专利名称：一种发酵蛋白饲料、制备方法及含有其的蛋鸡用蛋白饲料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵蛋白饲料、制备方法及含有其的蛋鸡用蛋白饲料，属于应用微生物技术领域。
背景技术：
豆粕、棉粕和花生粕都是畜禽最重要的植物性蛋白源，目前已成为畜牧养殖业使用非常普遍的优质蛋白源。但这些粕类中蛋白质的相对分子质量较大，不易消化吸收，而且还含有多种抗营养因子，如不良寡糖，抗原蛋白，棉酚和胰蛋白酶抑制因子等。这些抗营养因子对动物体内的某些消化酶起抑制作用或与营养物质络合成不易消化的成分，使饲料的消化率和动物的吸收率下降。因此，杂粕中抗营养因子的消除和饲料原料利用率的提高一直以来都是人们关注的焦点。枯草芽孢杆菌(Bacillus subitilis)属于农业部2006年公布的可以直接饲喂的微生物添加剂之一。此菌能迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并能代谢产蛋白酶、淀粉酶等多种消化酶，可以降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率；此外，食用含有枯草芽孢杆菌活菌的饲料可以促进动物生长， 提高动物免疫力及抗病力，由于菌体的繁殖和产生类抗生素物质，能抑制肠道内有害菌繁殖。保加利亚乳杆菌(LactcAacillus bulgaricus)是一种工业生产最常用的乳酸菌，它能调节人体肠道微生物的菌群平衡，在代谢过程中可以产生乳酸、乙酸等，抑制胃肠中的有害细菌的定殖。因此，枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌都被认为是益生菌制剂的理想生产菌株。本发明设计采用枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌对豆粕、棉粕和花生粕组成的混合蛋白饲料进行混菌固态发酵，以降解蛋白原料中大分子蛋白和降低抗营养因子的含量， 同时使得发酵产品中积累大量益生菌、还原糖，寡肽和乳酸等生物活性物质，以期得到一种有利于动物消化和吸收的发酵蛋白饲料。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供一种发酵蛋白饲料，以解决现有蛋白饲料的动物利用率低的缺陷。本发明解决其技术问题所采取的技术方案是—种发酵蛋白饲料，其特征在于，按重量百分比计，所述发酵蛋白饲料中粗蛋白含量为46-48 %，乳酸含量1. 8-2. 5 %，所述发酵蛋白饲料中还含有益生菌，所述益生菌为枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌，所述枯草芽孢杆菌的菌数为3. 0-3.5X108cfu/g，保加利亚乳杆菌的菌数为4. 0-4. 5X 108cfu/g。本发明的另一个目的还在于提供所述发酵蛋白饲料的制备方法，其特征在于，以豆粕、棉粕和花生粕的混合蛋白饲料为原料，采用枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌对所述混合蛋白饲料进行混菌固态发酵，包括以下步骤
(1)分别制备用于枯草芽孢杆菌扩增培养的肉汤培养基和用于保加利亚乳杆菌扩增培养的种子培养基；(2)菌种培养1)枯草芽孢杆菌的扩增培养从冰箱中取出冷冻甘油管保藏的枯草芽孢杆菌菌种，活化后，取ImL菌液接入装有50mL肉汤培养基的容器中，八层纱布封口，于37°C、ISOrpm 振荡培养12h ；2)保加利亚乳杆菌的扩增培养从冰箱中取出冷冻甘油管保藏的保加利亚乳杆菌菌种，活化后，取ImL菌液接入装有50mL种子培养基的容器中，八层纱布加牛皮纸封口， 于40°C静置培养12h;(3)制备混菌固态发酵培养基，分别称取豆粕、棉粕和花生粕，所述豆粕、棉粕、花生粕的重量比例为0.8 1 1 1 1.25，将称取的豆粕、棉粕和花生粕混合后，混合的蛋白饲料的含水量为50-60%，取200g置于IOOOml广口试剂瓶中，盖好瓶盖，于121°C灭菌 30min，作为混菌固态发酵的原料；(4)混菌固态发酵将培养成熟的枯草芽孢杆菌和发酵乳杆菌种子液接入所述混菌固态发酵培养基中，枯草芽孢杆菌的接种量为5ml/100g原料，保加利亚乳杆菌的接种量为15ml/100g原料，混勻，盖好瓶盖，37-40°C恒温培养48_7浊。