体中出现的重和轻抗体多肽链的恒定区，在某些情况下，甚至在一个或多个位点上带有 碳水化合物修饰。这样的糖基化一般是IgG型的标志，而且这些恒定区的部分组成了完 整抗体的所谓Fc区，已知其能在体内引发出各种效应器功能。另外，Fc区介导IgG与 Fc受体的结合，由此延长体内半衰期并辅助IgG向Fc受体增加的地方——例如发炎组织 归巢。有益的是，IgG抗体是IgGl抗体或IgG4抗体，这些是优选的形式，这是因为它 们的体内作用机制被特别好地理解并表征了。尤其对于IgGl抗体是这样。根据本发明的另一个具体实施方式
，人单克隆抗体的功能性片段可以是scFv、 单结构域抗体、Fv、VHH抗体、双抗体、串联的双抗体、Fab、Fab，或F(ab)2。这 些形式通常可被分成两个亚型，即由单多肽链组成的那些，和包含至少2条多肽链的那 些。前一亚型的成员包括scFv(包含一个VH区和一个VL区，它们通过多肽接头连接成 单多肽链)；单结构域抗体(包含单个抗体可变区)，如VHH抗体(包含单VH区)。后 一亚型的成员包括Fv(包含一个VH区和一个VL区，形成分开的多肽链，非共价地相互 连接)；双抗体(包含2条非共价连接的多肽链，其中每一条包含2个抗体可变区一通 常每条多肽链有一个VH和一个VL-这两条多肽链以头对尾构型排列而形成二价抗体分 子)；串联的双抗体(双特异性单链Fv抗体，其包含具有两种不同特异性的4个共价相 连的免疫球蛋白可变VH和VL区，形成上述双抗体两倍大的同二聚体)；Fab (包含作为 一条多肽链的完整的抗体轻链(其自身包含了 VL区和完整的轻链恒定区)，以及作为另 一条多肽链的一部分抗体重链(其包含完整的VH区和部分重链恒定区)，所述2条多肽 链通过链内二硫键而在分子间相连)；Fab’(如同以上Fab，除了具有包含在抗体重链上 的另外的还原二硫键)和F(ab) 2 (包含2个Fab，分子，每个Fab，分子与另一个Fab， 分子通过链间二硫键相连)。一般而言，上文所述类型的功能性抗体片段给设计，例如 需要在特定紧急情况下临时治疗给药的抗体的药物动力学性质带来了很大的灵活性。例 如，可期望减小给药抗体的大小，从而在治疗已知很少有血管分布的组织(例如，关节) 时增加组织穿透程度。在某些情况下，也可期望增加治疗性抗体被清除出身体的速率， 所述速率一般通过减少给药抗体大小来加速。只要抗体片段能维持特异性结合亲本抗体 表位/靶标的特性，即，只要能分别特异性结合GM-CSF或IL-17，这个抗体片段就定义 为本发明范围内的功能性抗体片段。根据本发明的另一个具体实施方式
，所述人单克隆抗体或其功能片段可以呈现 为单价单特异性的；多价单特异性的，尤其是二价单特异性的；或是多价多特异性的， 尤其是二价双特异性的形式。一般而言，多价单特异性的、尤其是二价单特异性的抗体 (如上述完整的人IgG)可带来治疗优势，即通过这种抗体起到的中和作用能够被抗体亲 抗原性(avidity)作用(即相同的抗体结合至多个相同抗原(此处指GM-CSF/IL-17)分子)增强。本发明的抗体片段的几种单价单特异性形式如上所述(例如，scFv、Fv、VHH 或单结构域抗体)。多价多特异性的、尤其是二价双特异性形式的人单克隆抗GM-CSF/ IL-17抗体，可包括完整的IgG，其中一个结合臂结合非人类灵长类动物的GM-CSF/ IL-17,而另一个结合臂结合于不同于GM-CSF/IL-17的另一抗原。其它多价多特异性 的、尤其是双价双特异性形式，优选为人单链双特异性抗体，即包含2个上述scFv实体 的重组人抗体构建体，通过本领域通常已知的小的插入性多肽间隔区连成一个连续的多 肽链(例如参见WO 99/54440,其涉及抗CD19x抗CD3双特异性单链抗体)。在本文 中，双特异性单链抗体的范围内所涵盖的双特异性单链抗体的一个scFv部分将特异结合 如上所提及的GM-CSF/IL-17，而该双特异性单链抗体的另一个scFv部分将结合另一个 确定具有治疗利益的抗原。优选的另一方式是，如上所述双特异性单链抗体将特异性结 合GM-CSF，而该双特异性单链抗体的另一个scFv部分将结合IL-17。根据本发明的另一个具体实施方式
，抑制性人类单克隆抗体或其功能片段可以 是衍生化的，例如用有机聚合物，例如用一个或多个聚乙二醇(“PEG”)和/或聚乙烯 吡咯烷酮(“PVP” )分子进行衍生化。本领域已知，这种衍生化有益于调节抗体或其 功能片段的药效学性质。尤其优选的是衍生化为PEG-马来酰亚胺的PEG分子，其能以 位点特异性方式通过半胱氨酸的巯基来与抗体或其功能片段缀合。在这些中，尤其优选 的是20kD和/或40kD的PEG-马来酰亚胺，其可以是支链或直链的形式。尤其有益的 是增加较小的人抗GM-CSF/IL-17抗体片段(如scFv片段)的有效分子量，其通过将后 者与一个或多个PEG分子(尤其是PEG-马来亚酰胺)偶联而获得。本文中所用人和非人灵长类GM-CSF的编号指成熟的GM-CSF的，即不带有其 17个氨基酸信号序列的GM-CSF(上述人和非人灵长类物种的成熟的GM-CSF的总长度 都是 127 个氨基酸)。人 GM-CSF (SEQ ID NO 57)和长臂猿 GM_CSF(SEQ ID NO 58)的序列如下APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETVEVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM
ASHYKQHCPP TPETSCATQIITFESFKENL KDFLLVIPFDCWEPVQE某些猕猴科成员(例如恒河猴(SEQ ID NO 59)和食蟹猴(SEQ IDNO 60))的 GM-CSF序列如下APARSPSPGT QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNKTVEVVSEMFDLQ EPSCLQTRLE LYKQGLQGSL TKLKGPLTMMASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFQSFKENL KDFLLVIPFDCWEPVQE上述本发明的人单克隆抗体(或其功能片段)所结合的最小表位(更好是不连续 表位)在以上GM-CSF序列中用粗体字表示。本文中所用的术语“不连续表位”应被 理解为是给定多肽链(本文中的成熟的人和非人灵长类GM-CSF)中至少2个不相邻的氨 基酸序列段，其同时并特异地与抗体结合。根据该定义，这种同时的特异的结合可以是 针对线型GM-CSF多肽的。在本文中，可以设想成熟的GM-CSF多肽形成了延伸的环， 在环的一个区域中上面粗体字所指示的2个序列排成排，例如或多或少互相平行和彼此接近。在该状态下，它们特异并同时与本发明的抗体片段结合。根据该定义，以上所示 的成熟GM-CSF的2个序列段的同时特异结合也可以采取抗体与构象表位结合的形式。 在本文中，成熟的GM-CSF已经形成了其通常在体内所形成的三级构象。在该三级构象 中，成熟的GM-CSF多肽链以如下方式折叠使以上所示的2条序列段处于空间相邻的 位置，例如在成熟、折叠的GM-CSF的特定区域的外表面，然后他们在此通过其在周围 多肽序列环境内的三维构象被识别。优选的人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段包含如SEQ IDNO 14所示的 重链可变区CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 1所示的重链可变区CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重链可变 区CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 2所 示的重链可变区CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重链可变区CDR1序 列，如SEQIDNO: 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQIDNO 3所示的重链可 变区CDR3序列；或是包含如SEQIDNO: 14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 4所示的重链可变区CDR3序 列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQID NO 15所 示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 5所示的重链可变区CDR3序列；或是包 含如SEQ ID NO 14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重链可 变区CDR2序列和如SEQ ID NO 6所示的重链可变区CDR3序列；或是包含如SEQ IDNO 14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重链可变区CDR2序 列和如SEQ ID NO 7所示的重链可变区CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所 示的重链可变区CDR1序列，如SEQIDNO: 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 8所示的重链可变区CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重链可 变区CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 9 所示的重链可变区CDR3序列；或是包含如SEQ IDNO 14所示的重链可变区CDR1 序列，如SEQIDNO: 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO: 10所示的重 链可变区CDR3序列；或是包含如SEQ ID NO 14所示的重链可变区CDR1序列， 如SEQID NO 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 11所示的重链可变区 CDR3序列；或是包含如SEQID NO: 14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO: 15所示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO: 12所示的重链可变区CDR3序 列；或是包含如SEQID NO: 14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO 15所 示的重链可变区CDR2序列和如SEQ ID NO 13所示的重链可变区CDR3序列；或是包 含如SEQ ID NO 14所示的重链可变区CDR1序列，如SEQ ID NO 15所示的重链可 变区CDR2序列和如SEQ ID NO 56所示的重链可变区CDR3序列。更优选的是，以上14种CDR1、CDR2和CDR3序列的组合的任一种存在于这样 的人单克隆抗体或其功能片段中，其中该人单克隆抗体或其功能片段进一步在其轻链可 变区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中CDR1包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基酸序 列。根据另一个具体实施方式
