专利名称：水稻钾、铵双功能转运分子及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，具体地，本发明涉及水稻钾、铵双功能转运分子及 应用。
背景技术：
N、P、K是作物生长的必要的大量元素，营养的吸收和利用是限制产量的主要因素，提高作物营养的有效利用一直是育种追求的目标，在当前富营养化土壤污染日益加剧的条 件下，增加作物营养的自身利用效率，造就绿色生态农业，也是值得关注的另一个方面。土 壤中的钾、氮是植物钾营养的主要来源，且土壤中的钾、氮易淋溶流失，过多地淋溶流失，会 造成土壤含营养量有限，使有效营养成分利用越来越困难，另一个方面过多施用也会造成 水体的富营养化和水环境的严重破坏。钾、氮是植物细胞内最重要的元素，也是影响作物产 量的三大营养要素之一。钾是维持细胞内、外电化学势的主要溶质，影响着植物细胞的水 势、渗透势和膨压，参与细胞的运动、生长、伸长；帮助光合电子传递，提高植物对其他营养 元素的吸收和利用；钾也是酶的辅助因子，使细胞质保持着适宜的PH值，直接或间接地影 响着50多种酶的活性；钾的另一重要生理作用是增强细胞对环境条件的调节作用，从而增 强植物对各种不良逆境的耐受能力，如干旱、低温、含盐量、病虫危害、倒伏等；氮是细胞 的结构组分，也是蛋白质的重要组成成分，其重要性不言而喻。钾以离子的形式存在，不是细胞的结构组分，可从一个部位转移到另一个部位在 植物体内重复利用；氮大部分也是以离子的形式(NH4+、NO3-等)被吸收，与其易流动、再分 配的特点相适应，植物体内存在一大类与钾、氮转运有关的蛋白分子，从离子的亲和性、选 择性及驱动的能量来源分为不同类型。大量的研究表明，营养的有效利用(包括钾、铵的吸 收、运输、分泌等)，都是由不同类型的离子转运体的功能决定，无论是吸收、分配、再循环还 是体内的有效储存，其效应都是由转运体的表达和活性调节得以实现。因此，分离、鉴别水 稻钾、铵转运体分子，是从分子水平改善水稻氮、钾营养利用不可逾越的环节，也是转基因 操作改善其品质的基础。植物中已鉴定出三个由α-亚基形成的钾选择通道家族，分别为Shaker-type、 TPK和Kir-Like，参与钾吸收、再分配和区域化，维持和产生膜的极性，也发现了以AMTl为 代表的铵转运体家族。水稻是一年生禾本科植物，世界上近一半人口以稻米为食。水稻缺钾症状表现为 老叶叶尖及前端叶缘褐变或焦枯，同时出现褐色斑点；植株伸长受抑制而萎缩；叶色加深， 呈暗绿色且无光泽；根系细弱，多褐根，老化早衰；抽穗不整齐，秕谷率增加，正常受精的谷 粒也不饱满，产量和品质下降，氮缺乏会带来更严重的病理症状。除了合理施肥，提高田间 管理措施等防治措施外，从水稻本身的钾、氮营养分子基础研究入手，增加作物吸收营养和 体内循环利用的效率，无疑可以为应对作物营养缺陷的挑战，提供值得期待的技术和优质 基因资源。从水稻基因组的数据分析，水稻存在已知的所有类型的植物钾离子转运体，至少有11个编码Shaker家族的钾通道的基因，分布在不同的染色体上，其中一号染色体有3个，2号有2个，4号有2个，5、6、7、9号各有1个。水稻的Shaker钾通道目前只有两个结 果=OsKATl能增加水稻胞内钾的含量，抵御盐的胁迫(Obaa et al. ,2007) ；OsAKTl是电压 依赖的内向整流钾离子通道，但是对盐胁迫敏感(Fuchs et al.，2005)。水稻铵离子转运体 的研究更是滞后于钾转运家族的研究，最近的研究表明钾、铵的转运既可互相影响、也可协 同运输；增加外界钾的含量，可抑制铵的内流，铵、钾可能部分共享同一条通路，因此有必要 从水稻中克隆能够提高钾、铵利用效率的相关基因并验证其功能，从而筛选出可以利用的 基因资源，并进一步通过转基因等技术应用于农作物来提高其对钾、铵的有效利用能力。
发明内容
