专利名称：平邑甜茶叶盘再生不定芽的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的培养方法，特别地，是一种平邑甜茶叶盘再生不定芽的培 养方法。
背景技术：
平邑舌甘荼[Malus hupehensis (Pamp. )Rehd. var. pingyiensis Jiang]是苹果属 湖北海棠种的一个变种，是典型的具有兼性无融合生殖性状的植物，也是我国特有苹果砧 木资源；其树性乔化，耐荫、抗涝能力强，嫁接苹果的亲和力强，是目前苹果生产中已被广 泛应用的砧木之一。不定芽再生是基因工程的基础，根癌农杆菌介导的叶盘法是以植物的 再生为基础的，只有很高的再生率才容易获得转基因材料；不定芽再生也是组织培养快速 繁殖的方法。平邑甜茶叶盘再生不定芽的研究不多张军科等[张军科、沈向、曹庆芹、李 英、李嘉瑞，平邑甜茶叶盘组培再生研究初报，西北农业大学学报，2000，28 (4) 94-97]以 平邑甜茶无菌苗的叶片为材料，将叶片切去叶缘，沿主脉横切成约0. 5cm2的小块，培养条 件为(25士 1) °C，光周期为16小时光照/8小时黑暗，光照强度30i!mOl m_2 s—1，结果发 现平邑甜茶叶盘无再生不定芽；韩小娇等[韩小娇、杨洪强、由淑贞、段凯旋、张鑫荣、赵海 洲，平邑甜茶叶片不定芽再生及NO的效应，园艺学报，2008，35(3) :419_422]选取继代25d 左右的平邑甜茶组织培养苗(组培苗)顶端1 3片生长一致的展开叶为材料，去叶缘及 叶尖1/3，正面向上接种，MS基本培养基[Murashige and Skoog medium，1962年由穆拉希 吉克(Murashige, T.)和斯科克(Skoog, F.)设计]添加蔗糖30g L—1，琼脂粉6. 5g L-1， 硝普钠6. 0g L-1和玉米素0. 2g L-1，pH5. 8 6. 2，培养温度23 25°C，光合有效辐射 50 u mol m_2 s-1，光照16h cf1叶片不定芽再生频率可以达到67. 8%，添加硝普钠30 u M 时，再生频率为78. 6%;魏国芹等[魏国芹、梁美霞、李鼎立、孙海峰、戴洪义，平邑甜茶与M7 离体叶片不定芽再生的研究，青岛农业大学学报(自然科学版)，2009，26 (2) :103 108] 以继代20d的组培苗顶部2 4片幼叶为材料，用手术刀沿垂直于叶脉方向切割，间距约 1mm,不伤及叶缘保持叶片的完整性，远轴面接触培养基(简称正放)，将材料接种于MS培 养基 +6-苄基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6-BA) 2. Omg 吲哚丁酸(indole-3-butyric acid, IBA)0. Olmg L-1，附加蔗糖30g L—1，琼脂粉6. 5g L-1，pH5. 8的不定芽诱导培养基。 培养温度为26°C，光照强度为20-25 y mol，！!!—2 s—1，光照时间为16h/d，平邑甜茶叶片不定 芽再生频率最高可以达到93.3%。
发明内容
本发明的目的是提供一种使平邑甜茶叶盘不定芽再生频率得以进一步提高，甚至 可达100%的培养方法，为平邑甜茶基因导入和快速繁殖奠定基础。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种平邑甜茶叶盘再生不定芽的培养方法，其步骤如下A.将平邑甜茶组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养苗的伸展叶片，剪成面积0. lcm2的叶盘，接种在再生培养基上；B.接种后，先在温度(25士 1)°C条件下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光 照/8小时黑暗、光照强度为30 u mol m_2 s—1的条件下再培养30天，可再生出不定芽；C.