专利名称：：一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法
技术领域：
：本发明属于植物生物
技术领域：
，是通过植物组织培养技术的无性繁殖方法，具体为春兰名贵品种的茎尖组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
：春兰(Cymbidiumgoeringii)属兰科兰属的地生兰，为多年生常绿草本植物，春兰花香馥郁，叶姿优美，花与叶均具观赏性，极富雅韵之态，为中国的十大名花之一。春兰主要分布于我国东南和西南地区，浙江省是春兰的主产区，栽培历史悠久，品种数多达300个左右，但由于春兰生长缓慢，单株每年只萌发03个新芽，依靠分株方法，繁殖系数低，一些传统名品如“绿云”、“宋梅”、“大富贵”、“龙字”、“集圆”等，尽管流传已久，但至今仍数量有限，单株价格成百上千，难以成批量见诸于市场，国兰中不少珍品，更是千金难求。春兰分株繁殖速度慢，且长期分株，植株易带病毒，导致种性退化，这都不利于名贵品种的普及和新品种的推广，已成为春兰名品工厂化大规模生产的一个瓶颈。植物组织培养技术是快速育苗的有效方法，已在园艺、林木等领域得到了广泛的应用。利用组织培养方法快速繁殖春兰名品的种苗，是提高春兰名品的质量和数量，获得大量性状整齐一致的种苗的最佳方法。本发明针对几种不同瓣型和花色的春兰名品，已成功研发出用春兰的茎尖为材料，进行新芽切割、消毒、茎尖剥取、根状茎诱导、增殖、芽诱导、生根壮苗和试管苗移栽等春兰组培快繁的一系列关键技术，解决了春兰名品大规模生产的技术瓶颈，为传统名花早日实现产业化生产打下了坚实的基础，该技术方法具有较好的应用和推广意义。
发明内容本发明的目的是针对春兰名品的组培快繁中，如何解决茎尖初代培养中易污染褐变，启动诱导根状茎难度大和时间长，根状茎增殖和芽分化的细弱，生根壮苗率和移栽成活率低等技术问题，提出一种既能解决上述技术难点，又能降低生产成本，实现春兰名品规模化优质组培苗生产的方法，即一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法。具体通过新芽切割、新芽消毒与茎尖剥取、根状茎诱导、增殖、芽诱导、生根壮苗培养和试管苗移栽等步骤来实现本发明的目的。本发明一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法，按以下步骤进行(1)新芽切割新芽切割时间以秋发新芽和冬发新芽为好，消毒和接种后不易污染；切割时尽量保证新芽的完整性，以免生长点受损，影响茎尖剥取和根状茎诱导。春兰新芽的萌发季节主要在春季，以春季的萌发数最多，只有栽培好的才会在秋季和冬季也有新芽萌发。在新芽高度、气温与污染率三者的关系方面，2月上旬，春芽未出土，芽高12cm时，气温低，芽小，病菌感染较少，消毒接种较不易污染褐变，到34月份，春芽已抽生出土，芽高34cm，气温升高，芽大，前期感染病菌的机会增多，消毒较难把握，消毒不够易污染，消毒过头，易褐变死亡；10月份的秋芽和12月份的冬芽，营养贮藏丰富，且气温降低，病菌减少，消毒接种不易污染褐化。秋芽和冬芽被切割后，养护管理跟上，还不影响春芽的萌发。切割芽时，必须脱盆，去掉新芽周边的土壤，看清楚芽基部的状况，用锋利的手术刀紧贴新芽基部切下，要尽量保证新芽的完整度，以免生长点受损，而影响茎尖的剥取和进一步的根状茎诱导。(2)新芽消毒与茎尖剥取新芽消毒以0.氯化汞溶液效果最好，对新生组织的刺激少，易成活；消毒方法采用二次消毒法，即新芽先剥取大些，用氯化汞消毒58分钟，再剥取到要接种的大小，以0.40.8cm高度的茎尖为宜，用氯化汞消毒1分钟，冲洗净残液后，直接接入培养基。取春兰名品的新芽为外植体，消毒时，先将新芽表面初步冲洗干净，用70%医用酒精药棉擦拭后，放于烧杯中，加200ml自来水，水中滴入23滴洗洁精或吐温-80，摇动均勻，杯口盖好纱网，浸泡30分钟，用自来水流水冲洗24小时，蒸馏水浸泡5分钟和冲淋3次，放到超净台上，用70%医用酒精药棉擦拭新芽后，放在无菌虑纸上，用枪式镊子和手术刀先剥去最外面的1层包叶后，新芽浸泡于70%医用酒精中0.51分钟，无菌水冲洗3次，再用二次消毒法进行消毒，即医用酒精浸泡后的新芽，用0.