专利名称：：一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法
技术领域：
：本发明涉及一项玉米组织培养再生技术，属于植物基因工程和转基因育种领域，是一种玉米自交系农系531的高效再生体系的建立方法。
背景技术：
：玉米是我国主要的粮食、饲料作物之一，也是重要的工业原料。随着畜牧业和加工工业的不断发展，对玉米的需求势必进一步增加。据统计本世纪初我国粮食产量需求达5Xl()8t，其中玉米则达到了1.25乂108仁预计到2030年，我国玉米的需求则要达到1.61.75Xl()8t。如果种植面积保持不变，则需要将现在4387kg/hi^的单产水平提高到5000kg/hn^左右，这就是面向21世纪我国玉米育种的艰巨任务。世界上玉米生产先进国家，如荷兰、希腊、新西兰、意大利、奥地利、法国、西班牙、加拿大、美国等，玉米单产都在7000kg/hm2以上，希腊和新西兰分别为9876kg/hm2和9355kg/hm、说明我国玉米单产水平还有很大的提升空间。但要实现这种提升，必须突破常规育种的方法，而采用最经济有效的转基因育种技术等先进方法。利用转基因技术，可以打破种间限制，直接将外源有益基因引入受体，实现育种"定向化"，并且可以使有益性状快速稳定下来，取得传统、常规育种技术难以达到的效果和效益。转基因新种质应用于育种实践的最快捷的方式是利用外源基因直接导入育种上常用的优良自交系。所以，对生产上常用的优良玉米自交系进行研究，建立其高效再生技术，对于促进玉米转基因育种的应用具有重要推动作用。高效再生体系的建立是实现基因转化的先决条件，关系到基因转化的成败，是转基因育种的基础和首要条件。玉米幼胚经诱导产生的愈伤组织有三种类型1型为致密的瘤状胚性愈伤组织，此类愈伤组织在许多玉米自交系和杂交种上很容易高频诱导；11型愈伤组织为白色或淡黄色、松脆的高度胚性愈伤组织，II型愈伤组织增殖快，但基因型依赖性强且诱导率低。ni型愈伤组织为松散的、柔软的、半透明的无组织结构的愈伤组织。II型胚性愈伤组织的低频诱导是制约玉米再生频率的主要因素。玉米高频再生体系的建立有两个关键环节一是稳定的II型胚性愈伤组织的高频诱导；二是高频的正常可育植株的再生。1975年，Green和Phillips首次成功地从玉米模式自交系A188诱导再生了植株。此后，许多文献对玉米模式自交系A18S、B73、墨西哥甜玉米及生产上常用的优良自交系进行了再生系统的研究，并获得了再生植株。但这些II型愈伤组织诱导成功率和植株再生成功频率普遍较低(最高值分别为64.28%和22.4%)，并且表现出强烈的基因型依赖性。模式自交系A188虽然诱导效率高，但其农艺价值很低，外源基因导入后还需经过长时间的杂交转育和选择才能形成转基因的新种质；已报道的玉米生产上常用的优良自交系再生能力则普遍偏低，不能满足玉米转基因育种的需要。而作为我国玉米的一个品系的自交系农系531的株型高、果穗大、花粉量大，农艺价值很高，如果将外源基因导入后可直接产生转基因新种质，可大大縮短育种时间，加速转基因育种进程。但目前还没有进行关于优良自交系农系531高效再生体系建立方面的研究。
发明内容本发明需要解决的技术问题是提供一种建立优良玉米自交系农系531的高效再生体系的方法，其增殖快，诱导率高，为对农系531玉米进行外源基因转化及转基因育种应用提供技术前提。为解决上述技术问题本发明所采取的技术方案是—种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，它是以玉米的农系531的幼胚为外植体，经合适的培养基配方进行诱导，高频的产生II型胚性愈伤组织，II型胚性愈伤组织在胚状体诱导培养基中经光下诱导产生绿色胚状体，转移至再生培养基中光下培养可再生成苗，经生根诱导即可再生完整植株，再生植株经Hogland营养液炼苗，长出新根后移栽至营养土中，光照培养箱中缓苗后移栽至大田生长并正常结实。本发明的方法包括以下步骤A、幼胚接种及II型胚性愈伤组织诱导以农系531玉米授粉后12天的幼胚为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基中进行诱导，使其产生II型胚性愈伤组织；所述外植体的最佳接种胚龄为自交系农系531玉米授粉后12天的幼胚，此时幼胚呈白色半透明状态，大小约2.0mm。B、胚状体诱导将步骤A中的II型胚性愈伤组织在胚状体诱导培养基中，在培养温度为2『C、光照强度为1500Lx、光/暗=8h/16h的培养箱中培养2周，对胚状体进行诱导，产生绿色胚状体；C、再生苗诱导将绿色胚状体转移至再生培养基中，在培养温度为2『C、光照强度为1500Lx、光/暗=14h/10h的条件下培养1520天，使绿色胚状体生成再生植株；这样培养的再生植株的再生苗绝大部分为单株，极少为从生苗。