专利名称：特丁基对苯二酚在制备治疗地中海贫血的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及特丁基对苯二酚(tBHQ)在制备治疗地中海贫血的药物中的用途，特别是涉及特丁基对苯二酚通过激活Nrf2而上调α-珠蛋白稳定蛋白(AHSP)的表达从而缓解并治疗地中海贫血的症状。
背景技术：
1.地中海贫血及其治疗地中海贫血是人类最为常见的单基因遗传性疾病之一。当珠蛋白基因发生突变时，一种或多种珠蛋白肽链的合成受阻，最终导致α-珠蛋白肽链和珠蛋白肽链的合成不平衡。游离的珠蛋白肽链是强氧化剂，可以催化产生活性氧自由基ROS。ROS的产生可以破坏红系前体细胞和成熟的红细胞，严重时可导致凋亡。凋亡的红系前体细胞累积即可导致无效的红系生成，其症状即为贫血。另外，游离的珠蛋白不稳定而易发生沉淀或降解。珠蛋白在红细胞膜上的沉淀会破坏细胞膜导致溶血性贫血。降解的珠蛋白释放有毒的血红素、吓啉和铁离子等，这些游离的离子也会催化产生ROS。ROS的产生是关于地中海贫血的分子病理学的重要内容。目前关于地中海贫血的治疗主要分为三类，输血、利用铁螯合剂去除血液中过量的铁离子和利用激素进行内分泌调节等方法是对症治疗，可以在一段时间内减轻地中海贫血的临床症状，但需终生用药；而通过异体骨髓移植、药物开启胎儿型珠蛋白基因的表达和利用抗氧化剂等方法则是从病因出发，可以在一定程度上改善地中海贫血症状，但仍面临排异反应，药物毒性等因素的困扰；另外有关地中海贫血基因治疗的方法也在艰难探索中。2. AHSP蛋白及其调节α -珠蛋白稳定蛋白AHSP是新近发现的α -珠蛋白特异的分子伴侣。AHSP的结构决定其功能，通过结合并稳定各种形式的α-珠蛋白，AHSP可以减少ROS的产生，在正常的红系发生和地中海贫血发生发展过程中发挥重要作用。以AHSP为靶标，寻找可以预防地中海贫血发生，缓解或者改善地中海贫血症状的药物是很有前景的地中海贫血治疗方案。因此关于AHSP表达调节的研究显得尤为重要。AHSP是作为GATA-I的靶基因被发现的，GATA-1对AHSP的调节作用也是最早被详细阐明的。Gallagher等人通过5’ RACE的方法首先鉴定了 AHSP启动子区的5’端，进一步结合多种实验手段证明了 GATA-I和广谱的转录因子Oct-I在AHSP调控区的结合位点，以人AHSP启动子导向的报告基因在转基因鼠体内特异地在骨髓、脾和网织红细胞等红系组织中表达。Pilon等人进一步在细胞和动物水平证明了 EKLF对AHSP的转录激活作用，同时，EKLF作为染色质调节子还可以改变AHSP的染色质水平。另有文献报道表明组蛋白去乙酰化酶抑制剂和细胞内的铁的水平都可以调节AHSP的表达。细胞内游离的铁可以通过与铁调节蛋白相互作用而去稳定AHSP的mRNA的稳定性，从而负调节AHSP在铁过多状态下的表达，加剧α-珠蛋白的不稳定性，进而加剧地中海贫血的症状。本实验室成员通过研究在AHSP启动子区预测到小Maf家族成员的识别位点，因此推测CNC-bZIP家族成员可能调节AHSP的表达。CNC-bZIP蛋白家族的成员众多，包括 NF-E2, Nrfl，Nrf2 (NF-E2 relatedfactor 2)，Nrf3, Bachl 和 Bach2 等，均可以与小 Maf 家族蛋白形成二聚体。其中，NF-E2与GATA-1、EKLF等同为调节红系正常生成的重要转录因子，对红系分化晚期的珠蛋白基因的表达调节至关重要。而Nrf2主要在细胞氧化应激状态及抵抗炎症等方面发挥重要的调节作用，可以调节大量参与细胞保护的基因。β -珠蛋白基因簇LCR区高敏位点HS2含有串联的NF-E2结合位点，以此串联序列为探针在Κ562 cDNA文库中筛选得到Nrf2。