将不定芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、 光照强度为30 u mol m_2 s—1的条件下培养40天，即可完成生根；所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30g L—1蔗糖、6. 5g L—1琼脂粉、 0. 3mg L_16-节基腺曙吟(6-benzyladenine)禾口 0. lmg 蔡乙酸(naphthalene-acetic acid)，pH5. 6的培养基；所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30g L—1蔗糖、6. 5g L—1琼脂粉、 2. Omg.I^N-苯基-N，-1，2，3-噻二唑-5-脲(1,2, 3-thiadiazol-5-yl-N-phenylurea)和 0. 2mg I71 吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)，pH5. 6 的培养基；所述生根培养基为在MS基本培养基中附加30g L—1蔗糖、6. 5g L—1琼脂粉和
0.4mg L-1吲哚丁酸，pH5. 6的培养基。如上所述的培养方法，其中，所述平邑甜茶的组织培养苗(组培苗)是按以下方法 得到的初春采平邑甜茶一年生枝条，水培养10天左右，取枝条上饱满的芽，流水冲洗3小 时，用0.1%的升汞(HgCl2)处理6分钟，无菌水冲洗6次，用无菌吸水纸吸干残留水分，将 芽接种到初代培养基上；接种10天时，饱满的芽都开始萌发，40天时长成约4cm左右的组 培苗，以后每月继代一次；所述初代培养基为在MS基本培养基中附加30g L—1蔗糖、6. 5g L—1琼脂粉、
1.Omg ^6-苄基腺嘌呤和0. 2mg L-1吲哚丁酸，pH5. 6的培养基。一种用于如上所述的平邑甜茶叶盘再生不定芽的培养方法中的再生培养基，它是 在MS基本培养基中附加30g .L—1蔗糖、6. 5g .L—1琼脂粉、2. Omg .L,-苯基-N，-1,2, 3~噻 二唑-5-脲和0. 2mg L-1吲哚丁酸，pH5. 6的培养基。所述MS基本培养基的配方如下
成 本发明的有益效果为使用本发明的培养技术，可以使苹果砧木平邑甜茶的叶盘 不定芽再生频率达到100%，非常有利于进行平邑甜茶的转基因研究和快速繁殖。
本发明的实验过程中，同一批次实验采用5个皿，每个皿放置25-35个材料，实验 重复4次，共计样品总量为605个。实验结果显示所有叶盘均有不定芽产生，不定芽再生 频率为100%。此后应用本发明方法进行不定芽再生培养操作，始终可以保持100%的再生频率。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为准备再生的平邑甜茶叶盘的照片。图2为采用本发明培养方法培养的平邑甜茶叶盘不定芽再生情况的照片。图3为调整暗培养处理时间的各实验组中，平邑甜茶叶盘不定芽再生情况的照 片，图3a、图3b、图3c和图3d分别示暗培养处理时间为0天、7天、14天和21天的不定芽 再生情况。图4为调整再生培养基成分的各实验组中，平邑甜茶叶盘不定芽再生情况的照 片，图4a和图4b分别示培养基中使用硫酸铵和硝酸铵的不定芽再生情况。
具体实施例方式实施例1按以下步骤操作得到平邑甜茶的组织培养苗(组培苗)初春采平邑甜茶一年生 枝条，水培养10天左右，取枝条上饱满的芽，流水冲洗3小时，用0. 的升汞(HgCl2)处理 6分钟，无菌水冲洗6次，用无菌吸水纸吸干残留水分，将芽接种到初代培养基上。该初代培 养基为在MS基本培养基中附加30g L-1蔗糖、6. 5g L-1琼脂粉、1. Omg L、-苄基腺嘌呤 和0. 2mg L—1吲哚丁酸，pH5. 6的培养基。在接种后的第二天开始有部分材料开始褐化，一 旦发现有褐化的材料，马上换新的培养基，直到褐化消除。接种10天时，饱满的芽都开始萌 发，40天时长成约4cm左右的组培苗，以后每月继代一次。平邑甜茶组培苗的继代培养基为在MS基本培养基中附加30g化―1蔗糖、6. 5g -L"1 琼脂粉、0. 3mg L^B-苄基腺嘌呤和0. lmg L—1萘乙酸，pH5. 6的培养基。