本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。本发明的目的是提供一种水稻钾、铵双功能转运分子。本发明的再一目的是提供上述水稻钾、铵双功能转运分子的应用。根据本发明的水稻钾、铵双功能转运分子，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。根据本发明的水稻钾、铵双功能转运分子基因编码上述转运分子，其序列如SEQID No. 1所示。本发明还提供了包含上述水稻钾、铵双功能转运分子基因的真核表达载体，优选 将水稻0sKAT3基因构建到pYES2载体上，得重组质粒pYES2_0sKAT3。本发明提供了所述水稻钾、铵双功能转运分子在同时提高植物N、K营养方面的应 用。从而，本发明也提供了一种同时提高植物N、K营养利用的方法，所述方法包括将所述水 稻钾、铵双功能转运分子基因导入植物中并表达的步骤。本发明首先从粳稻(Oryza sativa ssp. japonica)品种日本晴中克隆了 0sKAT3 基因，验证了水稻0sKAT3基因具有高效吸收K+的功能，更令人激动的是这一基因还具有 高效转运NH4+的特性，具体发明如下首先克隆了相关基因，采用缺陷型酵母CY162(Trkl/ Trk2)作为宿主菌，获得了低钾条件下生长旺盛的转化子，由此初步验证了 0sKAT3的吸钾 功能；进一步，利用双电极电压钳技术(TEVC)和体外异源表达系统-非洲爪蟾卵母细胞，表 达分析了 0sKAT3离子通道活性、门控特征和离子选择性，发现0sKAT3不仅可以转运K+，而 且可以有效地转运NH4+,精确鉴定了 0sKAT3转运能力，获得了比典型Shaker家族基因KATl 吸钾更强的内向整流钾通道分子，而且这一基因还有其他同源Shaker家族基因不可比拟 的NH4+特异选择性，也就是说如果合理的利用这一基因，可同时提高作物对两种重要的营 养元素(K、N)的利用效率，同时增加吸钾和吸铵的能力，本发明为有效利用这一基因资源 打下了坚实的基础。
图10sKAT3基因的克隆，水稻0sKAT3基因的PCR扩增产物和pEASY_Tl重组质粒的酶切及PCR鉴定，其中， 图 IA :M 为 Marker III (TransGene) ；Ianel 为 0sKAT3 的 PCR 结果；图 IB :M 为 Marker III (TransGene) ；Ianel 为 0sKAT3 的 BamHI/Xbal 酶切结果；图 IC :M 为 Ikb plus marker (TransGene) ；lanel，8，9，10，11，13，14，15，16，17 为菌落PCR检测结果。图2水稻0sKAT3基因表达的组织特异性。图3水稻0sKAT3功能验证载体的构建，图 3A 左lanel，2，3，4，5，6 为 pYES2_0sKAT3 质粒 PCR 检测结果，lane7，8，9，10， 11，12 为 pGEMHE-0sKAT3 质粒 PCR 检测结果，M 为 Marker III (TransGene)；中M 为 Marker III (TransGene) ；Ianel 为 pYES2_0sKAT3 的 BamHI/Xbal 酶切结 果；右M为 Marker III (TransGene) ；Ianel 为 pGEMHE_0sKAT3 的 BamHI/Xbal 酶切结^ ο图 3B :lanel，2，3，4，5，6，7，9，10，ll，12，15 为 pYES2-0sKAT3 质粒转化酵母 CY162 后的菌落PCR检测结果，M为Marker III (TransGene)。图4、水稻0sKAT3基因互补酵母钾转运体缺陷型突变体CY162，从上至下依次为阳性对照，AtKATl转化子；水稻0sKAT3基因转化子；阴性对照， PYES2转化子；从左至右依次为OD6tltl = 1. 0的菌液，10，IO2, IO3, IO4倍稀释的菌液。图5 水稻0sKAT3钾、铵离子双功能选择和转运活性验证，A 浴液为IOOmM谷氨酸钠；B IOOmM谷氨酸铵；C IOOmM谷氨酸钾；D IOOmM氯化 锂；E =I-V曲线。图6 水稻0sKAT3钾离子浓度依赖活性，水稻0sKAT3基因对钾离子转运活性的浓度依赖性结果，A :a 浴液为IOmM谷氨酸 钾；b :50mM谷氨酸钾；c :100mM谷氨酸钾；d :I_V曲线；B 尾电流，a 浴液为IOmM谷氨酸 钾；b :50mM谷氨酸钾；c =IOOmM谷氨酸钾；d :I_V曲线。 图7 水稻0sKAT3铵离子浓度依赖活性，A :a 浴液为IOmM谷氨酸铵；b :50mM谷氨酸铵；c :100mM谷氨酸铵；d J-V曲线； B 尾电流，a 浴液为IOmM谷氨酸铵；b :50mM谷氨酸铵；c :100mM谷氨酸铵；d :I_V曲线。图 8 :pGEMHE 载体图。
