专利名称：软骨修复的合成物和方法
软骨修复的合成物和方法技术领域
总体而言，本发明是关于为有需要的患者进行软骨修复时所用的合成物和方 法。更具体的说，发明涉及自体同源合成物和方法，用于在有需要的患者需要软骨修复 的部位催生软骨。
背景
间充质干细胞是指位于血液、骨髓、真皮和骨膜中的多能性母细胞或胚胎样细 胞。通常情况下，这些细胞不但能够在一段时间后进行自我再生，而且在不同的环境 条件下，还可分化成软骨、骨骼和其它结缔组织。近来，许多研究人员已就利用这些细 胞修复或再生靶组织(如，骨骼、软骨等)的可能性展开研究。在这种情况下，据报 道，MSC在许多动物模型中都拥有再生能力。请参见Acosta et al. (2005)Neurosurg Focus 19(3) E4 ； Barry (2003) Novartis FoundSymp.249 86-102，170-4，239-41; Brisbyet al. (2004) Orthop Clin.NorthAm.35 (1) 85-89; Buckwalter and Mankin (1998) Instr Course Lect.47 487-504 ； Caplan (1991) J Orthop Res.9 (5) 641-650。
最近，Centen0etal.(美国专利申请11/773,774)描述了一种使用增长渠道和自体 同源血小板裂解液扩展MSC的方法。此外，还描述了将特定水平的生长因子(血小板裂 解液或血小板)与扩展的MSC—同植入患者需要修复之部位的方法。这些生长因子的浓 度根据实现细胞最佳体外扩展所需的血小板裂解液百分比确定。
视细胞因子接触、环境条件(压力、接合机会、入路治疗等)或其它化学品暴露 情况，MSC可很容易在培养中进行分化。例如，暴露于各种浓度的TGF-beta、FGFfP/ 或PDGF都会影响培养中产生的最终细胞表型。此外，延长细胞的培养时间也可影响分 化潜力。可就特定视觉形态、融合或密度培养细胞，这些都会对所产生的最终细胞产物 及其组织修复的特定类型的潜力产生影响。
在使用MSC置换或修复组织时，一个值得关注的问题是使用自体同源细胞还是 非自体同源细胞。虽然，传统上认为MSC具有免疫豁免特权，但近期的调查证明，其自 然杀伤细胞系统会在外界宿主中产生活性。(Spaggiari、Capobianco et al.2006)这就造成 利用非自体同源细胞的难度，因为预期宿主的免疫系统会攻击这些外来细胞，并很可能 大大削弱移植MSC的种群，从而严重限制其修复能力。
现在该领域需要一种MSC扩展技术，不使用未经FDA(美国食品和药物管理局) 批准的药物或生长因子，并可以有效用于置换有需要的患者的组织。如果患者需要修复 的组织为软骨，则更是如此。软骨修复是健康护理中的一个重要问题，而且会随着美国 人口年龄中位数的不断增长而日益重要。
现在需要自体同源技术来发展基于MSC和非MSC的软骨修复技术。
本发明旨在克服上述一个或多个问题。
实施例概要
本发明提出了可促进有需要的患者软骨修复和/或置换的修复合成物。修复合 成物包括有效数量以血小板为主的材料，以及一种或多种软骨诱导剂。在某些情况下，以血小板为主的材料和/或软骨诱导剂从自身取得。
以血小板为主的材料中包括一种或多种以下溶液血小板裂解液、富血小板血 浆、富血小板纤维蛋白和/或全细胞血小板浓缩物。
软骨诱导剂中包括促进有需要的患者的软骨形成所需的生长因子、细胞因子、 类固醇激素和营养物。以血小板为主的材料会与一种或多种制剂结合。软骨诱导剂可从 患者自身取得。
发明的修复合成物还可包括以细胞为主的材料，包括间充质干细胞、软骨细 胞、分离的骨髓有核细胞、软骨祖细胞、造骨细胞、胚胎干细胞或其它干细胞系。细胞 通常为患者的自体同源细胞，在软骨修复前从患者体内采集，并扩展至足够的数量，用 于最佳治疗。