Nrf2可结合的保守序列被称为抗氧化剂效应元件(antioxidant responsiveelement,ARE)或者亲电子试齐Ll效应元件(electrophile responsiveelement, EpRE)。作为细胞内重要的抗氧化分子，Nrf2可通过促进抗氧化蛋白和二类去毒素酶类的表达，来对抗细胞在氧化应激或亲电子试剂刺激下产生的不良反应。Nrf2包含有六个Neh (Nrf2-ECH homology)功能域。其中Nehl为碱性亮氨酸拉链区，可与Maf家族形成二聚体，继而与DNA相结合。Neh4和Neh5为转录激活域，可与CBP相结合激活下游基因转录。Neh2为Keapl结合区域，Keapl的结合可引起Nrf2的降解。ROS 作为信号分子激活蛋白激酶C(I3KC)，则可引起Nrf2 Neh2功能域的kr 104被PKC磷酸化而使Nrf2与Keapl解离。解离后的Nrf2在核内累积发挥效应。3.抗氧化剂与作为潜在的治疗地中海贫血的药物特丁基对苯二酚tBHQ (Tertiary Butyl Hydroquinone)是一种亲离子试剂，可以起抗氧化的作用。tBHQ作为抗氧化剂的应用非常广泛，主要集中在食品加工、美容产品、橡胶工业以及油脂加工等。tBHQ在基础科学研究中的也有广泛的应用，主要作为Nrf2的特异性激活剂发挥作用。DEM是另一种Nrf2的激活剂，化学名为马来酸二乙酯。DEM在细胞水平也可以显著升高AHSP的表达水平。tBHQ作为潜在的治疗地中海贫血的药物，主要存在以下优势首先，特异性强。作为Nrf2的激活剂，DEM没有tBHQ应用广泛，分析可能为DEM没有tBHQ的特异性强。DEM对Nrf2的激活作用可以被抗氧化剂或者抗氧化酶所封闭，但是tBHQ对Nrf2 的激活则不受影响。其次，安全性高。tBHQ广泛用于食品、油脂和化妆品等物质的抗氧化保护，而DEM则多用于化学工业中，显然tBHQ更具有安全性。最后，有效性好。tBHQ作为多酚类抗氧化剂，除可以通过激活Nrf2信号通路诱导解毒酶类的表达外，还可以通过直接与三价铁离子结合发挥抗氧化作用，抗氧化能力强于DEM。
发明内容
本发明人经研究发现，tBHQ不仅在细胞水平，还可以在动物水平升高AHSP的表达，从而增强其对α-珠蛋白的稳定作用，并且在地中海贫血细胞模型中tBHQ处理可引起 AHSP的表达在内源性反馈增加的基础上进一步提高。在第一个方面，本发明提供了 tBHQ在制备治疗地中海贫血的药物中的用途。特别地，所述的地中海贫血为β-地中海贫血。tBHQ通过上调地中海贫血患者中红细胞中的 α-珠蛋白稳定蛋白的表达而稳定过多的游离α -珠蛋白，从而缓解地中海贫血的症状，达到治疗的目的。特别地，本发明人发现，tBHQ通过激活Nrf2而上调α-珠蛋白稳定蛋白的表达。以Nrf2特异性激活剂tBHQ处理K562细胞后，AHSP的表达显著上调；过表达和干扰 Nrf2可以引起AHSP表达的上调和下调，说明Nrf2对AHSP存在正向调节作用；荧光素酶报告系统和ChIP证明Nrf2可以通过直接与AHSP调控区结合而在转录水平调节其表达。在第二个方面，本发明提供了 tBHQ在制备上调β-地中海贫血患者中的α-珠蛋白稳定蛋白的药物中的用途。由于存在内在的反馈环路，β-地中海贫血患者体内的AHSP 的表达水平应该高于正常人体内的AHSP表达水平。本发明人通过细胞水平实验和动物水平实验证明，tBHQ进一步升高了地中海贫血模型中的AHSP表达水平，从而可以起到治疗的作用。在另一个方面，本发明提供了一种治疗地中海贫血的药物组合物，其包括tBHQ和药学上可接受的载体。
