专利名称：叔丁基对苯二酚在作为激活鱼类去毒基因表达的饵料添加剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鱼类养殖技术领域，具体涉及养殖鱼类的去毒处理技术领域，尤其涉 及叔丁基对苯二酚在作为激活鱼类去毒基因表达的饵料添加剂中的应用。
背景技术：
海水鱼类赤潮毒素、违禁渔药等毒害物质的污染问题是当前我国海洋养殖水产品 质量安全的关键问题，如赤潮毒素中软骨藻酸在鱼类中可富集，导致的人和动物的中毒事 件层出不穷；违禁渔药中孔雀石绿能结合或插入DNA，促进肿瘤生长，具有明显的高致癌、 高致畸和致突变作用；淡水养殖中，铜绿微囊藻产生的毒素——微囊藻毒素会造成肝细胞 的损伤，严重者还会引起肝内出血，致使动物死亡等等。另外，由于相关农药的使用，使农药等毒物在淡水养殖鱼体内积聚。长期食用含有 这些药物的水产品可致畸、致癌，也会对人类健康造成严重威胁。对于受污染的水体进行去毒处理，主要通过专门装置去除水中毒素，但随着水体 富营养化进程加剧，处理成本迅速攀升而不堪重负，对于受污染水体养殖的水产品，根本不 可能以流体形式的方法在水产品加工过程去除毒素。所以，如何提高饲养鱼类自身排毒能 力，以纯天然方式保证水产品安全成为一条可行的途径。许多研究已经证明肝脏对毒素的解毒作用开始于在二相去毒酶谷胱甘肽-S-转 移酶(GSTs)的作用下毒素与谷胱甘肽(GSH)结合。GSTs是一个广泛分布的二聚酶基因家 族，sGST去毒酶催化毒物与谷胱甘肽(GSH)的加合反应，中和了毒物的亲电位点，使其水溶 性增加、毒性减弱，有利于其通过排泄系统排出体外，清除内源具遗传毒性的不饱和醛，具 有清除体内毒素，保护动物免受毒物损，提高其存活率以及对环境的适应能力的重要作用。叔丁基对苯二酚(tBHQ)是一种抗氧化剂，可通过激活抗氧化反应元件(ARE)诱 导二相去毒酶的表达，如它可通过激活抗氧化反应元件提高谷胱甘肽水平和GSTs活性，此外，tBHQ在适合给药剂量范围内可以被生物体正常排泄，没有毒性。因此，tBHQ现常被用作 食品抗氧化保险保营养的食品添加剂。目前尚未见有将叔丁基对苯二酚用于鱼类饲料添加剂的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种叔丁基对苯二酚在作为激活鱼 类去毒基因表达的饵料添加剂中的应用。本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的目前水产品，尤其是养殖鱼类体内毒素严重，而现有技术无法做到很好地去除毒 素的目的，从而使得人类健康受到严重威胁，本发明人考虑通过调节鱼体自身的排毒能力， 实现鱼类体内积累毒素的去除。首先本发明人研究了鱼体自身排毒的机理毒素进入鱼肝细胞后，使细胞中产生大量活性氧分子，这些活性氧分子将脂质分子氧化为过氧化脂质分子，以自由基链式反应 的方式对肝脏造成严重损伤。这时，在肝脏抗氧化胁迫与抑制过量ROS发生方面起重要作 用的GPX被诱导，过氧化脂质分子在谷胱甘肽过氧化物酶GPX的作用下，被GSH还原生成 GSSG和还原型脂质分子，而sGST则催化GSH与毒素结合，成为水溶性化合物排出体外，起到
解毒作用。接着本发明人分析了哺乳动物中外源物质促进GST基因表达的调控机理，并选择 一些可提高GSTs活性的调控物质进行鱼体排毒效果的研究，结果发现，叔丁基对苯二酚 (tBHQ)不但能够很好地促进鱼体去毒基因的转录水平，增 强鱼类去毒能力，而且被鱼体正 常排出的时候，也不存在毒性。因此，本发明人选择叔丁基对苯二酚作为饵料添加剂用于鱼类养殖中。经过具体的实验摸索，本发明人发现，将叔丁基对苯二酚用于鱼类饵料添加剂中 时，tBHQ的含量选择每公斤干饲料中含有tBHQ 0. 05 0. 15克最适宜，不但能够实现鱼体 排毒的目的，而且经济合算。将叔丁基对苯二酚用于鱼类饵料添加剂中时，tBHQ的含量优选每公斤干饲料中含 有 tBHQ 0. lg/kg。