，抑制性人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段在其轻链可变区包含如SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列。优选的是这样的人单克隆抗 体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重链可变 区包含如SEQIDNO: 20中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段， 其轻链可变区包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 21中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包 含如SEQIDNO: 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 22中所示的 氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 23中所示的氨基酸序列；或 这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基 酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO : 24中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗 体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重链可变 区包含如SEQIDNO: 25中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段， 其轻链可变区包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 26中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包 含如SEQIDNO: 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 27中所示的 氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO : 28中所示的氨基酸序列；或这 样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸 序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 29中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗 体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重链可变 区包含如SEQIDNO: 30中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段， 其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 31中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包 含如SEQIDNO: 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO 32中所示的 氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO 19中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO: 33中所示的氨基酸序列；或这 样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸 序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 52中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体 或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 19中所示的氨基酸序列，重链可变区 包含如SEQ ID NO 53中所示的氨基酸序列。 根据另一个具体实施方式
，抑制性人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段在其 轻链可变区包含如SEQ ID NO: 54中所示的氨基酸序列。优选的是这样的人单克隆抗 体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变 区包含如SEQ IDNO 20中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段， 其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 21中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包 含如SEQIDNO: 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 22中所示的 氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 23中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基 酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO : 24中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗 体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变 区包含如SEQ ID NO 25中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段， 其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 26中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包 含如SEQ ID NO 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 27中所示的 氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO : 28中所示的氨基酸序列；或这 样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸 序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 29中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗 体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变 区包含如SEQIDNO: 30中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段， 其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 31中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包 含如SEQIDNO: 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO 32中所示的 氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO 54中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO: 33中所示的氨基酸序列；或这 样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸 序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 52中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体 或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 54中所示的氨基酸序列，重链可变区 包含如SEQ ID NO 53中所示的氨基酸序列。 根据另一个具体实施方式