图1. Nrf2的特异性激活剂tBHQ可调节AHSP的表达。A :tBHQ处理后半定量PCR 检测Nrf2和AHSP的表达。B tBHQ处理后，实时定量PCR检测AHSP的表达。C:tBHQ处理后western blot检测Nrf2和AHSP的表达情况。图2.在Nrf2干扰的K562细胞中检测AHSP的表达。A 半定量PCR检测AHSP在干扰Nrf2的K562细胞中的表达。B 实时定量PCR检测AHSP在干扰Nrf2的K562细胞中的表达。干扰GFP 感染pSIREN-siGFP后筛选得到的K562稳定细胞株，干扰GFP的细胞株作为干扰Nrf2细胞株的对照组。干扰Nrf2 感染pSIREN_siNrf2后筛选得到的K562稳定细胞株。图3.通过荧光素酶报告基因检测GATAl和Nrf2激活AHSP的启动子的活性A AHSP启动子元件的各个片段示意图。B :Nrf2可激活AHSP的启动子的活性。GATAl作为可以激活AHSP表达的阳性对照。图4. ChIP检测Nrf2在AHSP启动子区的富集AHSP-m/AHSP_P3。两个位于AHSP 启动子区的Nrf2的潜在结合位点。H0-1-E1/2 血红素加氧酶的两个增强子序列，Nrf2已报道的结合位点，为本实验的阳性对照。H0-l-eXon3 血红素加氧酶的第三外显子片段，作为本实验的阴性对照。Input为样品输出量，是每对引物的阳性对照，Nrf2为通过Nrf2的抗体免疫共沉淀而富集的DNA样品。IgG是通过IgG富集的DNA模板，为本实验的阴性对照。图5.在α -珠蛋白过表达的k562稳定株中(A)，tBHQ处理后western blot检测 Nrf2的激活情况⑶以及实时定量PCR检测AHSP的表达(C)。图6. A 实时定量PCR检测H0-1和AHSP在tBHQ处理Balb/C小鼠中的表达(tBHQ 注射用剂量。30毫克/公斤，小鼠尾静脉注射三次，每次间隔8小时，数量5只。B =Western blot检测HO-I和AHSP在tBHQ处理Balb/C小鼠中的表达。C和D :tBHQ处理Balb/C小鼠中AHSP和HO-I表达情况的统计学结果。
具体实施例方式1. Nrf2特异性激活剂tBHQ上调AHSP的表达亲电子试剂特丁基对苯二酚(tBHQ)和马来酸二乙酯(DEM)可以通过激活激酶通路而促进Nrf2的磷酸化，Nrf2磷酸化后入核而激活下游的靶基因。因此tBHQ和DEM已经被广泛作为Nrf2的特异性激活剂使用。
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tBHQ上调AHSP的表达首先配制浓度为20mM的tBHQ贮存液，然后将tBHQ加入处于对数生长期的K562细胞中，同时加DMSO为对照。分别按照时间梯度和药物浓度梯度处理后收细胞，提取RNA和蛋白，通过western blot检测Nrf2的激活情况，通过半定量PCR反应检测AHSP的表达情况。结果如图1所示，Nrf2可以在蛋白水平被tBHQ显著激活，RNA水平没有改变，这与文献报道是一致的。AHSP的RNA水平显著提高。这说明AHSP很可能是Nrf2的下游靶基因。干扰Nrf2降低AHSP的表达为了获得相对稳定的Nrf 2干扰细胞株，将pSIREN_siNrf2载体包装成逆转录病毒进行RNA干扰。在实验中，采用细胞作为病毒包装细胞系，用疱疹口炎病毒G(VSV-G) 提供包膜蛋白。VSV-G可识别一种所有细胞上都存在的磷脂，所以理论上能有效地感染所有有丝分裂的细胞。此外，VSV-G很稳定，因此病毒上清液可以通过离心浓缩到2000倍以上， 从而得到高滴度的病毒。提高病毒滴度可以提高靶mRNA的干扰效率，因为病毒滴度的增加提高了整合事件的发生从而引起了很强的shRNA的表达，进一步提高了细胞内siRNA的浓度。