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明提供了一种tBHQ在鱼饲料添加剂中的应用，添加有tBHQ的鱼饲料能够 促进鱼类去毒基因的表达，从而增强鱼类抵抗外界毒物的能力；2.根据本发明提供的一种tBHQ在鱼饲料添加剂中的应用，在淡水养殖经济鱼类 在微囊藻等蓝藻水华高发期、海水养殖经济鱼类接触赤潮发生或者接触违禁渔药时，给养 殖的鱼类喂投含添加了高效安全tBHQ添加剂的鱼饲料，有利于鱼类自身代谢排除微囊藻 毒素以及药物毒素，从而保证鱼类食用的安全性；3.利用本发明所提供的一种tBHQ在鱼饲料添加剂中的应用，所制备的鱼饲料，在 水产养殖过程中喂投含给鱼类，可以促进鱼类去毒基因表达特别是I、II时相代谢去毒相 关基因的表达，通过鱼自身的代谢体系就能够将自身摄入及积累的毒素分解排泄出去，不 需对养成的水产品进行任何专门处理，也不需任何专门的加工装置，极大地降低了食用鱼 的后期处理成本，更加环保经济；4.叔丁基对苯二酚目前主要用于食品添加剂中，起到抗氧化剂的作用，而本发明 将叔丁基对苯二酚添加到鱼类饲料中，叔丁基对苯二酚作为鱼类体内GST基因的表达诱导 齐U，诱导鱼类GST基因表达，从而使得鱼类自身增强去毒能力，达到提高水产品安全性的目 的。
图1为尼罗罗非鱼肝脏细胞经20 μ Μ、40 μ MtBHQ处理24小时后，GSTA、GSTRl、 GSTR2、GSTT 和 GSTM/beta-actin mRNA 的比例柱状图；其中，1为 GSTA/beta-actin mRNA,2 为 GSTRl/beta-actin mRNA,3 为 GSTR2/ beta-actin mRNA，4 为 GSTT/beta-actin mRNA,5 为 GSTM/beta-actinmRNA ；图2为tBHQ灌胃处理尼罗罗非鱼7、24和72小时后肝脏GSTs/beta-actinmRNA 比例柱状其中，1为 GSTA/beta-actin mRNA,2 为 GSTRl/beta-actin mRNA,3 为 GSTR2/ beta-actin mRNA,4 为 GSTT/beta-actin mRNA,5 为 GSTM/beta-actin mRNA ；图3为tBHQ灌胃处理24小时和72小时后尼罗罗非鱼肝脏MC-LR集聚量柱状图 (μ g/g)；其中，1为灌胃含MC-LR饲料，2为灌胃含MC-LR饲料+含tBHQ饲料；图4为真鲷肝细胞经40 μ Μ、60 μ M tBHQ处理后AHR、ARNT, CYPlA、GSTAl、GSTA2、GSTR 和 HSP70/beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1为 AHR/beta-actin mRNA, 2 为 ARNT/beta-actin mRNA, 3为 CYP IA/ beta-actin mRNA,4 为 GSTA 1/beta-actin mRNA,5 为 GSTA2/beta_actin mRNA,6 为 GSTR/ beta-actin mRNA,7 为 HSP70/beta-actin mRNA ；图5为真鲷tBHQ灌胃处理24小时和72小时后肝脏AHR、ARNT, CYP1A、GSTAl、 GSTA2、GSTR 和 HSP70/beta-actin mRNA 比例柱状图；其中，1为 AHR/beta-actin mRNA,2 为 ARNT/beta-actin mRNA,3 为 CYP IA/ beta-actin mRNA, 4 GS TA 1/beta-actin mRNA, 5 % GSTA2/beta-actin mRNA>6 GSTR/ beta-actin mRNA,7 为 HSP70/beta-actin mRNA ；图6为真鲷灌胃tBHQ 24小时、72小时后肝脏中DA集聚量柱状图(ng/ml)；其中，1为灌胃含DA饲料，2为灌胃含DA饲料+含tBHQ饲料；