氯化消毒58分钟，无菌水冲洗5次，在无菌滤纸上一层层小心剥去包叶，并将基部切口褐化部分切去一段，剥到0.40.8cm大小的茎尖，再用0.氯化汞消毒1分钟，无菌水冲洗5次后，直接接入诱导根状茎培养基。比较次氯酸钠、次氯酸钙、双氧水和施康等消毒液，结果表明以0.氯化汞消毒效果最好，不易污染，对新生组织的刺激少，易成活。春兰初代建立时要特别注意消毒方法和茎尖切割的大小，茎尖接种一旦被污染，没有任何补救办法，只能失败告终，我们试验剥取茎尖大小以0.40.8cm为好，茎尖大小与污染率和生长速度成正比，春兰名贵品种生长相对缓慢，茎尖剥取太小，即使没有污染，也容易逐渐褐变死亡，以略偏大些为好，但若茎尖剥取太大，消毒不够彻底，则容易污染死亡。(3)茎尖诱导根状茎茎尖剥取大小在0.40.8cm高度合适，太小易褐变死亡，太大易污染死亡；茎尖刚接入培养基时，要放在培养温度1520°C的黑暗条件下培养715天，以减少其在高温和强光下易褐变的可能性，可以防止茎尖褐变死亡然后放到光照强度800lOOOlux的散射光或单支日光灯下培养34个月，光照12小时/天，可以在茎尖基部诱导出丛生状的根状茎。诱导根状茎培养基配方:1/2MS+NAA36mg/l+IBA0.5lmg/l+CM1015%+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+琼脂810g/l,pH5.4，其中1/2MS是指MS(Murashige-Skoog1962)基本培养基的母液1、母液2和母液3等大量元素母液的用量减半，其它铁盐、微量元素和维生素母液用量保持不变。CM为新鲜椰乳，如果条件有限，也可以用市售的椰子粉2030g/l替代。(4)根状茎增殖初代获得的根状茎长至1cm左右时，可以接入增殖培养基，每个隔23个月司可继代一次，通过反复分割继代培养，可获得大量的根状茎，培养温度2025°C，在光强800lOOOlux的散射光或单支口光灯下培养，光照12小时/天。增殖培养基配方1/2MS+NAA34mg/l+BA0.10.2mg/l+PT23g/l+活性炭2g/1+蔗糖20g/l+琼脂810g/l，pH5.4，添加外源营养物质蛋白胨(PT)，可以使根状茎生长更粗壮。(5)根状茎诱导芽当根状茎长至1.52cm长时，可以接入诱导芽培养基，培养温度2025°C，在光强25001uX左右的双支日光灯下培养，光照12小时/天，培养23个月后，在根状茎的顶端和侧面有芽点抽出，伸长，当芽高约4cm时可转至生根壮苗培养。诱导芽培养基配方1/2MS+NAA0.20.5mg/l+BAl2mg/l+KT0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂810g/l，pH5.4，注意诱导芽培养基不需要添加活性炭，它会严重抑制芽的生长。(6)生根壮苗培养当芽高约4cm时可转至生根壮苗培养，放在温度2025°C，光强25001UX的双支日光灯，光照12小时/天的条件下培养23个月，在培养后期的12个月，可放在温室内，靠自然光照培养，可以节省能源。生根壮苗培养基1/2MS+NAA12mg/l+IBA0.20.5mg/l+BA0.20.5mg/l+活性炭23g/l+蔗糖20g/l+琼脂810g/l，pH5.4，在生根壮苗阶段，如果有条件，可以添加3050g/l的椰子粉，能使根更加粗壮些。(7)试管苗移栽待小苗高67cm，有23条根时，根苗茁壮，即可移栽，移栽前要开瓶口炼苗710天，移栽介质以珍珠岩蛭石=32的组合为好，介质干净，使新生苗不易受微生物影响而烂根，介质的透气和保水性兼顾，小苗易成活，注意掌握好温度、光照、水分、空气湿度、肥料和病虫害预防等栽培条件。移栽具体方法是开瓶口炼苗710天，在有细孔的塑料筐内装满介质(珍珠岩和蛭石以32混合为好)，将洗净根部琼脂的小苗种植于筐内，介质填埋于根茎部位，不要种植太深，以防止通气不够，引起茎腐烂，种好后先放置在高湿弱光(15001UX)条件缓苗1015天，以后放在15°C25°C，空气相对湿度70%左右，光线稍强的条件下养护，12个月喷施1/1000的营养液和抗菌剂，控制浇水量为栽种的秘诀，成活率可达8590%，兰苗年生长量达58cm，经35年种植可开花。