，该抑制性人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段在 其轻链可变区包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列。优选的是这样的人单克 隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重链 可变区包含如SEQ IDNO : 20中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片 段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 21中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区 包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 22中所 示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO: 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO: 23中所示的氨基酸序 列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示 的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO : 24中所示的氨基酸序列；或这样的人单 克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重 链可变区包含如SEQ ID NO 25中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功 能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如 SEQ ID NO 26中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可 变区包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 27 中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQID NO 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO 28中所示的氨基酸序 列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所 示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 29中所示的氨基酸序列；或这样的人 单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列， 重链可变区包含如SEQ ID NO: 30中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其 功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含 如SEQIDNO: 31中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链 可变区包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ IDNO 32 中所示的氨基酸序列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO 55中所示的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO 33中所示的氨基酸序 列；或这样的人单克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示 的氨基酸序列，重链可变区包含如SEQ ID NO : 52中所示的氨基酸序列；或这样的人单 克隆抗体或其功能片段，其轻链可变区包含如SEQ ID NO : 55中所示的氨基酸序列，重 链可变区包含如SEQ ID NO 53中所示的氨基酸序列。一种优选的抑制性人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段，在其轻链可变区包 含CDR1区、CDR2区和CDR3，其中CDR1区包含SEQID NO 16所示氨基酸序列， CDR2区具有SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，CDR3具有SEQ ID NO 18所示氨基 酸序列；并且在其重链可变区包含CDR1区、CDR2区和CDR3，其中CDR1区包含如 SEQ IDNO 14所示的氨基酸序列，CDR2区具有如SEQIDNO 15所示的氨基酸序列， CDR3 具有如 SEQ ID NOs 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 56 中任一 所示的氨基酸序列。根据另一个具体实施方式
，所述抗体在其轻链中包含如SEQ IDNO : 34中所示 的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO : 35中所示的氨基酸序列；或在其轻链中 包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO 36中所示 的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其重链中 包含如SEQIDNO: 37中所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO 34中所 示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO : 38中所示的氨基酸序列；或在其轻链 中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO 39中所 示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其重链 中包含如SEQIDNO: 40中所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQIDNO 34中 所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ IDNO 41中所示的氨基酸序列；或在其轻 链中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO 42中 所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其重 链中包含如SEQ ID NO 43中所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO 34 中所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO : 44中所示的氨基酸序列；或在其 轻链中包含如SEQ IDNO 34中所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO 45 中所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO : 34中所示的氨基酸序列，在其 重链中包含如SEQ ID NO 46中所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQIDNO: 47中所示的氨基酸序列；或在其轻链中包含如SEQ ID NO 34中所示的氨基酸序列，在其重链中包含如SEQ ID NO 48中所示的氨基酸序列。以上优选的具体实施方式
提供了人单克隆抗体分子和/或其功能片段，其作为 非人类灵长类和人类GM-CSF活性的中和剂特别有利。根据这些特别优选的具体实施方 式的人单克隆抗体或其功能片段非常有利是由于以下几个原因。首先，它们高度特异地识别非人类灵长类和人类GM-CSF，也就是说从非 人类灵长类GM-CSF与其它非人类灵长类集落刺激因子(例如非人类灵长类G-CSF 和M-CSF)的混合物中，根据这些特别优选的具体实施方式
的结合分子能高度区分出 灵长类GM-CSF，而在相同环境中不识别其它集落刺激因子。这也同样适用于人类 GM-CSF。这是指，这些具体实施方式
所述的人单克隆抗体或其功能片段，在向人给药 时，将被预见到只能特异结合并中和所期望的靶，而并不结合与中和其它不期望的靶。 最终，这导致了关于体内作用的治疗模式的高度可预测性。第二，这些特别优选的具体实施方式
的结合物以非常高的亲和力结合非人 类灵长类和人类GM-CSF。对于该类分子所观察到的KD值从约4X10_9M低至约 0.04X10_9M，后者相当于约40pM。由于在含水介质中该分子的动力学结合速率极大地 受扩散控制，因此不能提高到超出在生理条件下局部扩散条件所能达到的速率，因此低 的KD值主要由动力学解离速率(kj造成，k。ff对于亲和力最高的抗体结合物来说约为 10_5。。这是指，一旦作为一方的本发明这些具体实施方式
所述的人单克隆抗体或其功 能片段与作为另一方的GM-CSF之间形成复合物，就不能容易地、或至少不能迅速地分 离。对于要作为生物活性中和剂的结合分子来说，这些特点是高度有益的，这是因为所 希望的中和效果通常将只能在其生物活性要被中和的分子(此处指非人类灵长类和人类 GM-CSF)仍旧被中和结合分子结合时才能持续。因此，仍保持长时间结合其所要结合的 靶的中和分子将继续中和相当长的一段时间。人单克隆抗体或其功能片段与非人类灵长类和人类GM-CSF的高度结合亲和力 具有额外的优势。通常，抗体或其功能片段将以大小依赖性的形式从患者血流中被清除 出，方式是排出并清除较小的分子，然后是较大的。由于两种多肽(抗体或抗体片段与 所结合的GM-CSF)的复合物明显大于抗体本身，因此上述低^使得治疗性中和剂比它 不结合GM-CSF的情况更慢地从患者身体中被排出并清除。因此，中和活性的幅度与其 体内持续时间都增加了。根据上述具体实施方式