D、生根诱导将步骤C产生的再生植株中的单株剪去细弱的根并移至生根培养基中，在培养温度为28t:、光照强度为1500Lx、光/暗=14h/10h的培养条件下培养814天，使再生植株产生出粗壮的新根，形成完整的再生植株；E、Hogland营养液炼苗将上述步骤D中的完整的再生植株从培养基中取出放入Hogland营养液中，洗净培养基(注意保护根部)，在培养温度为2『C、光照条件为1500Lx、光/暗=14h/10h的条件下培养35天；对再生植株进行炼苗，使再生植株的根部长出新的粗壮的根；F、土中培养将经上述步骤E培养的长出新根的再生植株移栽至营养土中，在培养温度为28°C、光照强度为1500Lx、光/暗=8h/16h的条件下培养815天，对植株进行缓苗培养；G、将上述缓苗培养的植株从小培养钵中移栽至温室或大田中，使其正常生长并直至结实。本发明所述的步骤A中接种和愈伤组织诱导的具体操作方法是取农系531玉米授粉后12天的幼穗，剥去苞皮；在超净台中用酒精进行表面消毒后，用手术刀切去上部l/2籽粒的胚乳部分，用小镊子挑取大小为2.0mm的幼胚，使幼胚的盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基中；酒精的浓度一般为70%;在3(TC下进行暗培养，经3040天诱导产生淡黄色、致密的颗粒状II型胚性愈伤组织。这样就能高频的产生出II型胚性愈伤组织。上述的愈伤组织诱导培养基的原料配比为包括基本培养基N6、在基本培养基N6中添加的适当浓度的2，4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、酸水解酪蛋白、AgN(^、蔗糖、琼脂；愈伤组织诱导培养基的pH值为5.78-5.82。本发明的方法的进一步改进在于为了保持II型胚性愈伤组织的活性，可以对II型胚性愈伤组织进行继代培养，以便在任何需要的时候进行进一步培养。继代培养是在步骤A后，是将步骤A幼胚接种及II型胚性愈伤组织诱导产生后的II型胚性愈伤组织在30°C温度下在继代培养基上进行暗培养，每2030天更换一次继代培养基，以保持II型胚性愈伤组织的良好再生能力，在需要时再进行步骤B的胚状体诱导。II型胚性愈伤组织的保持能力是指经诱导产生的II型胚性愈伤组织经多次继代培养后仍能够良好再生的II型胚性愈伤组织的能力，用II型胚性愈伤组织的保持率表示(再生II型胚性愈伤组织的愈伤组织块数占接种II型胚性愈伤组织块数的百分比)。本发明上述的继代培养基包括基本培养基N6，并且N6中再添加2，4_二氯苯氧乙酸1.02.Omg/L、L-脯氨酸700mg/L、酸水解酪蛋白200mg/L、AgN03l0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L;继代培养基的pH值为5.785.82。本发明的胚状体诱导培养基的原料配比为胚状体诱导培养基包括基本培养基N6，在N6中添加L-脯氨酸700mg/L、酸水解酪蛋白200mg/L、蔗糖50g/L、琼脂7g/L;胚状体诱导培养基的PH值为5.785.82。本发明的再生培养基的原料配比为1/2MS为基本培养基，在1/2MS中添加蔗糖20g/L、琼脂7g/L，再生培养基的pH值为5.785.82。MS培养基主要成分包括大量元素、铁盐、微量元素、有机物。1/2MS是指MS基本培养基中的大量元素和铁盐用量减半。本发明的生根培养基的原料配比为1/2MS为基本培养基，在其中添加萘乙酸(NAA)O.5mg/L、蔗糖20g/L、琼脂7g/L，生根培养基的pH为5.78。本发明的营养土的原料配比为所述营养土包括鸡粪、蛭石、生土、草炭土，其比例为鸡粪/蛭石/生土/草炭土=1/2/2/4。由于采用上述技术方案本发明的方法所取得的技术进步在于本发明的优良玉米自交系农系531的高效再生体系的培养方法，增殖快，诱导率高，呈现出强基因型依赖性，为对农系531玉米进行外源基因转化及转基因育种应用提供技术前提。n型胚性愈伤组织的诱导被公认为是高频再生的关键环节之一。本发明以优良玉米自交系农系531适宜大小和时期的幼胚为外植体，通过适宜的培养基诱导，II型胚性愈伤组织诱导率较以往报道有显著提高，诱导率能够达到72.4%，为高频再生奠定了基础。本发明的植株再生类型主要以单株再生为主，单株比例能够达到90%以上，高频的单株再生为后续的移栽成活及结实提供了保证，是农系531高频再生的又一关键技术。