专利名称：一种抑制比目鱼眼睛移动的方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制比目鱼眼睛移动的方法，包括向变态前比目鱼仔鱼注射秋水 仙素，以及秋水仙素的浓度和剂量，注射的方法，注射的时间，注射的部位。可用作培育眼睛 不移动但是其它变态事件正常的比目鱼，为科学研究领域提供两眼对称的比目鱼。
背景技术：
比目鱼是鲽形目鱼类的总称，其两眼均位于身体的一侧，在两侧对称的脊椎动物 中鲽形目的左右不对称属于一个特例。比目鱼身体不对称的建立对于组织器官的正常发育 至关重要，生产上不对称建立失败的仔鱼将会大量死亡。另外，身体不对称的建立对于脊椎 动物的正常发育至关重要，虽然脊椎动物外形上是左右对称，但内脏器官却是左右不对称 的，人的内脏器官位置的异常会引起严重的临床疾病，如发病率为百万分之一的“镜面人” 就是内脏器官的左右完全颠倒，常常伴随严重的心血管疾病。左右不对称建立的机制目前尚不清楚，比目鱼不对称发育机制的阐明将帮助理解 人类内脏器官位置异常的发病机制，因此比目鱼将是研究脊椎动物左右不对称的一种合适 的模式生物。从胚胎期一直到仔鱼期，比目鱼的眼睛是左右对称分布的，在仔鱼期向稚鱼期转 变的时候，其中一只眼睛向上移动，逐渐绕过头部移动到头部的另一侧。在这一过程中，头 部的神经，骨骼，肌肉以及血管分布均发生变化以适应稚鱼期的底栖生活方式。对于这些变 化目前知之甚少，而关于眼睛移动的机制更是不得而知。眼睛的移动会对其它的组织器官如神经，肌肉，骨骼和色素等有哪些影响以及对 于稚鱼的生活习性和生长发育有哪些影响将会是比目鱼变态发育研究中很重要的研究课 题。但是，该研究需要的反面材料即眼睛不移动的个体通常无法获得。目前可以通过筛选 自然突变的个体或者用甲状腺激素合成抑制剂_硫脲浸泡比目鱼仔鱼得到眼睛不移动的 个体。然而自然突变的概率通常非常小，很难找到眼睛不移动的个体进行比较研究，而用硫 脲浸泡的仔鱼不能完成变态发育，仍然维持仔鱼期的形态，且甲状腺激素可能调控相关组 织的生长发育，因此采用甲状腺激素抑制的方法也达不到预期的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种局部抑制的方法，具体涉及一种抑制比目鱼眼睛移动 的方法包括注射药物的浓度、注射的剂量、麻醉的方法、注射牙鲆的时间和位置、注射欧鳎 的时间和位置、注射半滑舌鳎的时间和位置。在不影响其它变态事件的前提下使眼睛不移 动，为研究眼睛的移动对于神经，肌肉，骨骼，生活习性以及生长发育的影响提供大量的实 验材料。本申请选用牙鲆(Paralichthysolivaceus)、欧鳎(Solea solea)、半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis)，采用秋水仙素作为局部抑制的药物，抑制比目鱼眼睛移动。牙鲆(Paralichthys olivaceus)，属硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲽形目，鲽亚目，鲆科，牙鲆属。俗称偏口鱼、高眼、平目、左口、牙鳎、比目鱼、牙片、地鱼、沙地、牙鲜、相鱼等地方 名。欧鳎(Solea solea)又称塞内加尔鳎米鱼、宝宝鱼，皇帝鱼，属硬骨鱼纲、 Pleuronectiformes (flatfishes)鳎形目、鳎亚目、鳎科 Soleidae (Soles)、欧鳎属 Actinopterygii(ray-finned fishes)半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，俗称牛舌头、鳎 目、鳎米。秋水仙素是抑制细胞分裂的一种试剂，根据我们研究的结果，比目鱼眼睛移动是 由眶下皮肤组织的细胞分裂推动的，因此，通过显微注射秋水仙素之比目鱼移动眼的眶下 皮肤组织，应可以抑制眼睛的移动，而不会影响到比目鱼的其它变态事件。本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现一种抑制比目鱼眼睛移动的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)注射药物的准备选取秋水仙素作为注射药物；(2)麻醉选用麻醉剂将比目鱼麻醉；(3)注射选取眼睛尚未移动的比目鱼，在比目鱼眼睛开始移动前2-4天注射，注 射的位置为眼睛下侧组织，针头穿透皮肤组织2-4mm，避开眼球血管和神经；在首次注射后2-5天追加注射。