的结合物所确定的中和活性出人意料地高。如将在下 文中更具体地描述的那样，可利用TF-1生长抑制分析进行体外测量GM-CSF中和活性 (Kitamura，T.等(1989) .J Cell Physiol 140，323-34)。测定 IC5(1 值作为中和潜力的指标， IC50表示本发明这些具体实施方式
所述的人单克隆抗体或其功能片段引发半最大TF-1细 胞增殖抑制作用所需的浓度。对于上述的人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段，所确 定的IC5(I值约为SXIO^M，或约为0.3nM。因此，本发明这些具体实施方式
所述的结合 分子是很强有力的非人类灵长类和人类GM-CSF活性的中和剂。然后，总之，人单克隆抗GM-CSF抗体或其功能片段显示出对所希望的抗原的 高度区分能力，非常牢固地结合该抗原并持续长时间，并在它所结合的长时间内显示出 高度有效的中和活性。同时，长时间保持结合物_抗原复合物能减缓该结合物从身体中被清除，由此延长所希望的体内治疗效果的持续时间。对中和/抑制性的单克隆抗IL-17抗体，上述讨论也适用。根据本发明，所述术语“药物组合物”涉及向患者(优选人患者)给药的组合 物。优选地，所述药物组合物包含载体、稳定剂和/或赋形剂的适合制剂。在优选的具 体实施方式中，药物组合物包含用于非肠道、透皮、内腔内、动脉内、膜内和/或鼻内 给药或直接注射入组织的组合物。尤其关注的是，所述药物组合物通过输注或注射向患 者给药。合适的组合物的给药方法可通过不同方式实施，如静脉内、腹膜内、皮下、肌 肉内、局部或皮内给药。本发明的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体。合 适的药物载体的例子是本领域公知的，包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(如油/水乳 剂)、各类保湿剂、无菌溶液、脂质体等。包含这些载体的组合物可通过传统公知方法 配制。这些药物组合物可以合适的剂量向患者给药。剂量方案可由参与的医生和临床因 素来确定。如在医学领域所公知的那样，对于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患 者的身材、体表面积、年龄、将要施予的特定化合物、性别、给药时间和途径、综合健 康情况、以及同时给药的其它药物。非肠道给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混 悬液、和乳剂。非水性溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、和可注射 的有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/含水溶液、乳剂或混悬液，包括盐水和 缓冲介质。非肠道载体包括氯化钠溶液、葡萄糖林格氏液(Ringer’ s dextrose) >葡萄糖 和氯化钠、乳酸林格氏液(lactated Ringer’ s)、或非挥发油。静脉内载体包括流体和营 养物补充剂、电解液补充剂(如基于葡萄糖林格氏液的那些)等。也可含有防腐剂和其 它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。另外，本发明的药物 组合物可包含蛋白质载体，像诸如，血清白蛋白或免疫球蛋白，优选是人源的。可设想 的是，除了如本发明所述，本发明的药物组合物还可包含其它生物活性剂，这取决于药 物组合物所需的用途。该试剂可以是作用于胃肠系统的药物、起细胞抑制剂(cytostatica) 作用的药物、防止高尿酸血症(hyperurikemia)的药物、抑制免疫反应的药物(如皮质类 固醇)、调节炎症反应的药物、作用于循环系统的药物和/或诸如细胞因子的本领域已知 的试剂。本文中所定义的药物组合物的生物学活性可以通过如W099/54440中的细胞 毒性分析来测定(如下述实施例中所述)，或通过如文献Schlereth等(Cancer Immunol. Immunother.20 (2005), 1-12)的方法测定。此处所用“效能” (efficacy)或“体内效能”
是指通过本发明药物组合物治疗后的反应，使用如标准化NCI反应标准。使用本发明药 物组合物治疗达到成功或体内效能是指所述药物组合物达到其预期使用目的的效果，即 组合物起到预期作用的能力，即，病理细胞如肿瘤细胞的清除。体内效能可以通过对各 种疾病实体建立标准方法进行监测，其中标准方法包括但不限于白细胞计数、差异、荧 光激活细胞分选、骨髓穿刺。另外，也可以使用各种疾病特异性临床化学参数和其它已 建立的标准方法。此外，也可以使用计算机断层扫描、X射线、核磁共振成像(如用于 基于国家癌症研究所标准的反应评估)、正电子发射断层扫描、白细胞计、差异、荧光激 活细胞分选、骨髓穿刺、淋巴结活组织检查/组织学以及各种淋巴特性临床化学参数(如 乳酸脱氢酶)和其它已建立的标准方法。发展药物(如本发明所述药物组合物)的另一个挑战是其药代动力学性质的可测调控。为此，建立了所述候选药物的药代动力学特征，即影响特定药物治疗给定病情的 能力的药代动力学参数的特征。影响药物治疗某种疾病实体的能力的药物药代动力学参 数包括但不限于半衰期、分布容积、肝脏首过效应和血清结合度。上述提到的任一参 数可影响给定药物制剂的效能。“半衰期”指的是通过生物学过程(如代谢、排泄等)清除50%所给药物所需 的时间。“肝脏首过代谢”，指的是药物首度接触肝脏(即第一次经过肝脏)而被代谢的 倾向。“分布容积”是指药物经过整个机体各个部分(如细胞内和细胞外空间、组织和 器官等)的滞留度，以及所述药物在这些部分中的分布。“血清结合度”指的是药物与血清蛋白质(如白蛋白)互相作用并结合的倾向， 其中血清蛋白质导致药物生物活性的降低或损失。药代动力学参数还包括生物利用度、滞后时间(T.^g)、Ti±、吸收速率、更多 发病和/或对于所给药物给定剂量的峰值浓度。“生物利用度，，指药物在血液腔室中的数量。“滞后时间”指的是从施予药物到该药物在血液或血浆中的检测和可测性之间 的时间耽搁。“Ti±”是指药物到达最大血药浓度所需的时间，“Ci±”指给定药物获得的 最大血药浓度。所有参数均影响达到药物发挥其生物学效应所要求的血液或组织浓度所 经历的时间。此处所用术语“毒性”是指表现为副作用或严重副作用的药物毒性效应。这些 副作用事件可以指给药后大体上缺乏的对药物的耐受性和/或给药后缺乏的对药物的局 部耐受性。毒性也包含药物导致的致畸或致癌作用。此处所用术语“安全性”、“体内安全性”或“耐受性”指的是在刚给药之 后(局部耐受性)以及使用药物较长时间后，所述给药没有引发严重的副作用。“安全 性”、“体内安全性”或“耐受性”可以通过在治疗和随访阶段定期评估。测量包含临 床评估(如器官表现)和实验室异常的筛查。可以进行临床评估并比较与根据NCI-CTC 和/或MeDRA标准记录或编码的正常结果的偏离。器官表现可包括诸如过敏/免疫学、 血/骨髓穿刺、心律失常、凝血等等之类的标准，如在Common Terminology Criteria for adverse events v3.0 (CTCAE)中设定的。可以测试的实验室参数包括例如血液学研究、临 床化学、凝血概况和尿液分析，以及其它体液(如血清、血浆、淋巴或脊髓液)、酒精之 类的检测。因此安全性可以通过如身体检查、成像技术(如超声波、X射线、CT扫描、 磁共振成像(MRI))、其它使用技术设备的测量(如心电图)、生命体征、通过测量实验 室参数和记录副作用来评估。此处所用术语“有效且无毒剂量”是指此处定义的双特异 性单链抗体的耐受剂量，其高到足以引起清除病理细胞、消除肿瘤、肿瘤缩小或稳定疾 病，而没有或基本上没有大的毒性作用。这种有效且无毒剂量可通过例如本领域所述的 剂量递增研究来确定，并且其应低于诱发严重副作用(剂量限制性毒性，DLT)的剂量。本申请包括一些附图，描述如下


图1 GM-CSF中和用mAb (单克隆抗体)22E9 (A)、IL-17中和用mAb1400.24.17(B)和TNFa拮抗剂依那西普(etanercept) (C)对慢性SCW炎症中膝关节肿胀 的治疗效果。关节炎的诱导如方法部分中所述。通过在14、17、21和24天腹腔注射 300iig剂量治疗。用摄入膝盖的99mTc来测量炎症，并以右(关节炎膝盖)/左(PBS对 照膝盖)(R/L)比率表示。比率> 1.10则认为关节肿胀。组间使用曼_惠特尼U检验 (Mann-Whitney U-test) (*0.05 >p> 0.01 ； **0.01 >p> 0.001)进行比较，每组 n = 7。图 2 GM-CSF 中和用 mAb(22E9mAb)，IL-17 中和用 mAb (1400.24.17)和 TNFa拮抗剂依那西普对滑膜中炎性细胞的涌入(A)和软骨破坏(B)的治疗效果。诱导 和治疗疾病方法参见方法部分。将小鼠在第28天处以安乐死，并制备其组织学切片并进 行视觉评分。各组与对照组的对比使用曼_惠特尼U检验，n = 7。图3:来自患有慢性SCW关节炎小鼠的典型膝关节显微照片，其中小鼠使用 GM-CSF 中和用 mAb(22E9) (A)、IL-17 中和用 mAb (1400.24.17) (B)、TNF a 拮抗剂依 那西普(C)和对照mAb (D)进行治疗。在初始诱导SCW关节炎后第28天，制作切片并 用番红0/快绿染色。P =髌骨，F =股骨，C =软骨。注意(A)和(B)中软骨完整保 存，而(C)和(D)中软骨蛋白聚糖缺失和侵蚀。原始放大倍数为200X。图4 局部IL-1 0 (A)和KC(Gro a等价物)(B)的水平，其通过在初次诱导 SCW关节炎后21天建立的髌骨1小时培养物的上清液中的Luminex珠测量。其处理如