本发明所建立的再生技术是针对玉米生产及育种中常用的优良自交系，结合转基因技术，可以直接创造具有有益基因的玉米新种质，避免了模式自交系转化后还要通过杂交等手段将有益基因导入优良自交系的繁琐过程，节省了育种时间，加速了转基因育种进程。图1为本发明方法的工艺路线流程图。具体实施例方式本发明建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法的工艺路线如下幼胚接种一II型胚性愈伤组织诱导一胚状体诱导一再生苗诱导一生根诱导生成完整植株一Hogland营养液炼苗一移栽至营养土培养一移栽至温室或大田生长结实。其流程见说明书附图1。实施例1.试验材料本实施例选用玉米生产和育种上常用的4个优良自交系——黄早4、农系531、沈137和邢抗36，并对它们进行比较试验。2.试验方法及步骤2.1幼胚接种及II型胚性愈伤组织诱导在玉米授粉后第12天，取下其整个雌穗，剥去苞皮，于超净工作台中进行如下操作用70%的酒精进行表面消毒2分钟后，用手术刀切去上部1/2籽粒的胚乳部分，用小镊子挑取幼胚，盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基中，在3(TC下进行暗培养，经35天即可诱导产生出淡黄色、致密的颗粒状II型胚性愈伤组织。上述的II型胚性愈伤组织诱导培养基最适宜的配比为基本培养基为N6，在基本培养基N6中添加2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)1.02.0mg/L、L-脯氨酸2880mg/L、CH(酸水解酪蛋白)100mg/L、AgNO蔗糖20g/L、琼脂7g/L;愈伤组织诱导培养基的PH值为5.8。其中N6的主要成分包括大量元素KN032830mg/L、(NH4)2S04463mg/L、KH2P04400mg/L、MgS047H2085mg/L、CaCl22H20166mg/L;铁盐FeS047H2027.85mg/L、Na2_EDTA37.25mg/L;微量元素MnS044H204.4mg/L、ZnS047H201.5mg/L、H3B031.6mg/L、KI0.8mg/L;有机物甘氨酸2.Omg/L，盐酸硫胺素1.Omg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。表1中的MS培养基主要成分包括大量元素KN031900mg/L、(NH4)2N031650mg/L、KH2P04170mg/L、MgS047H20370mg/L、CaCl22H20440mg/L;铁盐FeS047H2027.85mg/L、Na2_EDTA37.25mg/L;微量元素MnS044H2022.3mg/L、ZnS047H208.6mg/L、H3B036.2mg/L、KI0.83mg/L，CuS045H200.025mg/L，Na2Mo042H200.25mg/L，CoCl26H200.025mg/L;有机物甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。表1列出了本发明的方法所用的各种培养基的主要配方，并对多种愈伤组织诱导培养基进行了比较，各种培养基的各成分的比例列在表l中，但具体数值可以有所浮动。不同的愈伤组织诱导培养基对不同品种的诱导率结果如表2。表1玉米再生体系所用培养基(mg/1)编号基本培养基2，4-DNAAL-proCHAgN03蔗糖琼脂应用1N61.0—288010010200007000愈伤組织诱导2N62.0—288010010200007000愈伤组织诱导3N62.0—70020010200007000愈伤组织诱导4N62.0----——200007000愈伤组织诱导5N61.0-2.0--70020010300007000继代6N6--—700200—500007000胚状体资导71/2MS—————200007000再生81/2MS—0.5———200007000生根诱导2.2胚状体诱导选取状态良好的II型胚性愈伤组织接种在胚状体诱导培养基上，于2『C、光照培养箱中培养(1500Lx、光/暗=8h/16h)，经2周即可诱导产生绿色胚状体。2.3再生苗诱导再生苗诱导将上述产生的绿色胚状体接种在再生培养基上，于28t:、光照培养箱中培养(1500Lx、光/暗二14h/10h)，经2周时间即可再生成苗，这样培养的再生植株的再生苗绝大部分为单株，极少为从生苗。2.4生根培养经再生诱导所得植株也会产生大量细弱的根，但不利于成活。生根培养时，先剪去其细弱的根，再转接至生根培养基中，于28t:、光照培养箱中培养(1500Lx、光/暗二14h/10h)，经10天诱导产生粗壮的新根，从而形成完整的再生植株。