具体实施例方式实施例1 水稻0sKAT3基因的克隆提取水培生长10天的水稻根和叶的总RNA并以其为模板，以Oligo dT为引物作 逆转录，反应完成后取1 μ L逆转录产物作为模板，以特异引物K3F和K3R进行PCR扩增。 结果得到约2. Ikb左右的单一产物(图1Α)。将此扩增条带纯化回收后，与pEASY-Tl载体 连接的重组质粒PTK3，并转化大肠杆菌感受态细胞DH5ci。挑取单克隆质粒进行酶切检测 (图1Β)及菌落PCR鉴定(图1C)后，选取阳性克隆并测序。K3F 5' -ATGACCCAAGCTCACTCAAAATCTTGCTTCC-3'K3R 5' -CTACATCTCAAGAAGGAATAGATGGTCGCCA-3‘0sKAT3的cDNA序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No. 1和SEQID No. 2所示。SEQ ID No. 1 atgacccaag ctcactcaaa atcttgcttc caccagttct gggatggact ccagatcaag
aggagcagcg atagcttcac tgtagagcta ctgccatccc ttggtgcaac tataaaccac 120tccaacaagt tgcagaagtt catcatatcg ccttatgatc cccggtacag atcctgggag 180ctgttcctta tagtcctagt tgtttactct gcctggattt gtccgtttga actagcattc 240ctgagggact taccatctaa gcttttgcta gttgagaaca ttgtggatat attctttgcc 300attgatattg ttttgacgtt cttcgttgct tatgtcgata gcaaaacaca tcttcttgtg 360gatgaccgaa agagaattgc aatgaggtac ctatccactt ggtttatctt tgatgtatgt 420tcaacagcac catttcaacc aatcatcctt ctatttacac acaaggggaa tgacattgct 480ttcaaggtac tcaatttgct caggctgtgg cgtcttcacc gagtcagttc actatttgcc 540aggctggaga aagacatccg attcaactat ttctggacta ggtgctcaaa acttatttct 600gtgaccctct tcgcagtaca ttgtgcagga tgcttcaatt atatgattgc tgacagatat 660cccaacccag agaaaacatg gataggagct gtgatgtcaa ctttcagatc agagagctta 720tggactagat atattactgc tctttactgg tccattacaa cactgacaac aacaggatat 780ggggacctac atgctgaaaa tccaacagag atgctatttg atattgtcta tatgatgttt 840aatctgggct tgacagctta tctcattggc aacatgacca acctagttgt ccatgggacc 900agccgcacca ggaaatttag ggactcaatc caagcagcat cagagtttgc agcacgcaat 960cagctacctg agaacataaa gcagcaagtg ctatctcact tctgcctaca attcaagaca 1020gagggactca accagcaggt catgttagac tgtctaccaa aaggaatccg ctcaagcata 1080gcatacagct tattctttcc gatcatccgg caagcctatc tcttcaatgg agtatctggc 1140aatttcattg cagaactggt catggaagtg caggctgagt acttcccacc aaaggaagat 1200