图1说明所述。图5 使用对照抗体和抗GM-CSF抗体来治疗野生型(WT)和IL-17R缺陷型小 鼠的慢性SCW诱导的关节炎。㈧野生型(WT)和IL-17R-/-小鼠的关节肿胀。如前 所示，在WT小鼠中对照抗体治疗和抗GM-CSF抗体治疗的小鼠的关节肿胀在第22、23 和28天有非常明显的差别。(B)第28天的关节炎症和软骨蛋白聚糖(PG)破坏。(C)用 对照抗体治疗的WT小鼠的髌骨和股骨的软骨层的软骨破坏(侵蚀和软骨细胞死亡)(D) 对IL-17R-/-小鼠施予抗GM-CSF抗体后软骨损失减轻。(E)用对照抗体治疗的小鼠的 髌骨和股骨的软骨层有软骨PG缺失。(F)对IL-17R-/-小鼠施予抗GM-CSF抗体后有 软骨PG缺失。细节见图3。数据以平均值士SD表示，每组至少6只小鼠。重复实验 一次并获得类似结果。与使用对照抗体治疗的WT对照小鼠对比，*P<0.01，与使用抗 GM-CSF抗体治疗的IL-17R-/-小鼠对比，< 0.01，使用曼-惠特尼U检验。图6:治疗10天后，胶原诱导关节炎小鼠的宏观评分。关节炎第一个症状出现 (对应图6中的第1天)时，静脉注射治疗小鼠(也为图6中的第1天)使用⑴单次给予 抗IL17单克隆抗体只有mAb4211.5mg/kg，(ii)只给予抗GM-CSF单克隆抗体22E9 3mg/kg，或(iii)联合给予 mAb421 1.5mg/kg 和 22E9 3mg/kg。将使用 mAb421 阻断 IL-17 与使用22E9中和GM-CSF相结合，极大的降低了胶原诱导的关节炎的临床评分，而单独 使用mAb421或22E9均不能明显减轻疾病严重程度。腹腔注射地塞米松(2mg/kg，阳性 对照)2-3天后，小鼠关节炎症状消失。IgG2A抗体(同型对照)作为阴性对照。结果 为平均值+标准误(SEM) (n = 9-10只小鼠/组)。与IgG2A同型阴性对照治疗的小鼠 对比，*P < 0.05，*叩< 0.01，通过单因素方差分析(one-wayANOVA)和Dunnett的多 重比较试验确定。图 7 单次施予 22E9 3mg/kg (A)、mAb421 1.5mg/kg(B)、22E93mg/kg 和 mAb 421 1.5mg/kg的组合(C)、或同型对照(D) 10天后的典型的关节切片。关节在4%福尔马林中固定、脱钙、切片并用苏木素/伊红染色。施予大鼠IgG2a(图7D)的同型对照 小鼠表现出被标记的关节炎症伴有滑膜中大量细胞浸润(*)，以及被标记的关节破坏伴有 软骨和骨组织侵蚀(丨)。虽然严重程度有轻微减轻，但施予3mg/kg 22E9(图7A)或 1.5mg/kg mAb 421 (图7B)的小鼠也表现出严重的炎症和关节破坏；而单次施予3mg/kg 22E9和1.5mg/kgmAb421的联合治疗，则表现出非常显著减轻的炎症(*)(图7C)，并且 良好地保存了带有接近正常软骨表面的关节完整性(丨)(图7C)。下面的详细试验将使本领域技术人员能彻底理解本发明的要旨。实验动物雄性C57B1/6 小鼠购自 Charles River 公司(位于 Sulzfeld，Germany)。IL-17R 缺陷小鼠由Amgen公司(位于Seattle，WA, USA)的J.Peschon友好提供。上述小鼠养
在顶部具有过滤器的笼子里，水和食物无限制提供。使用的小鼠约为10-12周大小。所 有动物处理均经过机构伦理委员会批准。制备SCW和诱导SCW关节炎在托-休二氏培养基(Todd-Hewitt broth)中过夜培养化脓链球菌 T12 (Streptococcus pyogenes T12)。使用文献 van den Broek et al., Am J Pathol 133 (1),
139-149(1988)中描述的方法制备细胞壁。各实验都使用10000 Xg离心后的上清。该制 备物包含11%胞壁酸。将含有25ygSCW(鼠李糖成分)的6μ1磷酸盐缓冲液(PBS)， 经关节(La.)注射到幼鼠的右膝关节以诱导单侧关节炎(如文献Joosten etal.，AnnRheum Dis 59(3)，196-205(2000)中所述)。为了产生慢性链球菌细胞壁(SCW)诱导的关节 炎，分别在第0、7、14和21天进行右侧关节注射。重复的注射会引发慢性关节炎。对 照组中，左膝关节注射PBS。试剂和治疗方法使用大鼠mAb22E9(MM500CS，Perbio Science 公司(位于Bonn，Germany))中 和 GM-CSF。使用依那西普(Enbrel ； Wyeth Pharma 公司(位于 Miinster，Germany)) 阻断TNFci。一些研究已经报导在不同小鼠模型(包括CIA)中人类可溶性TNF受体Fc 融合蛋白的有效性。使用大鼠IgG2a同型对照品(BLD-400516-bulk，Biozol Diagnostica 公司(位于 Eching, Germany))禾口Humira (Abbott, Wiesbaden—Delkenheim 公司(位于 Germany))作为同型对照。使用大鼠抗鼠 IL-Ιβ mAbl400.24.17 (MM425, Perbio Science 公司(位于Bonn，Germany))中和IL_1 β。所有治疗通过腹腔(i.p.)注射300 μ g的剂 量给药，并且给予4次i)在第三次反应(第14天)前2小时，ii)在第17天，iii)在 第四次反应(第21天)前2小时和iv)最初疾病诱导后第24天。关节肿胀的测量SCW 关节炎中关节肿胀使用文献 Kraijsen et al.，Agents Actionsl 1 (6-7)， 640-2(1981)中所述99mTc摄取方法定量测定。该验证方法通过用外部gamma射线计算由 于局部血流增加和组织肿胀导致的炎症位点处的放射性同位素的累积。肿胀严重性由右 膝关节(炎性组)和左膝关节(对照组)的99mTc摄取的比值来表示。所有超过1.10的 值即被认为是关节肿胀。细胞因子和趋化因子测定一些细胞因子和趋化因子(包括IL-Ιβ、IL-6、TNF α、RANTES > KC和MIP-I α )的表达水平是在髌骨冲洗物中测定的。将髌骨及周围滑液组织从炎性膝关节中 分离，并在室温条件下在含有0.1% BSA的RPMI 1640培养基中培养1小时，如之前文献 Joostenetal., J Immunoll65 (11)，6553-8 (2000)所述。然后，将获得的上清以 IOOOXg 的速率离心5分钟。使用Luminex多分析物技术来确定细胞因子和趋化因子的水平。我 们使用的是BioRad公司(位于Munich，Germany)的BioPlex系统并结合多重细胞因子和 趋化因子试剂盒。组织学分析第28天，使用颈椎脱臼法处死小鼠。取出整个膝关节并固定在4%的福尔马林 中放置7天，然后在5%的蚁酸中脱钙，石蜡包埋处理。组织切片(7 μ m)用苏木素/伊 红(H/E)或番红O/快绿(SO)染色。在髌骨/股骨区域中相隔140 μ m的5个半连续区 域上对膝关节中组织病理学的改变进行评分。通过两个不同的观察者使用以下参数对连 续编码的玻片进行评分。在H/E染色玻片中，浸润滑液衬里的细胞数量评分为0-3。在 SO染色玻片中，软骨破坏评分范围为0-3。统计学分析实验组间差异使用曼-惠特尼U检验和GraphPad Prism 4软件进行检测。显著 性读数分组如下* = 0.05 > ρ > 0.01 ； ** = 0.01 > ρ > 0.001 ；并且 *** = ρ < 0.001.下述实施例将同样使技术人员能彻底的理解本发明的要旨。实施例1 系统性对GM-CSF的中和作用减轻慢性SCW模型中的关节肿胀在C57B1/6小鼠SCW关节炎的慢性期，对给予生物中和剂GM_CSF (mAb 22E9)、TNFa (依那西普)或IL_1 β (mAb 1400.24.17)治疗关节肿胀的效果，通过在第 15、16、22、23和28天摄入膝关节的99mTc的差异摄取进行研究。结果用注射关节炎 SCW的膝关节和注射PBS对照组的膝关节的99mTc摄取比值表达。系统施予GM-SCF中和抗体在第16、22、23和28天高效并显著地减轻了关节 肿胀，其相应ρ值分别为0.018、0.004、0.004和0.002 (
图1A)。IL-β中和剂也可以减 轻关节肿胀，尽管只在第22天(ρ = 0.011)和第23天(ρ = 0.001)观测到与对照组相比 膝关节的99mTc摄取比值的显著减少(
图1Β)。与预期相同，依那西普阻断TNFa，可以 中和人和鼠TNFa，在慢性SCW模型中对关节肿胀没有效果(
图1C)。相反，依那西普 之前显示对该疾病模型的急性期是有活性的。因此，慢性SCW关节炎中，对GM-CSF 的中和作用看来比对IL-I β的中和作用更有效，其效果一直持续到第28天，即最后一次 施予抗体后第4天。第二个独立研究证实了对GM-CSF的中和作用对慢性SCW模型中 减轻关节肿胀的效能。实施例2 对GM-CSF的中和作用减轻炎性细胞涌入滑膜和软骨破坏在第28天终止实验后，制备不同组小鼠关节的组织病理学切片。炎性细胞涌入 滑膜的程度和软骨组织损伤评价分别通过两个观察者对匿名的Η/Ε和SO染色的组织切片 来独立评分。所有三种治疗，用mAb 22E9中和GM-CSF，用mAbl400.24.17中和IL-1 β和
用依那西普阻断TNF α，在显著减轻炎性细胞涌入滑膜方面都是有效的(图2A)。尽管阻断TNF α有显著性效果，但看来弱于GM-CSF或IL-I β的中和作用，与对照相比ρ值 分别为0.042、0.004、和0.001。此外，尽管在依那西普治疗的小鼠中，炎性细胞涌入膝 关节有所减轻，其软骨组织并没有完整保存(图2Β)。与之相反，对GM-CSF的中和作 用显著地保护软骨组织免受损伤(ρ = 0.02 ； mAb22E9对比同型对照mAb)(图2B)。如 前所述，IL-I β中和作用可以有效保护软骨组织免受损伤(ρ = 0.004，抗IL-I β对比对 照组；图2Β)。不同治疗对软骨组织完整性的影响如图3所示，其中显示了三种治疗中，每组 选择一个典型的小鼠的关节进行番红O/快绿染色后的显微照片。在mAb 22E9治疗的小 鼠中观测到健康的软骨着色和完好保存的组织(图3A)，这体现了对GM-CSF的中和作 用对保护软骨完整性的效果。与之相反，在接受同型对照抗体的小鼠中(图3D)，其软 骨表现出破坏性侵蚀和蛋白聚糖(关节软骨一个主要的成分)损失所致的染色强度降低。 相似地，在依那西普治疗小鼠中看到蛋白聚糖的损失和软骨损失增加(图3C)。这与之 前在关节炎的慢性SCW模型中显示TNF α无关性的研究是一致的。因此，在本研究中 通过抗体中和IL-I β对软骨有着显著性的保护作用(图3Β)。实施例3 对GM-CSF的中和作用降低膝关节中IL-I β和KC的产生为了更好的理解GM-CSF的保护性作用，和它与IL-I β的相互关系，我们研究 了膝关节洗脱液中各种细胞因子和趋化因子的浓度。因为在之前的实验中重复发现未受 影响的对照组膝盖(左)中的水平低于检测限，我们只对关节炎膝盖(右)进行了分析。与在接受同型对照抗体治疗的小鼠膝关节中检测的水平相比，使用mAb 22E9中 和GM-CSF可显著的减少局部的IL-I β (ρ = 0.042 ； 22Ε9-治疗对比对照组)(图4)。 而使用依那西普阻断TNF α则对关节中IL-I β的水平没有影响(图4)。并且如我们所 预料的，在接受mAb中和IL-I β的小鼠中，IL-I β的水平接近基线。所有三种治疗都 导致了关节炎膝关节中趋化因子KC (鼠GRO-α)的表达显著性降低(22Ε9对比对照组ρ =0.0047 ；依那西普对比对照组ρ = 0.0007 ；抗IL-1 β抗体对比对照组ρ = 0.007)。所 研究的任何治疗都没有影响IL-6和RANTES的局部水平(数据未显示)。IL_2、TNF α 和GM-CSF的水平低于分析检测限，即小于10pg/ml。实施例4 IL-17信号缺乏时，对GM-CSF的中和作用可以增强对软骨破坏的保护作用中和GM-CSF能减轻关节肿胀并保护软骨免受损伤，其效能与中和IL-I β所观 察到的相似。其后，我们使用抗GM-CSF mAb在IL-17R缺陷小鼠的慢性SCW关节炎 中进行了相似的研究。IL-17R缺陷在慢性SCW关节炎中导致潜伏性关节肿胀和软骨破 坏(图5A)。关节炎模型中，GM-CSF和IL-17信号作为联合靶标可以导致对关节肿胀 的强的增大的抑制(图5A)。尽管抗GM-CSF治疗和IL-17R缺陷都导致细胞涌入减少， 联合靶标不能使关节炎症有显著减轻(图5B)。然而有趣的是，在使用抗GM-CSF治疗 的IL-17R缺陷小鼠中，蛋白聚糖的消耗和软骨组织损伤(软骨细胞死亡和侵蚀)显著地 减轻了(图5B-E)。上述实验结果表明了抗GM-CSF对软骨组织的保护作用可以通过T 细胞细胞因子IL-17的额外靶向而增强。实施例5