本发明还提供一种蛋鸡用蛋白饲料，包括配合饲料，其特征在于，所述蛋鸡用蛋白饲料含有所述发酵蛋白饲料，其中，按重量百分比计，所述发酵蛋白饲料含量为5-20%。本发明所使用的枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌均购于工业微生物菌种保藏中心，所采用的豆粕、棉粕和花生粕由上海浦耀贸易有限公司提供，所采用的配合饲料由海安源耀饲料有限公司提供。本发明具有的有益效果是采用混菌固态发酵法处理蛋白饲料，能充分发挥各个菌株的特性，取长补短，从而达到复配增效的目的；此外，微生物发酵处理对饲料营养成分的影响与破坏较小，可以去除多种抗营养因子，同时积累有益的代谢产物。发酵后的蛋白饲料中几乎不含有抗营养因子，而是含有1.8-2. 5%乳酸、46-48%粗蛋白等营养物质以及菌数为3. 0-3. 5X108cfu/g的枯草芽孢杆菌和菌数为4. 0-4. 5X108cfu/g cfu/g的保加利亚乳杆菌，发酵蛋白饲料的营养价值得到了明显提高，从而有利于动物消化和吸收。按重量百分比计，将所述发酵蛋白饲料按添加量为5-20%添加到蛋鸡配合饲料中，得到所述蛋鸡用蛋白饲料并用于蛋鸡喂养实验，结果表明所述添加了发酵蛋白饲料的蛋鸡用蛋白饲料能降低饲料与产蛋的比例，节约成本。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。
图1为采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析测定本发明所述发酵蛋白饲料中蛋白质分子量大小分布的SDS-PAGE图谱。图2为采用DNS法和薄板层析法分析的发酵蛋白饲料中还原糖的含量随发酵时间的变化曲线图。图3为采用DNS法和薄板层析法分析的发酵蛋白饲料中寡糖的薄板层析图谱。图4为表示本发明所述发酵蛋白饲料中寡肽含量随时间的变化曲线图。
图5为表示包括不同含量的发酵蛋白饲料的蛋鸡用蛋白饲料对蛋鸡产蛋率随喂养时间变化的曲线图。图6为表示包括不同含量的发酵蛋白饲料的蛋鸡用蛋白饲料对总蛋重随喂养时间变化的曲线图。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。实施例11、分别制备用于枯草芽孢杆菌扩增培养的肉汤培养基和用于保加利亚乳杆菌扩增培养的种子培养基肉汤培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1L，pH5_7，121 °C灭菌 20min ；固态肉汤培养基牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，蒸馏水1L，pH5_7， 121°C 灭菌 20min ；种子培养基采用王照利等所报道的MRS培养基(参见王照利，昊万兴.李科友.魔芋精粉中甘露聚糖含量测定研究[J].食品科技，1998C3) 56.)；固态种子培养基在所述MRS培养基的配方中加入琼脂18g，121°C灭菌20min。