本发明的修复合成物还可包括载体材料，包括凝胶、水凝胶、可吸收聚合物 和类似物。载体在软骨修复部位发挥软骨形成支架的作用。载体可与修复合成物或部分 修复合成物同时添加到修复部位。
本发明提供了可用于治疗应用的药物合成物。其中的药物合成物用于治疗需要 软骨修复的患者，在某些情况下，用于罹患骨关节炎或类似退行性疾病的患者。
本发明提供含有下列一种或多种材料的组套一种或多种以血小板为主的材 料、一种或多种软骨诱导剂、一种或多种以细胞为主的材料以及一种或多种载体。在某 些方面，除材料本身以外，组套中还包括从患者体内采集目标材料所需的材料，例如采 集和备制血小板裂解液所需的工具和用品。组套可包括小瓶、组织培养瓶、培养基和其 它类似实验室材料，用于采集和分离本发明所需材料。
本发明还提供了几种方法，以协助有需要的患者进行软骨修复和置换。方法 包括采集和备制以血小板为主的材料，例如，从需要进行软骨修复治疗的患者体内采集 浓度为5%至40%的血小板裂解液；可选择从同一患者体内采集和备制软骨诱导剂，例 如，从患者身上分离IGF-1，和/或获取和施用非自体同源软骨诱导剂(如地塞米松、 抗坏血酸等)；可选择从同一患者体内采集和备制以细胞为主的疗法，例如，从患者骨 髓中采集和分离间充质干细胞，和/或获取和施用非自体同源以细胞为主的材料；可选 择获取载体材料；在修复部位施用发明的修复合成物；监督需要额外软骨修复治疗的患 者，并重新施用所发明的修复合成物。
阅读下列详细叙述并审核附加的权利要求，即可了解本发明的上述和各种特点 和优势。
详细内容
定义
以下定义的提供，旨在促进对本文中常用的若干术语的理解，并无意限制本披 露的范围。
“大约”指可能与名义数值相差+/_10%。请注意，无论是否明确说明，该差 异始终适用于本文所载任何数值。
“软骨诱导剂”指可以诱导或促进软骨形成的任何制剂，其软骨形成率要比正 常、未经治疗受试者的软骨形成率高。软骨诱导剂包括但不限于生长因子、细胞因 子、激素和各种必要营养物。生长因子的实施例包括转化生长因子-beta(TGF-β)、纤维母细胞生长因子(FGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)；细胞因 子的实施例包括细胞因子样I(Cytll)；激素的实施例包括人类生长激素(HGH)和睾丸激 素；必要营养物的实施例包括抗坏血酸、丙酮酸盐和氨基酸。软骨诱导剂可包括上述一 种或多种材料，例如，TGF-β与丙酮酸盐的混合物。
“间充质干细胞”或“MSC”指能够分化成造骨细胞、软骨细胞、肌细胞、 脂肪细胞、神经细胞、胰岛细胞以及其它类似细胞的多能干细胞。此外，美国专利号 5,486,359、6,387,367和5,197,985所述MSC的处理方法和化合物，以全文引用的方式并 入本文。具体而言，间充质干细胞是一种多能干细胞，位于骨髓、外周血、脂肪组织和 其它类似来源。本发明的MSC的来源可从需要恢复/置换疗法的患者(或适合的授体) 的髂骨(或其它来源，如IVD、骨膜、滑液、或者椎体或椎弓根)中获取，此类患者在本 文中被提述为“有需要的患者”(注意，脂肪组织、滑膜组织、结缔组织等其它来源最近 已获识别，并且也被视为本发明范围内的MSC来源)。在一实施例中，已采用Centen0 美国专利申请60/761,441中所述方法，或通过Caplanetal.美国专利号5,486,359中所述的 塑胶粘附法，获取和“分离”约lO-lOOcc骨髓。出于各种用途，以上各参考文献均以 全文引用的方式并入本文。
“血小板裂解液”指血小板中所含的自然生长因子，通过血小板裂解释放而形 成的混合物。裂解释放可通过化学方法(即CaCl2)、渗透法(使用经蒸馏的H2O)或通 过冷冻/融化程序实现。本发明中的血小板裂解液也可以从全血中获得，并且可以采用 美国专利号5,198,357(已通过引用的方式并入本文)中所述的方法制备。