慢性复发性SCW的关节炎小鼠模型的特征为如人类慢性RA晚期时典型的严重 关节破坏。与在CIA小鼠模型和急性SCW关节炎模型中观察到的相反，当IL-I β开始 作为主要致病因素(72)时，TNFa中和作用在控制慢性SCW关节炎中不再有效。我们 的研究证实了在慢性SCW关节炎的软骨破坏中TNF α的无关性和IL-I β的关键作用。第一次在该特殊模型中研究了 GM-CSF阻断，并发现当在疾病慢性阶段腹腔注 射300μ g抗体时，其在SCW注射的膝盖中对关节肿胀和软骨破坏中的深远的抑制作用。 这说明，在小鼠中施予一定剂量的抗GM-CSF抗体(该剂量相当于在人体中约lmg/kg的 抗体剂量(在异速生长改正之后))，足以纠正关节炎膝关节中GM-CSF的水平。慢性 关节炎模型中对GM-CSF的中和作用的治疗效能是有着非常重大的意义的。抗GM-CSF 比抗IL-I β能更有效的控制关节肿胀，而TNF α阻断是无效的。由于TNF α的中和作 用对炎性细胞的涌入和KC趋化因子的水平有一定影响，因此异常的TNF α的产生也许 仍然在慢性SCW关节炎中有一定效果。然而，对比于其它关节炎小鼠模型，与该疾病 的急性阶段相反，TNFci控制该慢性疾病的作用减小。在软骨保护中，抗GM-CSF和抗 IL-I β治疗都非常有效。GM-CSF和IL-I作用之间的互相依赖性已在其它关节炎模型中 被报导。在这个IL-I诱导关节炎并在其后注射mBSA的模型中，GM-CSF表现出占优 势的致病作用。GM-CSF KO小鼠中的GM-CSF缺乏，或在野生型动物中的对GM-CSF 的中和作用，都可以显著地减轻关节炎。然而，在慢性SCW关节炎中，GM-CSF看起 来处于IL-I β的上游，因为对GM-CSF的中和在关节炎关节中减少IL-I β水平。通过 活化的巨噬细胞和其它GM-CSF刺激的免疫细胞来降低IL-I β的产生，也可能解释为什 么抗GM-CSF的治疗在我们的模型中对软骨有保护作用。在急性SCW的模型中，我们 也发现，抗GM-CSF的抗体能抑制IL-I β水平，而TNF α阻断剂依那西普则不能。在 RA的CIA小鼠模型中，GM-CSF的阻断可以显著减少IL-I β和TNF α的表达。虽然通过转录因子NF-κ B及其它的活化使得前炎性细胞因子(如TNFa和 IL-I β)在不同免疫细胞中急性诱导GM-CSF的表达，但细胞因子的层次在炎症后期似乎 翻转，其中GM-CSF接管控制TNF α和IL-I β的产生，也许还接管控制其它细胞因子和 趋化因子。在抑制关节炎组织中TNF α和IL-I β的同时，对GM-CSF的阻断也有可能 降低依赖于GM-CSF的免疫细胞(如粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)的活性和存活率。 可以想到GM-CSF不仅直接诱导IL-I β禾PTNFa表达，而且可以导致协同的抗凋亡作用 和对先天免疫系统中多重细胞的持续性激活作用，因而间接地增加IL-I β和TNF α的产 生。对细胞周期和存活的影响已经在mBSA关节炎模型中展示，其中体内对GM-CSF的 中和作用导致关节炎关节中整体细胞性和周期细胞数的显著减少。实施例6 除了在野生型动物的慢性SCW关节炎过程中阻断GM-CSF，我们还在IL-17R 缺陷小鼠中进行了实验。IL-17由Thl7细胞产生，其中Thl7细胞能同时产生TNF α和 GM-CSF。在TNFa存在时，IL-17可以诱使滑膜细胞产生GM-CSF，暗示IL-17在 GM-CSF上游起作用。另外，用LPS刺激经GM-CSF治疗的骨髓细胞，可以产生IL-23， 其为可产生IL-17的Thl7细胞的重要存活因子。在本发明之前，尚未研究体内外中对 IL-17和GM-CSF的联合阻断。本发明人的本研究首先显示出，相对于阻断单独通路， 同时阻断IL-17和GM-CSF信号通路能更好地抑制关节肿胀和增加对软骨破坏的保护。这种对软骨的强作用也许可以通过在IL-17和(GM-CSF诱导的HL-Ιβ之间的协同作用 来解释，因为这两种细胞因子之前表现出对通过RA病人的滑膜产生细胞因子的过程和在 骨关节炎软骨中产生PGE2和NO的过程具有协同作用。本发明的研究和之前的研究都强 烈支持这一观点，即对GM-CSF的中和作用可能在人类RA患者中和在对TNF α阻断不 再有反应或从一开始就没有反应的患者中具有治疗潜力。另外，本发明展示抗GM-CSF 和抗IL-17的联合治疗在RA和其它自身免疫和炎性疾病中均有非常深远的治疗效果。实施例7 胶原诱导的关节炎(CIA)是一种被广泛接受的基于对抗软骨胶原II型(CII)的T 细胞和抗体介导的自身免疫反应性的关节炎小鼠模型。所述模型与人RA有一些共同的 临床、组织病理学和免疫性特征，其主要特征为滑膜炎症，伴随有严重的软骨和骨组织 侵蚀。此处所述本研究的目标是在CIA小鼠模型系统中评估联合施予GM-CSF中和化 合物和IL-17中和化合物的治疗效能。特别地，在CIA发作后，研究对小鼠施予(i)单 独的抗IL-17单克隆抗体CmAb 421)、(ii)单独的抗GM-CSF单克隆抗体(mAb 22E9)、 和(iii)联合的两种抗体的治疗效果，并与阴性对照(IgG2A)和阳性对照(地塞米松)比 较。抗 IL-17 抗体 mAb421 购自 R&D Systems 公司，mAb 22E9 购自 Perbio Science 公 司。大鼠IgG2a同型对照抗体来自Biolegend公司。所有抗体在_80°C储存。地塞米松 来自Centrafarm公司，并于室温储存。所有化合物用无菌PBS稀释给药。对上述化合物对CIA小鼠的治疗效果设计了 7周的研究。第O天，在将雄性 DBA/1J小鼠用异氟烷麻醉后，在其尾巴根部注射IOOyg的牛CII使其产生免疫反应。第 21天，将上述小鼠腹腔内加压注射IOOyg溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)的CII，之后几天 内，关节炎就会产生。将处于0.05M乙酸中的浓度为2mg/ml的牛II型胶原(CII)用相 同体积的弗氏完全佐剂(2mg/ml的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)株H37Ra) 进行乳化。出现关节炎的初步症状(得分大于等于0.25)时，将小鼠顺序分配到如下所列 出的不同的实验组，并进行另外10天的观察研究。当指头和爪子其它部分有明显的红色和/或肿胀改变时，小鼠即被认为是患有 关节炎。每个爪子的关节炎症通过视觉评分，如文献R.Smeets等，Arthritis Rheum 2003 所述，每个爪子评分范围为0-2，每个动物最高评分为8 (4个有关节炎症状的爪子，每个 最高评分为2): O为没有炎症，1为轻度炎症，1.5为显著炎症，2为严重炎症。从第21 天到第45天，由对实验组别不知情的独立的观察者每周进行三次评分。关节炎症状产生时，使用单独剂量的抗体进行给药。每周三次(周一、周三和 周五)进行剂量为2mg/kg的地塞米松腹腔注射。到第35天仍没有表现出任何关节炎症 状的小鼠被认为是无反应者，并从进一步的实验分析中去除。根据之前的实验结果，研究中药物剂量设定为1.5mg/kgmAb421。对于抗 GM-CSF抗体22E9，剂量设定为3mg/kg。本研究使用这些剂量来评估在胶原诱导的关 节炎期间对IL-17和GM-CSF的联合阻断的效果。地塞米松作为阳性对照，大鼠IgG2a 抗体作为阴性对照。此外，本研究包括以下实验组采用抗IL_17(mAb421)治疗、采用 抗GM-CSF (22E9)治疗、以及采用它们联合给药治疗，其中均使用上述剂量给药。实验组mAb421 1.5mg/kg+ 大鼠 IgG2a 3mg/kg (共 4.5mg/kg)
22E9 3mg/kg+ 大鼠 IgG2a 1.5mg/kg