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果(1)本发明极大的提高了春兰名品的繁殖系数。目前春兰主要还是依靠传统分株法繁殖，一年能发03个芽，繁殖速度慢，难以满足大规模生产和消费的需求，本发明利用茎尖为外植体，一旦无性系建立，繁殖量呈平方数增加，能为大规模生产提供高质量的种田o(2)本发明以名贵春兰的秋发和冬发新芽茎尖为外植体，通过根状茎进行增殖，保证了品种的遗传稳定性，试管繁殖23年后可以再次通过茎尖更新无性系，从而使此法具有很高的商业价值。(3)本发明采用独特的0.氯化汞溶液的二次消毒法，即对略加清洗的大芽先消毒58分钟，再对剥成的茎尖再消毒1分钟，这对兰花茎尖的刺激少，消毒效果好，不易污染，较好地解决了地生兰难消毒，消毒时间短易污染，时间长不污染，但易褐变死亡等。(4)本发明将初代接种的茎尖放在1520°C的黑暗条件下培养715天，可以减少其刚开始培养时在25°C左右和25001UX光照下易发生褐变的可能性。(5)本发明筛选优化的茎尖诱导根状茎、根状茎增殖、根状茎诱导芽和生根壮苗的四种培养基，有着简便易配制，茎尖诱导根状茎率高的特点，已建立了宋梅、大富贵、逸品、集圆、苍岩素和元红等春兰名品的无性系，并可举一反三，适当修改后使用，使得本发明具有较高的应用和推广价值。(6)为了降低在生产上应用的成本，本发明进行了简化试验，如培养基添加白糖替代蔗糖，减少10倍的开销，根状茎增殖采用明亮的散射光，生根壮苗后期放在温室中可利用自然光照，均取得较好的增殖率和壮苗率，这使得组培中大量耗电的普遍问题，得到一定的解决，能节约能源，简化试验有效地降低了兰花组培苗的生产成本。(7)本发明筛选出适宜春兰试管苗炼苗的条件和移栽介质，如整齐一致的标准苗，现经过开瓶口炼苗，再出瓶移栽，珍珠岩和蛭石的组合介质，干净膨松，兼顾通气性和保水性，有利于根系进一步生长，试管苗成活率可达8590%。图1为春兰名品宋梅新芽。图2为宋梅茎尖剥取。图3为宋梅茎尖接种。图4为宋梅根状茎的诱导。图5为宋梅根状茎的增殖。图6为宋梅根状茎诱导芽。图7为宋梅生根壮苗培养。图8为宋梅试管苗移栽。具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明，但本发明的内容不是仅限于此。实施例一春兰名品“宋梅”的茎尖组织培养快速繁殖方法(1)新芽切割时间在1月底，方法是兰株脱盆，去掉新芽周边的土壤，看清楚芽基部的状况，用锋利的手术刀紧贴新芽基部切下，要尽量保证新芽的完整度，以免生长点受损，新芽高2厘米左右(见图1)，兰株晾放30分钟后，种回盆中。(2)新芽消毒与茎尖剥取将宋梅新芽表面初步冲洗干净，用70%医用酒精药棉擦拭后，放于烧杯中，加200ml自来水，水中滴入23滴吐温-80，摇动均勻，杯口盖好纱网，浸泡30分钟，用自来水流水冲洗24小时，蒸馏水浸泡5分钟和冲淋3次，放到超净台上，用70%医用酒精药棉擦拭新芽后，放在无菌虑纸上，用经火焰消毒过的枪式镊子和手术刀先剥去最外面的1层包叶后，新芽浸泡于70%医用酒精中30秒钟，无菌水冲洗3次，用0.1%氯化汞消毒5分钟，无菌水冲洗5次，在无菌滤纸上一层层小心剥去包叶，并将基部切口褐化部分切去一段，剥到0.6cm大小的茎尖(见图2)，再用0.氯化汞消毒1分钟，无菌水冲洗5次后，直接接入诱导根状茎培养基(见图3)。(3)茎尖诱导根状茎接有茎尖的培养瓶要放在1520°C的黑暗条件下培养715天，以减少其在高温和强光下易褐变的可能性，然后放到光强8001ux的散射光下培养34个月，光照12小时/天，可以在茎尖基部诱导出丛生状的根状茎(见图4)。诱导根状茎培养基配方l/2MS+NAA4mg/l+IBA0.5mg/l+CM10%+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+琼脂10g/1，pH5.4，其中1/2MS是指MS(Murashige-Skoog1962)基本培养基的母液1、母液2和母液3等大量元素母液的用量减半，其它铁盐、微量元素和维生素母液用量保持不变。CM为新鲜椰乳，如果条件有限，也可以用市售的椰子粉20g/l替代。