步骤(1)中，所述秋水仙素的注射浓度为50 μ g/mL，每尾仔鱼注射剂量约为50nL。步骤(2)中，所述麻醉剂(1)采用养殖比目鱼的海水配制麻醉剂；(2)麻醉剂3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(tricaine methanesulfonate, MS-222)浓度为 0. lmg/ml ；(3)麻醉时间为2至3分钟。进一步，所述比目鱼为牙鲆(Paralichthysolivaceus)、欧鳎(Soleasolea)、半滑 舌觸(Cynoglossus semilaevis)。步骤(3)中，所述牙鲆的注射时间和位置(1)牙鲆仔鱼右侧眼睛尚未移动，在比目鱼眼睛开始移动前2天注射；(2)注射的位置为右眼下侧，针头穿透皮肤组织2_4mm，避开眼球血管和神经；(3)在首次注射后2天追加注射，并于追加注射后2天再次追加注射。步骤(3)中，所述欧鳎的注射时间和位置(1)欧鳎仔鱼左侧眼睛尚未移动，在比目鱼眼睛开始移动前4天注射；(2)注射的位置为左眼下侧，针头穿透皮肤组织2_4mm，避开眼球血管和神经；
(3)首次注射后3天追加注射。步骤(3)中，所述半滑舌鳎的注射时间和位置(1)半滑舌鳎仔鱼右侧眼睛尚未移动，在比目鱼眼睛开始移动前3天注射；(2)注射的位置为右眼下侧，针头穿透皮肤组织2_4mm，避开眼球血管和神经；(3)首次注射后5天追加注射。本发明的有益效果1)本发明能够人为地控制比目鱼眼睛的移动，能够为观察眼睛移动对仔鱼生活习性及生长发育的影响提供实验材料。2)本发明通过对局部组织进行显微注射药物，而不影响仔鱼整体的生长发育，为 研究药物对鱼体的局部作用效果提供了可行的操作方法。3)本发明采用的药物秋水仙素能够抑制眼睛移动，而不影响其它组织器官的正常 发育，相比通过硫脲浸泡抑制比目鱼的变态发育，局部注射秋水仙素抑制的作用效果更加
单一和明显。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。
图1分别于17DAH，19DAH和21DAH注射牙鲆右眼对照组，35DAH右眼已经完全移过 头顶到左侧。图2分别于17DAH，19DAH和21DAH注射牙鲆右眼秋水仙素，35DAH右眼仍没有移动。图3分别于10DAH和13DAH注射欧鳎左眼对照组，22DAH左眼已经完全移动到了右 侧。图4分别于10DAH和13DAH注射欧鳎左眼秋水仙素组，22DAH左眼仍没有移动。图5分别于15DAH和20DAH注射半滑舌鳎右眼对照组，28DAH右眼已经完全移到了左侧。图6分别于15DAH和20DAH注射半滑舌鳎右眼秋水仙素组，28DAH右眼仍然没有移动。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具 体图示，进一步阐述本发明。本申请所述新鲜海水是指养殖比目鱼的海水。实施例1显微注射秋水仙素抑制牙鲆右眼移动的方法，可按照以下步骤操作一、秋水仙素的配制用灭菌的0. 75%氯化钠溶液将秋水仙素稀释成5mg/ml的秋水仙素贮存液，配制 50 μ g/ml秋水仙素溶液。二、麻醉剂的配制用新鲜曝气的盐度35%。温度为20°C的海水配制0. lmg/mL 3_氨基苯甲酸乙酯甲 基磺酸盐(tricaine methanesulfonate, MS-222)溶液，临用前现配。三、琼脂板的制备用蒸馏水配制2%琼脂糖溶液，微波炉加热溶化，向90mm培养皿中倒入15至20mL 琼脂溶液冷凝备用。四、注射秋水仙素牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔鱼显微注射秋水仙素(1)牙鲆饲养于盐度35%。，温度为20°C的海水条件下，每日上午9点和下午4点投喂卤虫无节幼体，分别于早上8点，下午3点和晚上8点吸污。(2)首次显微注射秋水仙素的时间在17DAH，将仔鱼转移至新配制的牙鲆仔鱼麻 醉剂溶液中麻醉2至3分钟。(3)将麻醉的仔鱼依次排放在琼脂板上，右侧朝上，吸去多余的海水。放置在解剖 镜下待注射。(4)注射位置为牙鲆右眼下侧组织，将显微注射针扎入皮下，深度为2_4mm，避开 眼球血管和神经。(5)注射50nL秋水仙素，迅速拔出针头。(6)迅速将注射的牙鲆仔鱼转移至新鲜海水中苏醒，饲养，并在当天晚上清除死亡 的个体。按照步骤(1)中描述的方法饲养注射后的仔鱼。(7)在19DAH再次用新配制的牙鲆仔鱼麻醉剂溶液麻醉17DAH注射过秋水仙素的 仔鱼，麻醉2至3分钟。