mAb421 1.5mg/kg+22E9 3mg/kg大鼠IgG2a l5mg/kg地塞米松2mg/kg如图6所示，使用mAb421中和IL-17与使用22E9中和GM-CSF的联合，极为 显著地减轻胶原诱导的关节炎的临床评分。与之相反，单独采用mAb421或22E9的治疗 没有显著降低疾病的严重性。腹腔注射地塞米松(2mg/kg，阳性对照)2到3天后，关节 炎症状消失。IgG2A抗体治疗的小鼠(阴性对照)表现出明显的关节炎严重性的进展。组织病理学分析前爪和后爪(左和右，4例样品/每只小鼠)。将爪子放在4% 福尔马林溶液中固定。在用EDTA或标准脱钙溶液脱钙3天后，将爪子包被在石蜡中 (paraplast )，用h&E染色，并通过光学显微镜评估。组织病理学评估只限于爪子的指 关节(跗骨/腕骨和手指)。组织病理学评估显示，较低的四肢关节(腕/跗，手指)有亚急性到慢性的关节 炎。关节炎的特点是滑膜变厚(滑膜增生)、关节内渗出物和主要在关节囊中的显著的混 合细胞浸润。在所述情况中，炎症细胞反应也出现在结缔组织和肌腱。此外，在更多的 慢性情况中，对由纤维组织和占大部分的单核细胞组成的典型肉芽组织进行了观察。对 指关节软骨的侵蚀变化也进行了观察。在大多数情况下，超过一个关节受到了影响(多 关节炎)。图7所示为单独施予22E93mg/kg(A)、单独施予mAb421 1.5mg/kg(B)、联 合施予22E9 3mg/kg和mAb 421 1.5mg/kg (C)、或施予同型对照15mg/kg (D) 10天后典型 的关节切片图。将关节固定于4%福尔马林，脱钙，切片并用苏木/曙红染色。接受同 型对照治疗的小鼠(图7D)显示出在滑膜中有显著的关节炎症并伴随有大量细胞浸润， 以及软骨关节破坏和骨侵蚀。虽然严重程度稍轻，接受3mg/kg 22E9 (图7A)或1.5mg/ kg mAb 421 (图7B)的小鼠也表现出严重的炎症和关节破坏，而接受单次施予22E9 3mg/ kg和mAb421 1.5mg/kg联合治疗的小鼠显示出显著减轻的炎症，关节的完整性也得到了 较好的保存，并伴随有其表面接近正常的软骨表面(图7C)。因此，患有关节炎的大部 分病例是出现在阴性对照组(大鼠IgG2a)的。经过2到3天地塞米松(阳性对照)给药 后，没有检测到关节炎。比较阴性对照与在CIA小鼠中单独给予mAb421或mAb22E9、 或联合给药，关于关节炎的发生和严重程度的最好的结果出现在mAb421与mAb22E9的 联合给药组。结论本发明中发明人探索了对GM-CSF的中和作用在两种不同关节炎动物模型系统 中的治疗效能，即ω不依赖于TNF α的慢性SCW关节炎动物模型和(ii)依赖于TNF α 的CIA模型。另外，他们研究了通过抑制GM-CSF和IL-17通路途径来阻断先天性免疫 和获得性免疫的效果。该实验通过在基因缺乏IL-17受体的小鼠(IL-17R-KO小鼠)中 中和GM-CSF实现，或是使用中和GM-CSF和IL-17的单克隆抗体联合治疗实现。发明 人意外发现，通过联合阻断GM-CSF和IL-17通路途径，两种类型的炎性疾病均可以一 种高效的方式治疗。在CIA模型中，抑制GM-CSF的化合物和抑制IL-17的化合物的联 合给药可以显著地降低胶原诱导关节炎的临床评分，而单独给予抑制GM-CSF的化合物 或抑制IL-17的化合物则不能显著减轻关节炎的严重程度。另外，详细的组织病理学分析显示了联合治疗对关节炎症以及对软骨和骨的破坏产生的有益效果。因此，联合阻断两 条通路可以高效保护机体免于炎症和关节破坏。直到最近，人们仍然假定GM-CSF处在 IL-17 的下游(参见文献 Kawaguchi M.等，J.Allergy Clin.Immunol.114 (2004)，444-450 ； Starnes T.et al.， The Journal of Immunology 169 (2002)，642-646 ； Laan M.et al.， Eur. Respir.J.21 (2003), 387-393)，因而这些结果非常令人惊讶。因此，人们并不能预料到对 两条通路的联合阻断会有额外的或协同的效应。本发明申请首先证实了体内对IL-17和 GM-CSF的联合阻断的有益效果。相对于阻断单独通路，对IL-17和GM-CSF通路的同 时阻断，能更好地抑制关节肿胀和增加对软骨破坏的保护。本文所示实验数据提出这样 一个强有力的观点，联合抗GM-CSF和抗IL-17的治疗，不止对RA有非常深远的治疗效 果，并且对其它如上定义的自身免疫和炎症疾病也有非常深远的治疗效果。
权利要求
1.一种在患有炎性疾病的个体中治疗炎性疾病的方法，所述方法包括对所述个体施予(a)一种中和GM-CSF的化合物；以及(b)一种中和IL-17的化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中(1)在施予所述中和IL-17的化合物之前施予所述中和GM-CSF的化合物；(2)在施予所述中和IL-17的化合物之后施予所述中和GM-CSF的化合物；或(3)同时施予所述中和GM-CSF的化合物和所述特异性结合并且中和IL-17的化合物。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述个体为人或非人类灵长类动物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述中和GM-CSF的化合物选自由多肽、模拟 肽、核酸或小分子组成的组。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述多肽是结合GM-CSF或GM-CSF受体的抗体 或其功能片段。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述抗体为人类单克隆抗体或其功能片段。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述抗体或其功能片段结合至GM-CSF的表位， 优选至GM-CSF的不连续表位，所述表位优选包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/或氨 基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述不连续表位进一步包括(a)氨基酸第28-31位(LSRD)；(b)氨基酸第32-33位(TA)和/或 (C)氨基酸第21-22位(EA)。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重链可变区 包含CDR3，其中该CDR3包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列组成的组。
10.如权利要求9所述的方法，其中任意一个所述的重链可变区CDR3序列与SEQID NO 14所示的重链可变区CDRl序列和SEQ IDNO 15所示的重链可变区CDR2序列一 起存在于重链可变区。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中该CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， 该CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，并且该CDR3包含SEQ ID NO 18所示 氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区进一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重链可变 区包含如SEQ ID NOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变区包 含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中该CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列，该 CDR2具有如SEQ ID NO 17所示的氨基酸序列，该CDR3具有如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列；并且在其重链可变区包含CDRl区、CDR2区和CDR3，其中该CDRl区 包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列，该CDR2区具有如SEQ ID NO 15所示的氨 基酸序列，该CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包含如SEQID NO: 34中所示的轻链氨基酸序列，并且包含选自如SEQ ID NOs 35-48中任一所示的 重链氨基酸序列。
16.如权利要求9所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包含与如SEQ ID NOs 1-48和52-56中任一所示的氨基酸序列各自有至少70%同源性的氨基酸序列。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述中和IL-17的化合物选自由多肽、模拟肽、 核酸或小分子组成的组。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述多肽为结合IL-17或IL-17受体的抗体或其 功能片段。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述抗体和其功能片段分别是人类单克隆抗体和 其功能片段。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述炎性疾病选自由类风湿性关节炎(RA)(包 括对用TNF-Ci中和剂治疗有抗药性的RA)、哮喘、多发性硬化症(MS)、慢性阻碍性 肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化(IPF)、炎性肠道疾病 (IBD)、克罗恩氏病、葡萄膜炎、黄斑变性、结肠炎、银屑病、沃勒变性、抗磷脂抗体综 合征(APS)、急性冠脉综合征、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多发软骨炎(RP)、急性 或慢性肝炎、失败的整形外科植入、血管球性肾炎、狼疮和自身免疫性疾病组成的组。
21.一种在患有肿瘤性疾病的个体中治疗肿瘤性疾病的方法，其中所述方法包括对所 述个体施予(a)一种中和GM-CSF的化合物；和(b)一种中和IL-17的化合物。