(4)根状茎增殖初代获得的根状茎长至lem左右时，可以接入增殖培养基，每个隔2个月可继代一次(见图5)，通过反复分割继代培养，可获得大量的根状茎，培养温度2025°C，在光强lOOOlux的散射光或单支日光灯下培养，光照12小时/天。增殖培养基配方l/2MS+NAA3mg/l+BA0.lmg/l+PT2g/l+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+琼脂10g/l,pH5.4，添加外源营养物质蛋白胨(PT)，可以使根状茎生长更粗壮。(5)根状茎诱导芽当根状茎长至1.52cm长时，可以接入诱导芽培养基，培养温度2025°C，在光强2500lux左右的双支日光灯下培养，光照12小时/天，培养2个月后，当芽高约4cm时可转至生根壮苗培养(见图6)。诱导芽培养基配方1/2MS+NAA0.2mg/l+BA2mg/l+KT0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂10g/l,pH5.4。(6)生根壮苗培养当芽高约4cm时可转至生根壮苗培养，放在温度2025°C，光强25001UX的双支日光灯，光照12小时/天的条件下培养3个月(见图7)，在培养后期的1个月，可放在温室内，靠自然光照培养，可以节省能源。生根壮苗培养基l/2MS+NAA2mg/1+IBA0.2mg/l+BA0.2mg/l+活性炭3g/l+蔗糖20g/l+琼脂10g/l，pH5.4，在生根壮苗阶段，如果有条件，可以添加30g/l的椰子粉，能使根更加粗壮些。(7)试管苗移栽当小苗高7cm左右，根数23条，叶片34片，根苗茁壮，即可移栽。开瓶口炼苗715天，在10X5的穴盘中装满介质(珍珠岩和蛭石32混合)，将洗净根部琼脂的小苗种植于筐内，介质填埋于根茎部位，种好后先放置在高湿弱光(15001UX)条件缓苗1015天，以后放在15°C25°C，空气相对湿度70%左右，光线稍强的条件下养护，12个月喷施1/1000的营养液和抗菌剂，控制浇水量为栽种的秘诀，成活率可达8590%(见图8)。实施例二春兰名品“元红”茎尖组培快繁中白糖代替蔗糖的降低成本方法蔗糖价格约为白糖的10倍，若能替代，可有效降低生产成本。培养3个月后调查数据，从表1、表2、表3看出，使用白糖效果优于蔗糖或相近，结果表明根状茎增殖可选用白糖20g/l，根状茎诱导芽和根状茎直接诱导生根壮苗，要求碳水化合物营养高些，可选用白糖30g/l。(1)根状茎增殖选用长度1cm无分叉的根状茎顶端为材料，从表1看，糖浓度梯度对增殖数没有显著的影响，蔗糖间差值为17条，白糖间差值为7条，以白糖20g/l最高达218条；而糖浓度对生长量(鲜重)有比较大的影响，浓度高，生长量多，蔗糖30g/l比20g/l增加0.lg,20g/l比10g/l增加1.4g，差14倍，白糖30g/l比20g/l增加0.19g，20g/l比10g/l增加1.67g，差8.79倍，以白糖20g/l最高达5.37g。说明白糖优于蔗糖，20g/l的浓度最经济。表1糖处理对根状茎增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注每处理调查6瓶，每瓶接种4条，总根状茎数24条，鲜重0.183g/瓶，根状茎长lcm，无分叉。(2)根状茎诱导芽选用长度1.52cm有35个分叉的根状茎顶端为材料，从表2看，蔗糖和白糖30克/升时，最高芽的平均数和生长量(总鲜重)都是最高的，蔗糖比白糖在总芽数上多13个，最高芽的平均数高0.046cm，生长量(总鲜重)重0.78g。从价格产出比看，用30克/升的白糖代替蔗糖还是可行的。表2糖处理对根状茎诱芽的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注每处理调查6瓶，每瓶接种4条，总根状茎数24条，鲜重0.275g/瓶，根状茎长1.52cm，有3-5个分叉。(3)根状茎直接诱导生根壮苗选用长度1.52cm有35个分叉的根状茎顶端为材料，从表3看，在直接成苗上，用白糖30g/l较好，总芽数为19个，总根数14条，成苗数6株，成苗率为2.56%。从成苗率看，生长3个月，根状茎直接成苗数极少，小苗达不到移栽标准，无法获得批量整齐的优质试管苗，说明想过度节约成本而缺少根状茎诱导芽这一步骤，来直接生根成苗行不通，用白糖20克/升时反而根状茎增殖数最高达262条。