2.5炼苗及移栽将生根后的完整再生植株从培养基中取出，洗净培养基(注意保护根部)，在Hogland营养液中炼苗，在培养温度为28t:、光照条件为1500Lx、光/暗=14h/10h的条件8下培养，3天后根部长出新的根原基，即再生植株的根部长出新的粗壮的根，再移栽至装有营养土(鸡粪蛭石生土草炭土=i:2:2:4)的小培养钵培养，培养温度为2『c、光照强度为1500Lx、光/暗=8h/16h的培养箱中培养10天，对植株进行缓苗；缓苗后移栽至温室或大田，使其正常生长并直至结实。3.结果与分析3.1高频II型胚性愈伤组织的诱导及适宜培养基选择幼胚经30d诱导产生了I型、II型、。III型的三种类型的愈伤组织。II型胚性愈伤组织的高频诱导首先要有适宜的培养基，选用N6培养基对于II型胚性愈伤组织的诱导率比MS培养基效果好。在所试的4种愈伤组织诱导培养基(表1中的编号为14的愈伤组织诱导培养基)中，在对农系531、沈137、邢抗36、黄早4四个品种的对比试验中，对农系531中表现出了极显著差异(见表2)，前3种含有L-脯氨酸、CH和AgN03的愈伤组织诱导培养基明显优于第4种培养基，从II型愈伤组织诱导率比较，以培养基1和2为农系531幼胚诱导产生II型胚性愈伤组织的最适宜培养基。表24种培养基中4种品种基因型的II型胚性愈伤组织诱导率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2中的II型愈伤组织诱导率％=诱导II型愈伤组织的胚数/接种胚数X100。从表2各自交系的II型胚性愈伤组织诱导率的差异显著性检验结果可以看出，农系531的II型胚性愈伤组织诱导率最高达72.4%，与其它3个自交系均表现出极显著差异，说明这一再生技术呈现出强基因型依赖性，对于农系531表现出高效的再生能力。3.2植株再生及类型在胚状体诱导培养基上经2周培养，几乎100%都能诱导产生绿色胚状体。将其转入再生培养基，2周后再生了大量植株。我们将再生植株类型划分为单株和从生苗2种类型，其中单株率见表3。表3农系531的植株再生率及再生类型基因型植抹再生率％植抹数单抹比例％从生苗比例％<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3中植株再生率％=植株再生数/接种II型愈伤组织块数X100。从表3可见，农系531的植株再生率高达83.9%，远远高于已报道关于自交系的结果，与一些杂交种的植株再生率相当。而且再生植株中单株占到了91.43%，再生的单株表型健壮，为后续的成活奠定了基础。3.3生根诱导及移栽结实生根诱导也是再生体系建立的一个关键环节。生根诱导分为2步生根培养基中诱导和Hogland营养液中培养以获得健壮的根。在再生培养基上产生的植株通常有细弱的根，即使在Hogland营养液中培养也很难获得健壮的根。将2种植株类型和2种根类型组合所得3种植株的移栽成活率进行比较，结果见表4。表4农系531自交系3种类型植株的移栽成活率植抹类型植抹数人工气候箱中成活率％温室中成活率°/0结实率％单株健壮根9610010021.18从生苗健壮根933.311.10单林细弱根5000表4中人工气候箱中成活率是指植株移栽至装有营养土的小花盆中在人工气候箱中培养io天的结果。移栽入温室后，全部单株均成活并且生长健壮，而从生苗则仅有11.1%存活，但不能结实，有细弱根的单株则根本不能成活。这表明单株再生及生根诱导是高成活率及再生体系建立的两个关键因素。只有具健壮根的单株才能保证高成活率。10权利要求一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于包括以下步骤A、幼胚接种及II型胚性愈伤组织诱导以农系531玉米授粉后12天的幼胚为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基中进行诱导，使其产生II型胚性愈伤组织；B、胚状体诱导将步骤A中的II型胚性愈伤组织在胚状体诱导培养基中，在培养温度为28℃、光照强度为1500Lx、光/暗＝8h/16h的培养箱中培养2周，对胚状体进行诱导，产生绿色胚状体；C、再生苗诱导将绿色胚状体转移至再生培养基中，在培养温度为28℃、光照强度为1500Lx、光/暗＝14h/10h的条件下培养15～20天，使绿色胚状体生成再生植株；D、生根诱导将步骤C产生的再生植株中的单株剪去细弱的根并移至生根培养基中，在培养温度为28℃、光照强度为1500Lx、光/暗＝14h/10h的培养条件下培养8～14天，使再生植株产生出粗壮的新根，形成完整的再生植株；E、Hogland营养液炼苗将上述步骤D中的完整的再生植株放入Hogland营养液中，在培养温度为28℃、光照条件为1500Lx、光/暗＝14h/10h的条件下培养3～5天；对再生植株进行炼苗，使再生植株的根部长出新的粗壮的根。