2、菌种培养1)枯草芽孢杆菌的扩增培养从冰箱中取出冷冻甘油管保藏的枯草芽孢杆菌菌种，37°C活化:3min后，取ImL菌液接入装有50mL肉汤培养基的250mL三角瓶中，八层纱布封口，于37°C、180rpm振荡培养1 ；2)保加利亚乳杆菌的扩增培养从冰箱中取出冷冻甘油管保藏的保加利亚乳杆菌菌种，37°C活化5min后，取ImL菌液接入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，八层纱布加牛皮纸封口，于40°C静置培养12h ；3、制备混菌固态发酵培养基，分别称取豆粕、棉粕和花生粕，所述豆粕、棉粕、花生粕的重量比例为0.8 1 1 1 1.25，将称取的豆粕、棉粕和花生粕混合后得到混合蛋白饲料，所述混合的蛋白饲料含水量为50-60 %，取200g置于IOOOml广口试剂瓶中，盖好瓶盖，于121°C灭菌20min，作为混菌固态发酵的原料；4、混菌固态发酵将培养成熟的枯草芽孢杆菌和发酵乳杆菌种子液接入所述固态发酵培养基中，枯草芽孢杆菌的接种量为5ml/100g原料，保加利亚乳杆菌的接种量为 15ml/100g原料，混勻，盖好瓶盖，37-40°C恒温培养48_7池。得到所述发酵蛋白饲料。5、对发酵蛋白饲料进行检测及检测结果和结论(1)ρΗ值和乳酸的测定称取发酵蛋白饲料样品10g，加蒸馏水90ml，搅拌30min后，用预先校正过的pH计测定其PH值；然后将样品置于离心管中，3000rpm离心5min。取IOml上清液加入40ml蒸馏水后，用0. 02mol/L的标准NaOH溶液滴定，折算成乳酸的含量。检测结果如表1所示。表1发酵蛋白饲料的pH和乳酸时间(小时)pH乳酸(％)Oh6.020.128h6.120.5016h6.450.3524h5.121.1532h5.011.4840h4.861.8548h4.091.98从表1可看出，在发酵的前16h，pH值呈先逐步上升的趋势。可能是因为在发酵过程中，蛋白质被降解为氨、氨基酸和肽等碱性物质，使PH值逐步增加。发酵24h后，pH值开始下降，发酵结束后PH为4. 09，这主要是因为保加利亚乳杆菌的大量生长，在其代谢过程中可以产生乳酸、乙酸和丙酸等使基质的PH降低。另外，在发酵1 后，按重量百分比计， 乳酸含量逐渐上升，发酵结束后乳酸含量为1.98%，较发酵前提高了 16. 5倍。(2)活菌数(Cfu)的测定将固态发酵后的蛋白饲料样品用无菌水进行稀释至10_7后，分别吸取不同稀释度的菌液0. ImL进行平板培养计数法计数。其中枯草芽孢杆菌的计数培养基为固态肉汤培养基，涂布均勻后于37°C培养48h ；保加利亚乳杆菌的计数培养基为MRS培养基，采用倾注法计数，于40°C培养48h。检测结果如表2所示。表2发酵蛋白饲料的活菌数变化
培养时间
活菌类型-
Oh 8h 16h 24h 32h 40h 48h
KC(xl08) 0.005 1.2 3.0 2.9 3.1 3.2 3.1 LAB(xl08) 0.006 1.98 4.53 4.6 4.52 4.55 4.45KC :枯草芽孢杆菌；LAB 保加利亚乳杆菌(3)发酵蛋白饲料中蛋白质分子量大小分布测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)检测发酵蛋白饲料中蛋白质分子量大小
分布(所述聚丙烯酰胺凝胶电泳法参见沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京
高等教育出版社，1996.)。取发酵蛋白饲料1. 0g，加入20ml0. 03mol/L的Tris-HCl (pH =
8. 0)(包括0. 01mol/L的β -巯基乙醇)，在室温下浸提60min后(每IOmin搅拌一次)， IOOOOrpm下离心20分钟，取上清液40 μ 1，加入10 μ 1样品缓冲液，沸水浴3分钟后，进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰染色，脱色后拍照保存。得到的照片如
图1所示。如