表3糖处理对根状茎生根壮苗的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注每处理调查6瓶，每瓶接种4条，总根状茎数24条，鲜重0.275g/瓶，根状茎长1.52cm，有3-5个分叉。无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可应用本发明对春兰名品进行茎尖组织培养快速繁殖。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。权利要求一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法，是以春兰品种的茎尖为外植体，包括新芽切割、新芽消毒与茎尖剥取、根状茎诱导、根状茎增殖、根状茎芽诱导、生根壮苗培养和试管苗移栽，其特征在于，茎尖诱导根状茎、根状茎增殖、根状茎诱导芽和生根壮苗四个过程的不同培养基选用(1)茎尖诱导根状茎1/2MS+NAA3～6mg/l+IBA0.5～1mg/l+CM10～15％+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+琼脂8～10g/l，pH5.4；(2)根状茎增殖1/2MS+NAA3～4mg/l+BA0.1～0.2mg/l+PT2～3g/l+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+琼脂8～10g/l，pH5.4；(3)根状茎诱导芽1/2MS+NAA0.2～0.5mg/l+BA1～2mg/l+KT0.2～0.5mg/l+蔗糖20g/l+琼脂8～10g/l，pH5.4；(4)生根壮苗1/2MS+NAA1～2mg/l+IBA0.2～0.5mg/l+BA0.2～0.5mg/l+活性炭2～3g/l+蔗糖20g/l+琼脂8～10g/l，pH5.4。2.根据权利要求1中所述一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于，新芽切割时间选择秋发新芽或冬发新芽，切割时尽量保证新芽的完整性。3.根据权利要求1中所述一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于，新芽消毒选用0.氯化汞溶液，消毒方法采用二次消毒法，即新芽先剥取大些，用氯化汞消毒58分钟，再剥取到0.40.8cm高度的茎尖，用氯化汞消毒1分钟，冲洗净残液后，直接接入培养基。4.根据权利要求1中所述一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于，诱导根状茎时，当0.40.8cm高度的茎尖接入培养基时，要放在黑暗条件下培养715天，然后放到光照强度800lOOOlux的散射光或单支日光灯下培养，培养温度在1520°C。5.根据权利要求1中所述一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法，其特征在于，试管苗移栽时，待小苗高67cm，有23条根时移栽，移栽前要开瓶口炼苗710天，移栽介质选用珍珠岩蛭石=32的组合介质。全文摘要本发明提供一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法，以春兰名贵品种的新芽茎尖为外植体，包括茎尖诱导根状茎培养、根状茎继代增殖培养、根状茎诱导芽培养、生根壮苗培养以及试管苗移栽炼苗培养等步骤，在新芽切割、消毒和茎尖剥取，根状茎诱导、增殖、芽分化和生根壮苗等培养阶段选择优化培养基，从而使得春兰名贵品种能够实现种苗快速繁殖，获得量多、质优、价廉的种苗，为春兰的工厂化生产奠定基础。本发明的方法，可操作性强，较好的解决了春兰依靠传统分株法，繁殖速度慢，易退化等问题，可以逐步实现商品性好的春兰品种的产业化生产，该方法具有较高的应用和推广价值。文档编号A01H4/00GK101822220SQ20101016954公开日2010年9月8日申请日期2010年5月11日优先权日2010年5月11日发明者夏宜平,李方,柴明良,陈昆松,黄焱申请人:浙江大学