F、土中培养将经上述步骤E培养的长出新根的再生植株移栽至营养土中，在培养温度为28℃、光照强度为1500Lx、光/暗＝8h/16h的培养条件下培养8～15天，对植株进行缓苗；G、将上述缓苗培养的植株移栽至温室或大田中，使其正常生长结实。2.根据权利要求1所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于所述步骤A中接种和愈伤组织诱导的具体操作方法是取农系531玉米授粉后12天的幼穗，剥去苞皮，在超净台中用酒精进行表面消毒后，切去上部1/2籽粒的胚乳部分，挑取大小为2.Omm的幼胚，使幼胚的盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基中，在3(TC下进行暗培养，经3040天诱导产生淡黄色、致密的颗粒状II型胚性愈伤组织。3.根据权利要求1或者2所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于所述愈伤组织诱导培养基包括基本培养基N6、在基本培养基N6中添加的适当浓度的2，4-二氯苯氧乙酸、L-脯氨酸、酸水解酪蛋白、AgN(^、蔗糖、琼脂；愈伤组织诱导培养基的pH值为5.785.82。4.根据权利要求1所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于在步骤A后还包括继代培养步骤Al，继代培养是将步骤A幼胚接种及II型胚性愈伤组织诱导产生后的II型胚性愈伤组织在3(TC温度下在继代培养基上进行暗培养，每2030天更换一次继代培养基，以保持II型胚性愈伤组织的良好再生能力，在需要时再进行步骤B的胚状体诱导。5.根据权利要求4所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于所述继代培养基包括基本培养基N6，并且每升N6中再添加2，4-二氯苯氧乙酸1.02.0mg、L-脯氨酸700mg、酸水解酪蛋白200mg、AgN0310mg、蔗糖30g、琼脂7g;继代培养基的pH值为5.785.82。6.根据权利要求1所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于所述胚状体诱导培养基包括基本培养基N6，在每升N6中添加L-脯氨酸700mg、酸水解酪蛋白200mg、蔗糖50g、琼脂7g;胚状体诱导培养基的pH值为5.785.82。7.根据权利要求1所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于所述再生培养基为1/2MS，在1/2MS中添加蔗糖20g/L、琼脂7g/L，再生培养基的pH值为5.785.82。8.根据权利要求1所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于所述生根培养基为1/2MS，在1/2MS中添加萘乙酸O.5mg/L、蔗糖20g/L、琼脂7g/L，生根培养基的pH为5.785.82。9.根据权利要求1所述的一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，其特征在于所述营养土包括鸡粪、蛭石、生土、草炭土，其比例为鸡粪/蛭石/生土/草炭土=1/2/2/4。全文摘要本发明公开了一种建立优良玉米自交系农系531高效再生体系的方法，属于植物基因工程和转基因育种领域。本发明以农系531的幼胚为外植体，在愈伤组织诱导培养基中进行诱导，产生II型胚性愈伤组织，将II型胚性愈伤组织在胚状体诱导培养基中进行光下胚状体诱导，产生绿色胚状体，再将绿色胚状体转移至再生培养基中，在光下培养成再生植株，然后在生根培养基中进行生根诱导、Hogland营养液中进行炼苗，使再生植株的根部长出新的粗壮的根，再移栽至营养土中缓苗培养，最后移栽至大田中，即可正常生长结实。该再生技术适用的是应用价值很高的优良自交系玉米农系531，在玉米转基因育种过程中可以使农系531玉米的优良品质得以遗传，对功能基因组研究也具有重要意义。文档编号A01G31/00GK101779598SQ20101003339公开日2010年7月21日申请日期2010年1月19日优先权日2010年1月19日发明者刁现民,智慧,李伟,李海权,王永芳申请人:河北省农林科学院谷子研究所