这一特点对于那些中低效率的RNA干扰序列尤其适用。收集的病毒上清经0.45μπι的滤膜过滤除去细胞碎片，分装，-70°C冻存，备用。用病毒感染时，直接将3ml病毒上清(含 polybrene 8 μ g/ml)加入处于对数生长期的K562细胞中，混勻后放回CO2孵箱中培养。 10-12小时后，离心换正常培养基继续培养。24h再感染一次。感染M小时后即可加含有嘌呤霉素(puromycin，1 μ g/ml)的选择培养基进行选择培养，约7-10天后形成混合细胞克隆。通过半定量RT-PCR、real-time PCR和western blot检测Nrf2的干扰效果和AHSP的表达情况。结果如图2所示，K562细胞中的Nrf2可以被有效的干扰，而AHSP的表达水平都显著下调。Nrf2可以激活AHSP基因的启动子活性上述研究表明Nrf2可以正向调节AHSP的表达，为了进一步研究Nrf2对AHSP的调节是否在转录水平进行，用双荧光素酶报告系统检测Nrf2是否能够调节AHSP基因的启动子活性。AHSP基因启动子区荧光素酶报告质粒的构建对AHSP基因启动子区0. 4k的片段进行截短缺失。分别为0. 4k-删除片段_1、 0. 4k-删除片段-2和0. 4k-删除片段-3。首先，在引物中引入酶切位点，从基因组中通过PCR方法将AHSP启动子区克隆。进而通过酶切连接的方法将其引入PGIXBbasic报告基因载体将构建好的荧光素酶报告质粒分别转染细胞，同时共转pcDNA4、 pcDNA4-GATAl和pcDNA4_Nrf2等表达质粒检测对启动子的激活情况，其中，pcDNA4作为阴性对照，GATAl作为阳性对照。结果如图3所示，与pcDNA4比，GATAl和Nrf 2均可激活AHSP的启动子活性，且二者对0. 4k-删除片段-1、0. 4k-删除片段-2和0. 4k-删除片段-3三个截短体的转录激活能力逐渐降低，但仍可激活。这说明Nrf2可以在转录水平调节AHSP的表达。Nrf2在AHSP启动子区的募集
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首先获得合适的超声破碎的染色质DNA片段。然后根据生物信息学的预测设计Nrf2潜在结合位点的引物，根据引物的扩增效率确定模板用量。实验中，除了特异的 anti-Nrf2抗体之外，还包括IgG对照用于校正抗体与染色质间的非特异性结合。此外， 根据人血红素加氧酶I (heme oxygenase I，H0_1)的增强子1和增强子2设计的引物作为 Nrf2结合的阳性对照，根据HO-I外显子3设计的引物作为阴性对照，以验证ChIP操作的可靠性。结果表明，Nrf2可以与AHSP启动子区的两个位点结合，且当K562细胞经tBHQ处理后，Nrf2与其中一个位点的结合增强，如图4所示。2. Nrf2特异激活剂tBHQ在细胞和动物水平上调AHSP的表达tBHQ可以进一步提高α -珠蛋白过表达的Κ562稳定株内AHSP的表达水平由于存在内在的反馈环路，β-地中海贫血患者体内的AHSP的表达水平通常高于正常人体内的AHSP表达水平。这点在地中海贫血小鼠体内也得到证明。首先需要明确的是，tBHQ是否可能进一步升高地中海贫血患者体内的AHSP表达水平而起到治疗的作用。以过表达α-珠蛋白的K562细胞作为研究的模型模拟β-地中海贫血的效应。首先以tBHQ处理过表达α-珠蛋白的K562细胞，通过Wfestern blot和实时定量PCR的方法分别检测Nrf2和AHSP的蛋白水平和RNA水平。结果如图5所示，tBHQ可以显著升高Nrf2 的蛋白表达水平，同时β-地中海贫血模型细胞中的AHSP RNA水平也都较药物处理前显著升高。