“修复”指将部分或全部表面软骨修复至可接受的手术条件。在某些情况下， 需进行软骨修复的患者可能要在未治疗状况的基础上增加5%、10%, 15%, 20%, 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%, 90%, 95%, 100%,和 100+%的软骨。
“全细胞血小板浓缩物”、“富血小板血浆”和“富血小板纤维蛋白”与该 领域内普遍悉知的含义相同。例如，富血小板血浆(PRP)可通过Landesberg et al.J Oral Maxillogac Surg 58 297, 2000中所述的方法获得，该方法以全文引用的方式并入本文。
发明的方向
本发明旨在提供软骨修复合成物，促进有需要的患者的软骨修复。实施例包括 联合使用具有治疗学上的有效数量的血小板裂解液与一种或多种软骨诱导剂。在某些情 况下，血小板裂解液为自体同源血小板裂解液，软骨诱导剂为自体同源软骨诱导剂。
在一实施例中，修复合成物包括具有治疗学上有效数量的一种或多种富血小板 血浆、富血小板纤维蛋白或全细胞血小板浓缩物以及一种或多种软骨诱导剂。富血小板 血浆、富血小板纤维蛋白和/或全细胞血小板浓缩物均可从自身取得。在某些情况下， 富血小板血浆、富血小板纤维蛋白和/或全细胞血小板浓缩物可以替代血小板裂解液。 就本发明而言，任何一种或多种血小板裂解液、富血小板血浆、富血小板纤维蛋白和/ 或全细胞血小板浓缩物统称为以血小板为主的材料。
在另一实施例中，修复合成物包括血小板裂解液与两种或多种富血小板血浆、 富血小板纤维蛋白或全细胞血小板浓缩物的混合物(具有治疗学上的有效数量)以及一种 或多种软骨诱导剂。如上所述，血小板裂解液和两种或多种富血小板血浆、富血小板纤维蛋白或全细胞血小板浓缩物均可从自身取得。在某些实施例中，软骨诱导剂也从自身 取得。
在另一实施例中，本发明的修复合成物包括大约10,0000至10,000,000,000个间 充质干细胞。通常情况下，间充质干细胞均为自体同源细胞，可按照上文定义部分或美 国专利申请号11,773,774(和美国临时专利申请号61/014,987)所述的方法备制，这些专 利申请以引用的方式并入本文。或者，可将大约10,000至10,000,000,000个软骨细胞与 本发明的修复合成物混合，其中软骨细胞可为自体同源细胞。可利用本文和相关技术评 论(例如，Johnson etal.，Tissue Engineering, 200410(9-10) 1308-1318，该文章以引用方 式并入本文)中所述的MSC技术，分离和扩展自体同源软骨细胞。在其它实施例中，间 充质干细胞或软骨细胞为非自体同源细胞，可向供应商采购。一般而言，本文中修复合 成物包含的任何细胞混合物均称为以细胞为主的材料。
因此，本文所述修复合成物可包括一种或多种以下物质自体同源或非自体同 源以血小板为主的材料；自体同源或非自体同源软骨诱导液；以及自体同源或非自体同 源以细胞为主的材料。
本发明的其它方面还提供了几种方法，以协助有需要的患者进行组织修复。
方法包括将本发明的修复合成物(即血小板裂解液与软骨诱导剂)施用于需要该 疗法的患者的相关部位。在本文所述方法中，可将修复合成物备制为自体同源合成物或 非自体同源合成物。如修复合成物的任何一种成分采自非自体同源来源(赋形剂和溶液 除外，例如，无菌PBS和施用修复合成物所需的其它材料)，则整个合成物均视为非自体 同源。
在另一实施例中，可按顺序施用组成修复合成物的成分，例如，可先后施用血 小板裂解液(和/或富血小板血浆、富血小板纤维蛋白和/或全细胞血小板浓缩物)和软 骨诱导剂，中间可能间隔一分钟、十分钟、一小时、一天或一周。本文所述方法实施例 包括，将修复合成物的成分施用在需修复部位的任何实施程序，前提是，施用的目的是 修复患者需要修复的部位。