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。实施例1含tBHQ的鱼饲料取购买自SIGMA的tBHQ，按每公斤干饲料含约0. 1克tBHQ的量，将tBHQ加入购买 自广州市澳洋实业有限公司鱼饲料中制备得到含tBHQ的鱼饲料。实施例2tBHQ对鱼类肝脏去毒相关基因转录水平的诱导检测本实施例中，采用离体细胞培养诱导方法培养尼罗罗非鱼及真鲷肝脏离体细胞， 用实时荧光定量PCR方法检测肝细胞诱导培养后去毒酶基因的mRNA相对水平，以β -肌动 蛋白为外参照(我们已克隆罗非鱼、真鲷β-肌动蛋白cDNA序列)，相对比较tBHQ诱导后 肝脏离体细胞去毒酶基因的诱导表达。再用含毒素及含tBHQ饲料灌胃尼罗罗非鱼及真鲷 后，用实时荧光定量PCR方法检测尼罗罗非鱼及真鲷肝脏去毒酶基因的mRNA相对水平，以 β-肌动蛋白为外参照，相对比较用tBHQ灌胃后去毒酶基因的诱导表达，用ELISA方法对比 检测tBHQ处理后肝脏毒素集聚浓度。1、肝脏离体细胞培养尼罗罗非鱼(体重大约500g)，真鲷(体重大约25g)放血处理并取其肝脏。将肝 脏剪碎尽可能并去除血细胞，用0. 25%的胰蛋白酶在28°C下消化40min使肝细胞分散，随 后用Hanks液处理三次洗去胰蛋白酶和血细胞。分离的肝细胞移入Dulbecco's Modified Eagle培养基，培养基中包含青霉素(100IU/ml)，链霉素(100 μ g/ml)和5%胎牛血清。将尼罗罗非鱼离体肝细胞分成如下三组分别处理(1) 20 μ M tBHQ组，该组在培养基中添加20 μ M tBHQ ；
(2) 40 μ M tBHQ组，该组在培养基中添加40 μ M tBHQ ；(3)PBS组，该组是对照组，在培养基中添加空白媒介一PBS。将真鲷离体肝细胞分成如下三组分别处理(1) 40 μ M tBHQ组，该组在培养基中添加40 μ M tBHQ ；(2) 60 μ M tBHQ组，该组在培养基中添加60 μ M tBHQ ；(3)PBS组，该组是对照组，在培养基中添加空白媒介一PBS。将上述各组离体肝细胞均置于28°C，5% CO2环境下培养24小时。2.活体鱼灌胃尼罗罗非鱼(每条体重89. 34士4. 12g)，真鲷(每条体重16. 92士4. 28)在暴露 实验之前在实验室水箱喂养3周以适应环境。鱼类养殖用水为曝气除氯的自来水，水温为 27 士 2°C，饲养期间连续充氧。在这期间，喂食普通饲料一天二次(9 00和15 00)，喂养量每 天增加体重的4%。每种实验鱼分成两组，分开喂养。尼罗罗非鱼用16#灌胃针向空腹尼罗罗非鱼灌胃Iml混合了每kg体重 250 μ gMC-LR的普通鱼饲料。24小时后，处理组每天灌胃每千克混合IOOmg tBHQ的鱼饲料， 对照组只灌胃普通饲料。在灌胃tBHQ后7，24，72小时时，每组分别挑选6条鱼，取其肝脏 样品并保存。真鲷用16#灌胃针向空腹真鲷灌胃Iml混合了每kg体重IOmgDA的普通鱼饲料。 24小时后，处理组每天灌胃每千克混合IOOmg tBHQ的鱼饲料，对照组只灌胃普通饲料。在 灌胃tBHQ后24和72小时时，每组分别挑选6条鱼，取其肝脏样品并保存。3.离体肝细胞及肝脏总RNA提取离体肝细胞培养24小时后，离心500Xg，5min收集。灌胃实验的肝脏称取30mg。 总RNA的提取与纯化用Promega公司的SV Total RNA IsolationSystem试剂盒。cDNA第 一链的合成使用 Takara RNA LA PCRTM Kit(AMV) Ver. 1. 1 试剂盒，以 oligo(dT)20 作为反 转录引物。总RNA提取与cDNA合成均按试剂盒推荐的方法进行操作。4.离体肝细胞和肝脏组织去毒相关基因表达检测基于已克隆的cDNA核心序列用Software 2. 0设计尼罗罗非鱼的GSTA、GSTR1、 GSTR2、GSTT 和 GSTM 基因的 RT-PCR 特异引物。