22.如权利要求21所述的方法，其中(a)在施予所述中和IL-17的化合物之前施予所述中和GM-CSF的化合物；(b)在施予所述中和IL-17的化合物之后施予所述中和GM-CSF的化合物；或(C)同时施予所述中和GM-CSF的化合物和所述中和IL-17的化合物。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述个体为人或非人类灵长类动物。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述中和GM-CSF的化合物选自由多肽、模拟 肽、核酸或小分子组成的组。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述多肽是结合GM-CSF或GM-CSF受体的抗 体或其功能片段。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗体和其功能片段分别为人类单克隆抗体和 其功能片段。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其功能片段结合至GM-CSF的表 位，优选至GM-CSF的不连续表位，所述表位优选包含氨基酸第23-27位(RRLLN)和/ 或氨基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述不连续表位进一步包含(a)氨基酸第28-31位(LSRD)；(b)氨基酸第32-33位(TA)和/或(C)氨基酸第21-22位(EA)。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重链可 变区包含CDR3，其中该CDR3包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列组成的组。
30.如权利要求29所述的方法，其中任意一个所述的重链可变区CDR3序列与SEQ ID NO 14所示的重链可变区CDRl序列和SEQID NO 15所示的重链可变区CDR2序 列一起存在于重链可变区。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中该CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸序列， 该CDR2包含SEQ ID NO 17所示氨基酸序列，并且该CDR3包含SEQ ID NO 18所示 氨基酸序列。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区进一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重链可变 区包含如SEQ ID NOs 20-33、52和53中任一所示的氨基酸序列。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻链可变 区包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中该CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨基酸序 列，该CDR2具有如SEQ IDNO 17所示的氨基酸序列，该CDR3具有如SEQ ID NO 18所示的氨基酸序列；并且在其重链可变区包含CDRl区、CDR2区和CDR3，其中该 CDRl区包含如SEQ ID NO 14所示的氨基酸序列，该CDR2区具有如SEQ ID NO 15 所示的氨基酸序列，该CDR3具有如SEQIDN0s: 1_13和56中任一所示的氨基酸序列。
35.如权利要求29所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包含如SEQ ID NO 34中所示的轻链氨基酸序列，并且包含选自如SEQ ID NOs: 35-48中任一所示 的重链氨基酸序列。
36.如权利要求29所述的方法，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包含与如SEQ ID NOs 1-48和52-56中任一所示的氨基酸序列各自有至少70%同源性的氨基酸序列。
37.如权利要求21所述的方法，其中所述中和IL-17的化合物选自由多肽、模拟肽、 核酸或小分子组成的组。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述多肽为结合IL-17或IL-17受体的抗体或其 功能片段。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述抗体是人类单克隆抗体或其功能片段。
40.如权利要求21所述的方法，其中所述肿瘤性疾病为癌症。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述癌症为白血病、多发性骨髓瘤、胃癌或皮肤癌。
42.一种药物组合物，该组合物包含(a)一种中和GM-CSF的化合物；和(b)一种中和IL-17的化合物。
43.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述中和GM-CSF的化合物选自由多 肽、模拟肽、核酸分子或小分子组成的组。
44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述多肽是结合GM-CSF或GM-CSF受 体的抗体或其功能片段。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其中所述抗体为人类单克隆抗体或其功能片段。
46.如权利要求44或45所述的药物组合物，其中所述抗体或其功能片段结合至包含 氨基酸第 23-27 位(RRLLN)和 / 或氨基酸第 65-77 位(GLR/QGSLTKLKGPL)的 GM-CSF 的表位，该表位优选为GM-CSF的不连续表位。
47.如权利要求46所述的药物组合物，其中所述不连续表位进一步包括(a)氨基酸第28-31位(LSRD)；(b)氨基酸第32-33位(TA)和/或(C)氨基酸第21-22位(EA)。
48.如权利要求44所述的药物组合物，其中所述抗体或其功能片段在其重链可变区 包含CDR3，其中该CDR3包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NOs 1-13和56中任一所示的氨基酸序列组成的组。
49.如权利要求48所述的药物组合物，其中任意一个所述的重链可变区CDR3序列与 SEQ ID NO 14所示的重链可变区CDRl序列和SEQ ID NO 15所示的重链可变区CDR2 序列一起存在于重链可变区。
50.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区中包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中该CDRl包含SEQ ID NO 16所示氨基酸 序列，该CDR2包含SEQID NO 17所示氨基酸序列，并且该CDR3包含SEQ ID NO 18所示氨基酸序列。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区进一步包含如SEQ ID NOs 19、54和55中任一所示的氨基酸序列。
52.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其重 链可变区包含如SEQ ID NOs 20-33、52、和53中任一所示的氨基酸序列。
53.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段在其轻 链可变区包含CDR1、CDR2禾PCDR3，其中该CDRl包含如SEQ ID NO 16所示的氨 基酸序列，该CDR2具有如SEQ ID NO : 17所示的氨基酸序列，该CDR3具有如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列；并且在其重链可变区包含CDRl区、CDR2区和CDR3，其 中该CDRl区包含如SEQ IDNO 14所示的氨基酸序列，该CDR2区具有如SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列，该CDR3具有如SEQ ID NOs 1-13或56中任一所示的氨基酸序 列。
54.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包含如 SEQ ID NO 34中所示的轻链氨基酸序列，并且包含选自如SEQ ID NOs 35-48中任一 所示的重链氨基酸序列。
55.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述人类单克隆抗体或其功能片段包含与 如SEQ ID NOs 1-48和52-56中任一所示的氨基酸序列各自有至少70%同源性的氨基酸序列。
56.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述中和IL-17的化合物选自由多肽、模 拟肽、核酸分子或小分子组成的组。
57.如权利要求56所述的药物组合物，其中所述多肽为结合IL-17或IL-17受体的抗 体或其功能片段。
58.如权利要求57所述的药物组合物，其中所述抗体f是人类单克隆抗体或其功能片段。
59.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗炎性疾病。
60.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述炎性疾病选自由类风湿性关节炎 (RA)(包括对用TNF-α中和剂治疗有抗药性的RA)、哮喘、多发性硬化症(MS)、慢 性阻碍性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、特发性肺纤维化(IPF)、炎性 肠道疾病(IBD)、克罗恩氏病、葡萄膜炎、黄斑变性、结肠炎、银屑病、沃勒变性、抗 磷脂抗体综合征(APS)、急性冠脉综合征、再狭窄、动脉粥样硬化、复发性多发软骨炎 (RP)、急性或慢性肝炎、失败的整形外科植入、血管球性肾炎、狼疮和自身免疫性疾病 组成的组。
61.如权利要求42所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗肿瘤性疾病。
62.如权利要求61所述的药物组合物，其中所述肿瘤性疾病为癌症。
63.如权利要求62所述的药物组合物，其中所述癌症为白血病、多发性骨髓瘤、胃癌 或皮肤癌。
全文摘要
本发明涉及一种在患有炎性疾病的个体中治疗炎性疾病的方法，所述方法包含对所述个体施予一种中和GM-CSF的化合物和一种中和IL-17的化合物。
文档编号A01K67/027GK102014958SQ200980115521
公开日2011年4月13日 申请日期2009年4月28日 优先权日2008年4月29日
发明者克里斯蒂娜·普莱特-齐贝克 申请人:米克罗麦特股份公司