在本发明的又一实施例中，方法包括从需要治疗的患者体内采集备制血小板裂 解液溶液、富血小板血浆、富血小板纤维蛋白和/或全细胞血小板浓缩物。这些以血小 板为主的材料即为需要治疗的患者的自体同源材料。分离和备制这些材料的方法载于美 国专利申请号11/773,774和美国临时专利号61/014,987中，这些专利申请以引用的方式 并入本文，用于各种用途。
如上所述，本文中的部分实施例将治疗量的间充质干细胞与本发明的修复合成 物同时或先后施用于需要软骨修复的部位。
软骨修复合成物
具体而言，发明的合成物实施例包括软骨修复合成物，该合成物可提升有需要 的患者的软骨修复能力。根据本发明，软骨修复合成物实例包括各种合成物血小板裂 解液溶液、富血小板纤维蛋白、富血小板血浆和全细胞血小板浓缩物，以及一种或多种 软骨诱导剂。软骨诱导剂包括经证明可以诱导或促使软骨在体内或体外环境中生长的各 种生长因子、细胞因子、激素和营养物。
在某些实施例中，血小板裂解液溶液、富血小板纤维蛋白、富血小板血浆和/或全细胞血小板浓缩物均从接受修复合成物的患者自身取得。在其它实施例中，软骨诱 导剂也从接受修复合成物的患者自身取得。
以血小板为主的自体同源材料按美国专利申请11/773,774所述方法采集和备 制，该专利申请以引用方式并入本文，用于各种用途。自体同源软骨诱导剂可按照目标 制剂获得，例如，可向Stryker，bic和Medtronic采购BMP-7和BMP-2等生长因子，可 向Amgen/Wyeth，Inc等公司采购依那西普(TNF-alpha抑制剂)等细胞因子。
在典型实施例中，修复合成物包括干细胞或可促进软骨细胞生长的自体同源血 小板裂解液溶液的合成物。本发明的血小板裂解液溶液通常取自浓度为大约5%至40% 的血小板裂解液，最常见的是浓度为大约5%至20%的血小板裂解液。可根据生物利用 率和患者裂解液中生长因子的浓度确定任何既定患者的血小板裂解液的最佳浓度。可参 阅美国专利申请号11/773,774确定最佳浓度，该专利以引用的方式并入本文，用于各种 用途。
本文常见的软骨诱导剂包括诱导或促进软骨生长的生长因子。生长因子包 括纤维母细胞生长因子、类胰岛素生长因子、转化生长因子-beta、骨形态发生蛋 白-2、人类生长激素、PDGF-BB和类似物。(见如Cassiede et al.，J Bone Miner Res., 1996.11(9) p.1264-73 ； Miyata etal.，J Cell Physiol., 2005.204(3) p.948-55 ； Kawamura et al.，Exp Hematol., 2005.33 (8) p.865-72 ； Zhang et al.，J Huazhong Univ Sci Technolog MedSci., 2004.24(3) p.275-8 ； Toh etal.，Growth Factors, 2005.23(4) p.313-21 ； Chrisman, O.D., Clin Orthop Relat Res.，1975(107) p.232-8 ； Denko etal.， Semin Arthritis Rheum, 2005.35(1) p.24-34,上述每篇文章均以引用的方式并入本文， 用于各种用途)。软骨诱导剂的数量示例包括1-100毫微克/毫升(1-500纳摩尔)剂 量的皮质类固醇、1-500毫微克/毫升的TGF-beta、1-500纳摩尔的抗坏血酸(1-500毫 克/毫升)、1-100毫微克/毫升的FGF-2、10-500毫微克/毫升的IGF-I。
本文中其它常见的软骨诱导剂可包括诱导或促进软骨生长的细胞因子。细胞因 子的示例包括白细胞介素-1 (IL-I)和细胞因子样1 (Cytll)。本文中常见的软骨诱导剂 还可包括类固醇激素皮质类固醇、人类生长激素、睾丸激素。