设计真鲷的 AHR、ARNT、CYP1A、GSTA1、GSTA2、 GSTR和HSP70基因的RT-PCR特异引物。cDNA第一链的合成使用ToYoBo ReverTra Ace- α -TM试剂盒，分别以尼罗罗非鱼，真鲷总RNA为模板，oligo (dT) 20为反转录引物，操作按试剂盒推荐方法进行。RT-PCR使用 DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit (Finnzymes，Finland)试剂盒和 Chromo4Real-Time 检测系统(MJ Research，USA)，实验设计遵照说明书进行。PCR 体系包含 Master Mix (2 X concentration) 10 μ 1,0. 5 μ M forward primer, 0· 5 μ M reverse primer, ROX 0· 3 μ 1，由 1 μ g 总 RNA 反转录得到的 cDNA 适量，补足 ddH20 到总体系为20μ1。每次PCR之后对扩增产物的溶解曲线进行分析。每个样品的定量PCR 重复3次。反应分步骤为95°C 3min ;95°C 20s，55°C 20s，72°C 35s，40次循环。采用the Opticon Monitor software 2. 03Version (MJresearch, USA) Wii^ delta delta Ct Jj^ 计算相关基因的表达量。
鱼的相关离体细胞及肝脏GSTs cDNA水平以GSTs/beta-actin mRNA的比例表示。5.用ELISA检测毒素在肝脏中的积聚浓度尼罗罗非鱼用16#灌胃针向空腹尼罗罗非鱼灌胃Iml混合了每kg体重 250 μ gMC-LR的普通鱼饲料。24小时后，处理组每天灌胃每千克混合IOOmg tBHQ的鱼饲料， 对照组只灌胃普通饲料。在灌胃tBHQ后24，72小时时，分别检测毒素在肝脏中的积聚浓 度，取新鲜的尼罗罗非鱼lg，进行超声破碎并用100%的甲醇萃取，最后MC-LR浓缩在0. 5ml 100% 甲醇水=1 1 (ν/ν)的溶液中。用 ELISA Microcystin Plate Kit (Beacon,USA) 测定MC-LR在肝脏组织样品中的集聚量。用以检测MC-LR在尼罗罗非鱼肝脏中的代谢情况。真鲷用16#灌胃针向空腹真鲷灌胃Iml混合了每kg体重IOmgDA的普通鱼饲料。 24小时后，处理组每天灌胃每千克混合IOOmg tBHQ的鱼饲料，对照组只灌胃普通饲料。灌 胃tBHQ后24，72小时时，取新鲜的真鲷肝脏称重，进行超声破碎并用适当体积的100%的 甲醇萃取，最后DA浓缩在100%甲醇水=1 1 (ν/ν)的溶液中。用EIA Domoic 2hours Kit (Groupe,Belgium)测定DA在真鲷肝脏组织样品中的集聚量。用以检测DA在真鲷肝脏 中的代谢情况。
6.统计分析采用统计分析软件SPSS 10. 0对肝脏及离体肝细胞GSTs基因tBHQ诱导前后mRNA 相对表达水平平均值差异进行统计分析。若P <0.05，平均值的差异即认为是显著的。7.尼罗罗非鱼结果分析7. 1尼罗罗非鱼肝脏离体细胞培养结果分析20 μ M tBHQ组、40 μ M tBHQ组和作为对照的PBS组均置于28°C ,5% CO2环境下培 养24小时后，结果如图1所示。从图1中可以看出，尼罗罗非鱼肝细胞经20、40 μ M tBHQ处理后，GSTRl表达水平 显著升高，且高浓度tBHQ诱导水平高于低浓度，显示一定浓度的tBHQ诱导GSTRl的表达。 而40 μ M tBHQ处理后的肝细胞GSTM表达略有降低。7. 2尼罗罗非鱼的活体鱼灌胃结果分析尼罗罗非鱼活体灌胃结果如图2所示，从图中可以看出，给尼罗罗非鱼灌胃每千 克混有IOOmgtBHQ的鱼饲料，tBHQ在7小时时可激活尼罗罗非鱼肝脏的在微囊藻毒素代谢 过程中起不同重要的作用的各型sGST的诱导表达，饲料中添加tBHQ可有效地增强了肝脏 MC-LR的代谢。