ataatattgc agaatgaagg agaagcagat gtttacatag tagtttcagg agcagtgaat 1260ataataacaa caatacatgg gaatgagcag gtatatgaga aaattgcaga gggagaaatg 1320tttggagagg ttggttcttt atgtaacata ccccagccat ttacttgccg cacagcggag 1380ctatcacagc ttttaagaat aagcaaaaca aggcttagag agatcattga agaaaacagg 1440gaagacagta acattctaat gaacaaccta gttcagaagc tgaagctacg agaaagttta 1500
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RLEKDIRFNY FffTRCSKLIS VTLFAVHCAG CFNYMIADRY PNPEKTffIGAVMSTFRSESL 240WTRYITALYff SITTLTTTGY GDLHAENPTE MLFDIVYMMF NLGLTAYLIG MMTNLWHGT 300SRTRKFRDSI QAASEFAARN QLPENIKQQV LSHFCLQFKT EGLNQQVMLDCLPKGIRSSI 360AYSLFFPIIR QAYLFNGVSG NFIAELVMEV QAEYFPPKED IILQNEGEADVYIVVSGAVN 420IITTIHGNEQ VYEKIAEGEM FGEVGSLCNI PQPFTCRTAE LSQLLRISKTRLREIIEENR 480EDSNILMNNL VQKLKLRESL PDMNQPDRRF LSKYELFHVP REAffLLKKSQLHYTEHTSRD 540SSNNTPVFGG DRYSRQLLGE ATRSSASENE NSSMTDKEEN HDEVHTNCEIKKRTEEHCIQ 600INSEDSSSTY SQRTMNATVQ TGSPHKTEEN ITRRIPDEYY IKEANKRVTIHKYRHNSTVS 660AAQNGKLIKL PTSLEELFKI GSQKFQGFHP RKVVSRDYAE IDDVSVIRDGDHLFLLEM 718在 ExPASy Proteomics tools-TMHMM(http://www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM-2. O/)对其作了跨膜域分析，显示为 验证0sKAT3具有Shaker家族的特异跨膜结构。为了解0sKAT3基因在水稻不同组织器官中的表达情况，分别提取了水稻根、叶的 总RNA，作半定量RT-PCR分析(图2)。结果显示0SKAT3基因在水稻叶片中的表达较强，而 在根中的表达较弱。以上实验结果表明0sKAT3基因的表达在水稻中有明显的组织差异性， 其在叶片部位的表达较为活跃。实施例2 水稻0sKAT3基因的真核表达载体的构建及功能互补1、水稻0sKAT3基因表达质粒的构建将水稻0sKAT3构建到pYES2载体(该载体购自Invitrogen公司)，转化大肠杆菌 后，提取质粒并检测(图3A)。2、重组质粒pYES2_0sKAT3的功能互补实验将构建好的pYES2-0sKAT3载体，转化酵母CY162菌株，在IOmM SD固体培养基下生 长1-2天，挑取酵母克隆检测(图3B)后，在IOmM SD液体培养基下培养约1天，转至0. ImM YNB+Gal固体培养基中生长，通过观察生长情况验证了水稻0sKAT3基因具有内向转运钾的 活性(图4)。实施例3 水稻0sKAT3基因的电生理功能分析将水稻0sKAT3基因构建到pGEMHE载体(该载体最先由Harvard MedicalSchool 的Liman等将非洲爪蟾的一个β -globin基因的3’ -UTR和5’ UTR引入pGEM_3Z载体改造 而成，载体图如图8)，转化大肠杆菌后检测(如图3A)，以特异引物M13和M13R进行PCR扩 增，将产物做Capping RNA，通过显微注射技术将其注射到Xenopus oocytes中表达约2天，再利用TEVC(Two-electrode voltage-clamp)技术对0sKAT3基因做电生理分析。