另外，本文中常见的软骨诱导剂还可包括各种软骨诱导营养物，例如葡萄 糖胺、透明质酸(Zhu etal.，Stem Cell 2005,以引用方式并入本文，用于各种用途)、 胶原质、糖胺聚糖、氨基酸的混合物、丙酮酸钠、抗坏血酸、碳水化合物和类似物 (Cassiede et al. ； Miyata et al. ； Kawamura et al. ； Zhang et al. ； Toh et al. ； Bosnakovski et al., BiotechnolBioeng., 2006.93 (6) p.1152-63 ； Derfoul et al.， Osteoarthritis Cartilage, 2007.15(6) p.646-55 ； Song etal.，Cytotherapy，2004.6(6) p.596-601,上述每篇文章 均以引用的方式并入本文，用于各种用途)。部分实施例将一种或多种软骨诱导剂的混合 物与发明中以血小板为主的溶液结合，例如生长因子与细胞因子结合，生长因子与营 养物结合，或其它类似组合。
在一实施例中，将浓度大约5%至40%的血小板裂解液溶液与一种或多种软骨 诱导剂结合。软骨诱导剂混合物的示例包括IGF-I和皮质类固醇，可含有也可不含有胶 原质。血小板裂解液配50毫微克/毫升的地塞米松，血小板裂解液配抗坏血酸、地塞米 松、丙酮酸盐和类似物。
在其它修复合成物实施例中，间充质干细胞与本发明中以血小板为主的溶液和 软骨诱导剂结合。间充质干细胞通常为自体同源细胞，可通过上述方法从有需要的患者 身上采集和扩展。在另一实施列中，软骨细胞与本发明中以血小板为主的溶液和软骨诱 导剂结合。软骨细胞通常为自体同源细胞，可从有需要的患者身上采集和扩展。部分实 施例将间充质干细胞和不同形式的间充质干细胞的混合物(直至并包括软骨细胞)与以血 小板为主的溶液和软骨诱导剂结合。无论细胞性质如何，均可在植入有需要的患者体内 前按本发明的方向进行扩展。
另一修复合成物中加入了载体材料，用于调整实施例保持在患处的能力或在患 处释放合成物的时间。载体的示例包括凝胶、水凝胶、泡沫或类似物质。这些载体可 与以血小板为主的材料和软骨诱导剂结合，其中可含有也可不含有本发明的间充质干细 胞、软骨细胞等细胞添加剂。在某些方面，会在患处或附近施用载体，作为细胞添加剂 或内源性细胞(一般为间充质干细胞或软骨细胞)的支架。
如前所述，可一次性在需要修复的部位施用修复合成物，或间隔适当时间，先 后施用合成物的每种成分，以最大化修复效果。
诱导或促进有需要之患者的软骨修复方法
技术领域：
本发明的实施例包括在有需要的患者需要修复的部位进行软骨修复的治疗方 法。就本发明而言，需要修复的部位指人类、马、狗等哺乳动物需要软骨修复或置换的 任何部位，例如，患有骨关节炎的患者的膝关节。
在一实施例中，初步测定了可有效治疗需要修复部位的修复合成物类型和用 量。该测定以修复部位、患者年龄、自体同源或非自体同源以血小板为主的裂解液、软 骨诱导剂的类型和用量等为基础。另对修复合成物不同方面的运送时间进行了测定。例 如，可按在施用后最佳时间进行血小板去颗粒的能力来选择软骨诱导剂。必须测定在此 情况下的正确时间，特别是，如果在时间零点施用以血小板为主的合成物，在时间X点 施用细胞因子等软骨诱导剂，X即代表施用的血小板材料去颗粒的最佳时间。PCT申请 PCT/US2008/087452(促进干细胞移植和植入的合成物与方法)中介绍了该初步测定的各 个方面，该申请以引用的方式并入本文，用于各种用途。
做出上述测定后，则需用本文所载方法，在有需要的患者身上施用本发明的修 复合成物。可借助关节内窥镜或经皮，通过手术切口向需要修复的部位施药。
可一次性或分多次施药，以最大化软骨修复或置换的疗效。可进行患处分析， 确保已实现可接受的结果。
治疗应用
本发明的修复合成物能为有需要的患者的修复部位提供最佳修复条件和/或置 换条件/环境。
本文所述修复合成物可作为药物合成物，及用于对有需要的患者进行治疗，通 常用于治疗哺乳动物(包括人类患者)。修复合成物可制备成各种形式，以适应选定的给 药途径。