tBHQ可以上调Balb/C小鼠体内AHSP的表达水平以上的结果表明tBHQ的确可以进一步上调α -珠蛋白过表达的Κ562稳定株中 AHSP的表达水平，说明了以tBHQ作为治疗地中海贫血药物的可能性。那么，tBHQ在动物体内是否可以发挥相同的作用呢？通过尾静脉注射的方法以tBHQ处理Balb/C小鼠，检测小鼠骨髓中AHSP等基因的表达情况。具体步骤如下(1)实验用小鼠的选择实验中选择18_22g的雄性Balb/C小鼠。饲养时注意温度和湿度适宜，环境安静， 12小时明暗交替。(2) tBHQ 的配制称取0. 5g tBHQ溶解在Iml的DMSO中，配制成250 μ g/μ 1的母液。再以PBS稀释成2. 5 μ g/ μ 1的工作液(含1 % DMS0)。高浓度tBHQ极易氧化，故每次加药均应新鲜配制。C3) tBHQ 处理小鼠采用尾静脉注射的方法先将小鼠置于固定筒内，使尾部露在外面。先以45-59°C 温水热敷鼠尾，再用70 %的酒精棉球擦拭尾部，待尾部左右侧静脉扩张后，左手拉尾，右手进针。给药量约为30mg/kg鼠重。对照组给同等剂量的用PBS稀释的1%DMS0。共给药三次，间隔8小时。(4)骨髓细胞的获取引颈处死给药组和对照组小鼠，取小鼠的两条股骨，用2ml —次性注射器吸取生理盐水将骨髓从股骨中冲出。注意冰上操作。离心后用PBS将骨髓细胞悬起，分成两份，其中1/3的骨髓离心后直接加Trizol处理，用于RNA的提取。另外2/3的骨髓经液氮速冻后可贮存于-70°C。用于蛋白的提取。(5) Western blot和实时定量PCR检测血红素加氧酶和AHSP的表达情况结果表明Nrf2经典下游分子血红素加氧酶H0_1的表达无论在蛋白水平还是在 RNA水平都显著升高(ρ < 0. 05)，这说明tBHQ在动物体内可以有效地诱导Nrf2的转录激活能力；AHSP的表达在蛋白水平和RNA水平也都显著升高(ρ < 0. 05)，说明tBHQ的确可以上调动物体内的AHSP的表达(图6)。
权利要求
1.特丁基对苯二酚在制备治疗地中海贫血的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的地中海贫血为地中海贫血。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中特丁基对苯二酚通过上调地中海贫血细胞中的α-珠蛋白稳定蛋白的表达而缓解地中海贫血的症状。
4.根据权利要求3所述的用途，其中特丁基对苯二酚通过激活Nrf2而上调α-珠蛋白稳定蛋白的表达。
5.特丁基对苯二酚在制备上调地中海贫血患者中的α-珠蛋白稳定蛋白的药剂中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述患者中的α-珠蛋白稳定蛋白的表达水平通常高于正常个体内的表达水平。
7.根据权利要求5或6所述的用途，其中特丁基对苯二酚通过激活Nrf2而上调α-珠蛋白稳定蛋白的表达。
8.一种治疗地中海贫血的药物组合物，包括特丁基对苯二酚和药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及特丁基对苯二酚在制备治疗地中海贫血的药物中的用途，特别是涉及特丁基对苯二酚通过激活Nrf2而上调α-珠蛋白稳定蛋白(AHSP)的表达从而缓解并治疗地中海贫血的症状。
文档编号A61K31/05GK102188413SQ20101012576
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者刘德培, 吕湘, 曹聪, 梁植权, 赵国伟 申请人:中国医学科学院基础医学研究所