(8)将麻醉的仔鱼依次排放在琼脂板上，右侧朝上，吸去多余的海水。放置在解剖 镜下待注射。(9)注射位置为牙鲆右眼下侧组织，将显微注射针扎入皮下，深度为2_4mm，避开 眼球血管和神经。(10)注射50nL秋水仙素，迅速拔出针头。(11)迅速将注射的牙鲆仔鱼转移至新鲜海水中苏醒，饲养，并在当天晚上清除死 亡的个体。按照步骤(1)中描述的方法饲养注射后的仔鱼。(12)在21DAH再次用新配制的牙鲆仔鱼麻醉剂溶液麻醉17DAH注射过秋水仙素并 在19DAH追加注射秋水仙素的仔鱼，麻醉2至3分钟。(13)将麻醉的仔鱼依次排放在琼脂板上，右侧朝上，吸去多余的海水。放置在解剖 镜下待注射。(14)注射位置为牙鲆右眼下侧组织，将显微注射针扎入皮下，深度为2_4mm，避开 眼球血管和神经。(15)注射50nL秋水仙素，迅速拔出针头。(16)迅速将注射的牙鲆仔鱼转移至新鲜海水中苏醒，饲养，并在当天晚上清除死 亡的个体。按照步骤(1)中描述的方法饲养注射后的仔鱼。通过观察可以发现当对照组已经变态完全时(如
图1所示)，注射秋水仙素的牙鲆 右眼并未移动(如图2所示)，但是其它变态事件照常进行，色素增多，冠状幼鳍退化，背鳍 向前延伸，体型变得侧扁，从浮游生活转变为底栖生活。实施例2显微注射秋水仙素抑制欧鳎左眼移动的方法，可按照以下步骤操作一、秋水仙素的配制用灭菌的0. 75%氯化钠溶液将秋水仙素稀释成5mg/ml的秋水仙素贮存液，配制 50 μ g/ml秋水仙素溶液。二、麻醉剂的配制用新鲜曝气的盐度32%。温度为18°C的海水配制0. lmg/mL 3_氨基苯甲酸乙酯甲 基磺酸盐(tricaine methanesulfonate, MS-222)溶液，临用前现配。
三、琼脂板的制备用蒸馏水配制2%琼脂糖溶液，微波炉加热溶化，向90mm培养皿中倒入15至20mL 琼脂溶液冷凝备用。四、注射秋水仙素欧鳎(Solea solea)仔鱼显微注射秋水仙素(1)欧鳎饲养于盐度32%。，温度为18°C的海水中，每日上午9点和下午4点投喂卤 虫无节幼体，分别于早上8点，下午3点和晚上8点吸污。(2)首次显微注射秋水仙素的时间在10DAH，将仔鱼转移至新配制的欧鳎仔鱼麻 醉剂溶液中麻醉2至3分钟。(3)将麻醉的仔鱼依次排放在琼脂板上，左侧朝上，吸去多余的海水。放置在解剖 镜下待注射。(4)注射位置为欧鳎左眼下侧组织，将显微注射针扎入皮下，深度为2_4mm，避开 眼球血管和神经。(5)注射50nL秋水仙素溶液，迅速拔出针头。(6)迅速将注射的欧鳎仔鱼转移至新鲜海水中苏醒，饲养，并在当天晚上清除死亡 的个体。按照步骤(1)中描述的方法饲养注射后的欧鳎仔鱼。(7)在13DAH将10DAH注射秋水仙素的欧鳎仔鱼转移至新配制的欧鳎仔鱼麻醉剂 溶液中麻醉2至3分钟。(8)将麻醉的仔鱼依次排放在琼脂板上，左侧朝上，吸去多余的海水，放置在解剖 镜下待注射。(9)注射位置为欧鳎左眼下侧组织，将显微注射针扎入皮下，深度为2_4mm，避开 眼球血管和神经。(10)注射50nL秋水仙素溶液，迅速拔出针头。(11)迅速将注射的欧鳎仔鱼转移至新鲜海水中苏醒，饲养，并在当天晚上清除死 亡的个体。按照步骤(1)中描述的方法饲养注射后的欧鳎仔鱼。当正常欧鳎已经完成变态时(如图3)，注射秋水仙素的仔鱼左眼仍然没有移动 (如图4)，但此时已转变为底栖生活，色素增多，且背鳍向前端延伸，形成一个缺口。实施例3显微注射秋水仙素抑制半滑舌鳎右眼移动的方法，可按照以下步骤操作一、秋水仙素的配制用灭菌的0. 75%氯化钠溶液将秋水仙素稀释成5mg/ml的秋水仙素贮存液，配制 50 μ g/ml秋水仙素溶液。二、麻醉剂的配制用新鲜曝气的盐度32%。温度为22°C的海水配制0. lmg/mL 3_氨基苯甲酸乙酯甲 基磺酸盐(tricaine methanesulfonate, MS-222)溶液，临用前现配。三、琼脂板的制备用蒸馏水配制2%琼脂糖溶液，微波炉加热溶化，向90mm培养皿中倒入15至20mL 琼脂溶液冷凝备用。四、注射秋水仙素