图1所示，通过对比蛋白饲料的SDS-PAGE图谱豆粕、棉粕、花生粕、发酵前混合蛋白饲料、发酵后蛋白饲料，可以看出混菌固态发酵前混合蛋白饲料中蛋白分子量主要分布在12-66kDa之间，经过混菌固态发酵处理后，大分子蛋白质得到了几乎完全降解，生成小分子蛋白和多肽类；(4)还原糖和寡糖的测定还原糖的含量采用DNS法检测(所述DNS检测方法参见陆健.“蛋白质纯化技术及应用” [M].北京化学工业出版社，2005.)。寡糖的检测采用薄板层析分析准确称取发酵蛋白饲料样品5g于250ml三角瓶中，加入50ml 80%的乙醇溶液，70°C水浴浸提lh。取 2ml浸提液，IOOOOrpm离心lOmin，取上清液在硅胶板上点样，点样量为5 μ 1，点样干燥后在展开液(正丙醇乙酸水=1 1 0. 1，体积比)中展开，展开至离硅胶板前沿2cm处。 自然晾干后，喷淋显色液(显色液组成为lmL 1-萘酚+IOmL磷酸+989ml乙醇)至整个平板湿透，立即在140°C下烘5min显色后拍照保存。结果如图2和图3所示。图2为发酵蛋白饲料的还原糖的含量随发酵时间的变化曲线图，图2中显示，在发酵的前1 还原糖含量急剧上升，但第1 过后还原糖含量便开始下降，32h后还原糖含量趋于稳定。这是因为菌体在前1 大量生长，将发酵蛋白饲料中寡糖类物质分解为单糖，使还原糖含量开始上升；之后，由于菌体的大量生长开始利用游离的还原糖，菌体细胞的合成速度大于酶类对寡糖的降解速度，则还原糖含量又逐渐降低，发酵40h后，仍有部分的残糖未被利用，使得还原糖的含量趋于稳定。图3为发酵蛋白饲料的寡糖薄板层析(TLC)图谱，通过对比图3的蛋白饲料的TLC 图谱豆粕、棉粕、花生粕、发酵前的混合蛋白饲料、发酵后蛋白饲料，可以看出发酵前混合蛋白饲料中的寡糖有水苏糖、棉籽糖和蔗糖，经过混菌固态发酵后，蛋白饲料中的水苏糖、 棉籽糖和蔗糖几乎完全降解，生成了部分的单糖，说明以上两菌株在发酵蛋白饲料的过程中能有效地降解抗营养因子。发酵结束后，仍有少部分的单糖未被利用，与发酵后期还原糖的变化一致。(5)发酵蛋白饲料中粗蛋白的测定采用凯氏定氮法(NX6. 25)测定蛋白饲料发酵前后粗蛋白的含量(检测方法参见 《饲料中粗蛋白测定方法》.GB/T 6432-1994)。结果如表3所示，从表3可以看出蛋白饲料经过混菌固态发酵处理后，粗蛋白质含量比发酵前增加了 3. 4%，说明枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌能在蛋白饲料基质中较好生长，对蛋白饲料的同化能力较强。表3发酵蛋白饲料的粗蛋白变化
状态水分含量(％)粗蛋白含量(％)Oh8.9643.148h9.0146.5(6)发酵蛋白饲料中寡肽的测定称取样品0. 5g于IOml离心管中，加入15%的三氯乙酸Snl，振荡20min，IOOOOrpm 离心15min，取上清，按粗蛋白测定方法进行测定和计算，结果即为发酵蛋白样品中寡肽的含量。
图4为发酵蛋白饲料中寡肽的含量随发酵时间的变化曲线图，图4中显示，混合蛋白饲料发酵16h，寡肽含量下降，这是由于发酵前期菌体生长需要原料中的氮素作为氮源； 此后在发酵过程中，随着枯草芽孢杆菌的大量生长，其分泌的蛋白酶量增多，分解大分子蛋白质，使得寡肽的含量逐步增加。40h后寡肽含量几乎到最大值为2.6%，发酵结束后寡肽含量为2. 5%，是发酵前的2. 3倍。大分子蛋白的降解和寡肽的生成说明在发酵过程中，枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌产生的酶类能有效地将原料中大分子蛋白水解成小分子蛋白、多肽或氨基酸，有效提高了蛋白饲料的利用率。(7)结论采用混菌固态发酵法处理蛋白饲料，能充分发挥各个菌株的特性，取长补短，从而达到复配增效的目的；此外，微生物发酵处理对饲料营养成分的影响与破坏较小，可以去除多种抗营养因子，同时积累有益的代谢产物。