如果将本发明合成物作为注射液(无论通过手术切口还是关节镜)施药，则可按 照本领域技术人员熟知的方法，使用适当的分散剂或湿润剂(例如，灭菌油(包括合成单 甘油酯或甘油二酯)和脂肪酸(包括油酸)制备修复合成物。
修复合成物溶液或混悬液可用水、等渗盐水(PBS)制备，最好与无毒表面活性 剂混合。分散剂也可以用甘油、液态聚乙烯、乙二醇、植物油、乙酸甘油酯和上述物质 的混合物制备。根据习惯用途和储存条件，本文所载修复合成物可能含一种或多种防腐 剂，用以防止微生物的滋生。
本文所载“治疗应用”指，合成物的使用、以及本发明中对具有需进行软骨修 复和置换的部位的患者进行治疗的方法。在某些实施例中，本文所载发明包括对罹患疾 病、限制修复部位的固有细胞修复或再生能力的患者进行治疗的治疗应用。例如，患有 骨关节炎的患者。
本发明的描述内容旨在用于说明和介绍，并无意详细说明或将发明限制于所披 露的形式。本发明的范围仅限于以下权利要求的范围。该领域的技术人员可清楚理解本 发明的许多修改和差异。图中所述和所示的实施例经过选择，旨在最好的解释发明和实 际应用的原理，使该领域的其它技术人员了解本发明，用于各种经修改的实施例中，以 适用于预期的特定用途。
虽然，本发明在介绍过程中引用了多个实施例，但本领域的技术人员应该了 解，只要不脱离发明的精神实质和范围，可对本文所披露各个实施例的形式和细节做出 调整，而且，本文所披露各个实施例均无意限制权力要求的范围。本文所引用的参考文 献均通过全文引用方式并入本文。
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权利要求
1.促进有需要的患者的软骨修复的合成物，包括具有治疗学上的有效数量的自体同 源血小板裂解液，以及一种或多种软骨诱导剂。
2.在权利要求1所述合成物中，提述的血小板裂解液乃从大约5%至40%的血小板裂 解液溶液中提取。
3.在权力要求1所述合成物中，提述的软骨诱导剂为一种或多种生长因子、一种或多 种细胞因子、一种或多种激素、一种或多种重要营养物。
4.在权力要求3所述合成物中，当所提述的软骨诱导剂为激素时，即为皮质类固醇。
5.在权力要求3所述合成物中，当所提述的软骨诱导剂为生长因子时，即为转化生长 因子β、纤维母细胞生长因子或骨形态发生蛋白。
6.在权力要求3所述合成物中，当所提述的软骨诱导剂为细胞因子时，即IL-1。
7.在权力要求3所述合成物中，当所提述的软骨诱导剂为重要营养物时，即为抗坏血 酸、胶原质、氨基酸、肽、丙酮酸钠、葡萄糖、谷氨酰胺、核糖核苷、碳水化合物、精 油或脱氧核苷。
8.在权力要求1所述合成物中，还包含富血小板血浆、富血小板纤维蛋白、全细胞血 小板浓缩物或其混合物。
9.在权力要求1所述合成物中，还包含凝胶、水凝胶、泡沫或其它载体材料。
10.用于促进有需要的患者的软骨修复的方法包括从患者体内采集血小板；将获取的血小板制备成浓度为5%到40%的血小板裂解液溶液；获取一种或多种软骨诱导剂；和将浓度为5%至40%的血小板裂解液溶液和软骨诱导剂施用于需要软骨修复的患者 的有关部位；结合施用浓度为5%至40%的血小板裂解液溶液和软骨诱导剂促进需要修复的患者 有关部位的软骨修复。
11.在权力要求10所述方法中，提述的软骨诱导剂为一种或多种生长因子、一种或多 种细胞因子、一种或多种激素、一种或多种重要营养物。
12.在权力要求10所述方法中，还包括在需要修复的患者的有关部位施用富血小板血 浆、富血小板纤维蛋白、全细胞血小板浓缩物或其混合物。
全文摘要
本发明提出自体同源合成物和方法，用于对有需要的患者进行软骨修复。某些方面包括将以血小板为主的材料与软骨诱导剂结合，其中包含或不包含细胞疗法。
文档编号A01N63/00GK102026546SQ200980117080
公开日2011年4月20日 申请日期2009年3月13日 优先权日2008年3月14日
发明者C·J·森特诺 申请人:再生科学有限责任公司