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)仔鱼显微注射秋水仙素(1)半滑舌鳎饲养于盐度32%。，温度为22°C的海水中，每日上午9点和下午4点投 喂卤虫无节幼体，分别于早上8点，下午3点和晚上8点吸污。(2)首次显微注射秋水仙素的时间在15DAH，将半滑舌鳎仔鱼转移至新配制的半 滑舌鳎麻醉剂中麻醉2至3分钟。(3)将麻醉的仔鱼依次排放在琼脂板上，右侧朝上，吸去多余的海水，放置在解剖 镜下待注射。(4)注射位置为半滑舌鳎右眼下侧组织，将显微注射针扎入皮下，深度为2_4mm， 避开眼球血管和神经。(5)注射50nL秋水仙素溶液，迅速拔出针头。(6)迅速将注射的半滑舌鳎仔鱼转移至新鲜海水中苏醒，饲养，并在当天晚上清除 死亡的个体。按照步骤(1)中描述的方法饲养注射后的半滑舌鳎仔鱼。(7)在20DAH将15DAH注射秋水仙素的半滑舌鳎转移至新鲜的半滑舌鳎麻醉剂溶 液中麻醉2至3分钟。(8)将麻醉的半滑舌鳎仔鱼依次排放在琼脂板上，右侧朝上，吸去多余的海水，放 置在解剖镜下待注射。(9)注射位置为右眼下侧组织，将显微注注射针扎入皮下，深度为2_4mm，避开眼 球血管和神经。(10)注射50nL秋水仙素溶液，迅速拔出针头。(11)立即将注射的半滑舌鳎仔鱼转移至新鲜海水中苏醒，饲养，并在当天晚上清 除死亡的个体。按照步骤(1)中描述的方法饲养注射后的半滑舌鳎仔鱼。注射秋水仙素后得到了眼睛不移动的半滑舌鳎(如图6)，其它变态事件并没有影 响，背鳍向前延伸并与头部组织愈合，黄色素和黑色素增多，转变为了底栖生活方式，对照 组如图5。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
权利要求
1.一种抑制比目鱼眼睛移动的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)注射药物的准备选取秋水仙素作为注射药物；(2)麻醉选用麻醉剂将比目鱼麻醉；(3)注射选取眼睛尚未移动的比目鱼，在比目鱼眼睛开始移动前2-4天注射，注射的 位置为眼睛下侧组织，针头穿透皮肤组织2-4mm，避开眼球血管和神经；在首次注射后2-5天追加注射。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述所述秋水仙素的注射浓 度为50 μ g/mL,每尾仔鱼注射剂量约为50nL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述麻醉剂(1)采用养殖比目鱼的海水配制麻醉剂；(2)麻醉剂3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐浓度为0.lmg/ml ；(3)麻醉时间为2至3分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述比目鱼为牙鲆Paralichthys olivaceus、欧鳎 Solea solea、半滑舌鳎 Cynoglossussemilaevis。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述牙鲆的注射时间和位置(1)牙鲆仔鱼右侧眼睛尚未移动，在比目鱼眼睛开始移动前2天注射；(2)注射的位置为右眼下侧，针头穿透皮肤组织2-4mm，避开眼球血管和神经；(3)在首次注射后2天追加注射，并于追加注射后2天再次追加注射。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述欧鳎的注射时间和位置(1)欧鳎仔鱼左侧眼睛尚未移动，在比目鱼眼睛开始移动前4天注射；(2)注射的位置为左眼下侧，针头穿透皮肤组织2-4mm，避开眼球血管和神经；(3)首次注射后3天追加注射。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述半滑舌鳎的注射时间和 位置(1)半滑舌鳎仔鱼右侧眼睛尚未移动，在比目鱼眼睛开始移动前3天注射；(2)注射的位置为右眼下侧，针头穿透皮肤组织2-4mm，避开眼球血管和神经；(3)首次注射后5天追加注射。
全文摘要
本发明公开了一种抑制比目鱼眼睛移动的方法，包括抑制药物秋水仙素的选择，显微注射的方法及技巧，注射牙鲆、欧鳎和半滑舌鳎的位置和时间。本发明能够将药物的作用限制在局部组织，达到较佳的作用效果。通过注射秋水仙素抑制了比目鱼眼睛的移动，而不影响其它变态事件的发生，可以为研究不对称发生的机制提供实验材料。
文档编号A01K61/00GK101990852SQ20101017936
公开日2011年3月30日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者徐冰, 柯中和, 盖军伟, 谢彩霞, 邢巨斌, 鲍宝龙, 龚小玲 申请人:上海海洋大学