1、水稻OsKATl基因的钾转运功能分析1)配制浴液钾离子浴液IOOmM谷氨酸钾，2mM MgCl2, ImM CaCl2, IOmM Hepes ；甘露醇浴液IOOmM甘露醇，2mM MgCl2, ImM CaCl2, IOmM Hepes ；2)设置测定程序电压从-130mV到50mV，以20mV递增，测定时间为4. 8s。以IOOmM甘露醇做对照，以IOOmM谷氨酸钾做浴液进行测定，结果表明0sKAT3基 因具有转钾活性(图5)。2、水稻0sKAT3基因的离子选择性分析对0sKAT3基因的离子选择性分析，以IOOmM谷氨酸钠，IOOmM谷氨酸铵，IOOmM氯 化锂做浴液进行测定，结果表明0sKAT3基因对铵根离子具有转运活性，而对钠离子和锂离 子没有转运活性(图5)。1)配制浴液铵离子浴液IOOmM谷氨酸铵，2mM MgCl2, ImM CaCl2, IOmM Hepes ；钠离子浴液IOOmM谷氨酸钠，2mM MgCl2, ImM CaCl2, IOmM Hepes ；锂离子浴液IOOmMLiCl，2mMMgCl2, ImM CaCl2, IOmM Hepes ；甘露醇浴液IOOmM甘露醇，2mM MgCl2, ImM CaCl2, IOmM Hepes ；2)设置测定程序电压从-130mV到50mV，以20mV递增，测定时间为5. 4s。3、水稻0sKAT3基因的钾离子浓度依赖性分析对0sKAT3基因的钾离子浓度依赖性分析，分别以10mM，50mM, IOOmM谷氨酸钾做浴 液进行测定，结果表明0sKAT3基因对钾离子具有浓度依赖性，随着浓度的增加，转运活性 也在增加(如图6)。1)配制浴液钾离子浴液IOOmM谷氨酸钾，2mM MgCl2, ImM CaCl2, IOmM H印es ；取部分稀释为 50mM 禾口 IOmM ；2)设置测定程序A 电压从-130mV到50mV,以20mV递增，测定时间为4. 8s ；B:尾电流测定。4、水稻OsKATl基因的铵离子浓度依赖性分析对0sKAT3基因的钾离子浓度依赖性分析，分别以10mM，50mM, IOOmM谷氨酸铵做浴 液进行测定，结果表明0sKAT3基因对铵根离子也具有浓度依赖性，随着浓度的增加，转运 活性也在增加(如图7)。1)配制浴液铵离子浴液IOOmM谷氨酸铵，2mM MgCl2, ImM CaCl2, IOmM H印es ；取部分稀释为 50mM 和 IOmM2)设置测定程序A 电压从-130mV到50mV,以20mV递增，测定时间为4. 8s ；
B 尾电流测定
权利要求
一种水稻钾、铵双功能转运分子，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种水稻钾、铵双功能转运分子基因，其特征在于，编码权利要求1所述水稻钾、铵 双功能转运分子。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其序列如SEQID No. 1所示。
4.含权利要求2所述水稻钾、铵双功能转运分子基因的真核表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，将水稻OsKAT3构建到pYES2载体，得 重组质粒 pYES2-0sKAT3。
6.权利要求1所述水稻钾、铵双功能转运分子在同时提高植物N、K营养利用方面的应用。
7.一种同时提高植物N、K营养利用的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2所 述水稻钾、铵双功能转运分子基因导入植物中并表达的步骤。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，具体地，本发明涉及水稻钾、铵双功能转运分子及应用。根据本发明的水稻钾、铵双功能转运分子，其基因序列如SEQ ID No.1所示，本发明首先从粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品种日本晴中克隆得到了OsKAT3基因，验证了该水稻OsKAT3基因具有高效吸收K+的功能，更令人激动的是这一基因还具有高效转运NH4+的特性。
文档编号A01H5/00GK101824081SQ20101017814
公开日2010年9月8日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者张鹏, 李乐攻, 田丽丽 申请人:首都师范大学