通过对发酵后的蛋白饲料与发酵前的蛋白饲料进行比较，结果表明发酵使蛋白饲料的大分子蛋白几乎完全被降解，生成小分子蛋白或多肽类物质，粗蛋白含量从43. 提高到46. 5% ；蛋白饲料中的抗营养因子(水苏糖和棉籽糖)经微生物发酵处理后，几乎完全降解，同时产生了一定量的还原糖；发酵后样品中枯草芽孢杆菌数为3. lX108cfu/g，保加利亚乳杆菌数为4. 45X 108cfu/g ；发酵结束后蛋白饲料中乳酸的含量为1.89%，较发酵前提高了 16.5倍。发酵后的蛋白原料中含有乳酸、还原糖和寡肽等营养物质和一定量的益生菌，蛋白原料的营养价值得到了明显提高。实施例2本实施例提供一种蛋鸡用蛋白饲料，包括配合饲料和实施例1所述发酵蛋白饲料，按重量百分比计，所述蛋鸡用蛋白饲料中发酵蛋白饲料含量为5-20%。所述配合饲料由海安源耀饲料有限公司提供，其组成如表4所示表4蛋鸡的基础日粮配方及营养水平
权利要求
1.一种发酵蛋白饲料，其特征在于，按重量百分比计，所述发酵蛋白饲料中粗蛋白含量为46-48%，乳酸含量1.8-2.5%，所述发酵蛋白饲料中还含有枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌，所述枯草芽孢杆菌的菌数为3. 0-3.5X108cfu/g，保加利亚乳杆菌的菌数为 4. 0-4. 5X108cfu/g。
2.一种制备如权利要求1所述发酵蛋白饲料的方法，其特征在于，以豆粕、棉粕和花生粕的混合蛋白饲料为原料，采用枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌对所述混合蛋白饲料进行混菌固态发酵，包括以下步骤(1)分别制备用于枯草芽孢杆菌扩增培养的肉汤培养基和用于保加利亚乳杆菌扩增培养的种子培养基；(2)菌种培养1)枯草芽孢杆菌的扩增培养将枯草芽孢杆菌菌种活化，接入步骤(1)所得的肉汤培养基中培养12h ；2)保加利亚乳杆菌的扩增培养将保加利亚乳杆菌菌种活化，接入步骤(1)所得的种子培养基中培养12h ；(3)制备固态发酵培养基，其中所述豆粕、棉粕、花生粕的重量比例为0.8 1 1 1 1. 25 ；(4)固态发酵将培养成熟的枯草芽孢杆菌和发酵乳杆菌种子液接入步骤(3)所制备的所述固态发酵培养基中，混勻，37-40°C恒温培养48-7池。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的接种量为5ml/100g 原料，保加利亚乳杆菌的接种量为15ml/100g原料。
4.一种含有如权利要求1所述发酵蛋白饲料的蛋鸡用蛋白饲料，包括配合饲料，其特征在于，按重量百分比计，所述蛋鸡用蛋白饲料含有的所述发酵蛋白饲料的含量范围是 5-20%。
全文摘要
本发明提供一种发酵蛋白饲料，按重量百分比计，所述发酵蛋白饲料中粗蛋白含量为46-48％，乳酸含量1.8-2.5％，还含有益生菌枯草芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌。本发明还提供制备所述发酵蛋白饲料的方法以及一种含有5-20％所述发酵蛋白饲料的蛋鸡用蛋白饲料。本发明采用混菌固态发酵法处理蛋白饲料，能充分发挥各个菌株的特性，达到复配增效的目的；发酵蛋白饲料中几乎不含有抗营养因子，而是含有乳酸、粗蛋白等营养物质以及枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌，营养价值得到了明显提高，有利于动物消化和吸收。所述蛋鸡用蛋白饲料用于蛋鸡喂养实验，能降低饲料与产蛋的比例，节约成本。
文档编号A23K1/00GK102246884SQ20101017936
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者季春源, 方华, 李旺军 申请人:上海源耀生物科技有限公司