图2中，MC-LR是指对照组，MC-LR+tBHQ是指处理组。7. 3. ELISA检测毒素在肝脏中的积聚浓度结果分析通过ELISA方法测定尼罗罗非鱼通过灌胃MC-LR及tBHQ后脏MC-LR的代谢情况。 灌胃MC-LR 24小时后灌胃tBHQ，检测灌胃tBHQ 24小时和72小时肝脏组织中残留微囊藻 毒素的量，结果如图3所示。从图中可以看出，tBHQ激活了尼罗罗非鱼肝脏的在微囊藻毒素代谢过程中起不同 重要的作用的各型sGST的诱导表达，在24小时时表达产物已起明显效果，肝脏中MC-LR含 量快速降低，可见饲料中添加tBHQ可有效地增强了肝脏MC-LR的代谢。8.真鲷结果分析8. 1真鲷肝脏离体细胞培养结果分析
如图4所示，40 μ M tBHQ处理真鲷原代肝细胞24小时，AHR、ARNT、GSTAl、GSTA2禾口 GSTR的mRNA表达水平均比对照组呈上升趋势，但并未有显著性诱导(P > 0. 05)；而CYPlA 和HSP70基因mRNA表达水平与对照组相比则出现降低(P > 0. 05)。当60 μ M tBHQ暴露 24小时后，CYPlA基因mRNA表达水平显著性降低(P < 0. 05)，AHR mRNA基因表达水平出 现轻微的降低(P > 0. 05)，ARNT, GSTAl、GSTA2和GSTR基因mRNA表达水平与对照组相比 诱导趋势不变，但较40 μ M tBHQ处理组有所降低，仅GSTR基因mRNA表达水平随tBHQ的浓 度增加而增加；而HSP70mRNA表达水平与对照组相比由低浓度的抑制转为高浓度诱导(P > 0. 05)。显示tBHQ有可能对真鲷原代肝细胞中II相去毒酶(GSTA1、GSTA2和GSTR)有诱导作用；并证实高浓度tBHQ对HSP70也有一定诱导作用。8. 2真鲷的活体鱼灌胃及ELISA检测毒素在肝脏中的积聚浓度结果分析图5给出真鲷的活体鱼灌胃结果，图中DA是指对照组(只灌胃DA的)，DA+tBHQ 是指处理组。从图中可以看出，在灌胃tBHQ 24小时和72小时后，tBHQ对真鲷肝脏AHR、 ARNT、CYP1A、GSTAl、GSTA2、GSTR和HSP70有不同的诱导改变，II相去毒酶的诱导较I相去 毒酶更明显。在用ELISA检测毒素在真鲷肝脏中的积聚浓度实验中，饲料中添加tBHQ可有效地 增强了肝脏软骨藻酸的代谢的结果也被观察到(图6)。以上实验均表明，tBHQ在增强毒素代谢中的显著作用。结果证明，在含tBHQ 0. lg/kg (最佳浓度)的干饲料添加浓度范围内，毒素诱导后 去毒相关基因GSTs的诱导表达作用明显增强，去毒能力增强，对机体的保护作用也增强。
权利要求
叔丁基对苯二酚在作为激活鱼类去毒基因表达的饵料添加剂中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述叔丁基对苯二酚在作为饵料添加剂添加 到鱼类饲料中时，添加量为每公斤干饲料中含有0. 05 0. 15克叔丁基对苯二酚。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述添加量为每公斤干饲料中含有0.1克叔丁基对苯二酚。
全文摘要
本发明公开一种叔丁基对苯二酚在作为激活鱼类去毒基因表达的饵料添加剂中的应用。本发明将叔丁基对苯二酚添加到鱼类饲料中，叔丁基对苯二酚作为鱼类体内GST基因的表达诱导剂，诱导鱼类GST基因表达，从而使得鱼类自身增强去毒能力，达到提高水产品安全性的目的。叔丁基对苯二酚在作为饵料添加剂添加到鱼类饲料中时，添加量为每公斤干饲料中含有0.05～0.15克叔丁基对苯二酚。
文档编号A23K1/18GK101816374SQ201010110009
公开日2010年9月1日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者何珊, 姚煜, 李观贵, 梁旭方, 王琳, 程伟轩, 胡永乐, 郁颖, 陈亮, 陈小佳 申请人:暨南大学