将平邑甜茶的组 培苗在该继代培养基上培养生长35天，即可切取叶盘进行不定芽再生的步骤。在超净工作台上取组培苗的伸展叶片，用剪刀剪成约0. lcm2的叶盘，接种在再生 培养基上。所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30g 厂1蔗糖、6. 5g r1琼脂粉、 2. Omg L,-苯基-N，-1,2, 3-噻二唑-5-脲和0. 2mg L-1吲哚丁酸，pH5. 6的培养基。将 叶盘接种后，先在温度(25士 1)°C的条件下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8 小时黑暗、光照强度为30i!mOl -m-2.^1的条件下再培养约30天，即可再生出不定芽，其中 示例培养皿的照片如图2所示。同一批次实验采用5个皿，每个皿放置25-35个材料，实验 共重复4次。实验结果如下表显示所有叶盘均有不定芽产生。 实验样品总量为605个，不定芽再生频率为100% ；并且在此后，应用此法进行不 定芽再生培养操作时，始终可以保持100%的再生频率。将不定芽切下，接种在生根培养基上。所述生根培养基为在MS基本培养基中附 加30g L-1蔗糖、6. 5g L-1琼脂粉和0. 4mg L-1吲哚丁酸，pH5. 6的培养基，置于光周期为 16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30 u mol m_2 s—1的条件下，40天即可以完成生根。实施例2保持其他条件不变，对暗培养处理时间进行调整，以筛选最佳暗培养处理时间。取如实施例1中所述的继代平邑甜茶组培苗，切取叶盘并接种在再生培养基上。 将叶盘分为四个实验组(实验组1-4)，接种后分别在温度(25士 1)°C的条件下暗培养处理 0天、7天、14天和21天，其他处理均与实施例1相同，观察各组叶盘的不定芽再生情况。实验结果如下表所示，其中示例培养皿的照片如图3所示，图3a、图3b、图3c和图 3d分别示实验组1-4的不定芽再生结果。
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由此可见，暗培养处理时间最优为14天。实施例3对再生培养基的配方进行调整，用B5培养基[甘博格(Gamborg)等于1968年设 计]中的成分硫酸铵(添加量0. UAg.L-1)替换MS基本培养基中的硝酸铵，分别作为实验 组1和2，保持培养基其他配方及各实验条件和操作不变，进行叶盘不定芽再生培养。实验结果如下表所示，实验组1和2的平邑甜茶叶盘不定芽再生频率分别为11% 和100%。示例培养皿的实验结果如图4所示，图4a为实验组1，图4b为实验组2。
由此可见，再生培养基中采用MS基本培养基配方中的硝酸铵要显著优于B5培养 基中的硫酸铵。
权利要求
一种平邑甜茶叶盘再生不定芽的培养方法，其特征在于，步骤如下A.将平邑甜茶组织培养苗在继代培养基上培养35天，之后在无菌条件下取组织培养苗的伸展叶片，剪成面积0.1cm2的叶盘，接种在再生培养基上；B.接种后，先在温度(25±1)℃条件下暗培养14天，然后置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下再培养30天，可再生出不定芽；C.将不定芽切下，接种在生根培养基上，置于光周期为16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下培养40天，即可完成生根；所述继代培养基为在MS基本培养基中附加30g·L-1蔗糖、6.5g·L-1琼脂粉、0.3mg·L-16-苄基腺嘌呤和0.1mg·L-1萘乙酸，pH5.6的培养基；所述再生培养基为在MS基本培养基中附加30g·L-1蔗糖、6.5g·L-1琼脂粉、2.0mg·L-1N-苯基-N’-1，2，3-噻二唑-5-脲和0.2mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基；所述生根培养基为在MS基本培养基中附加30g·L-1蔗糖、6.5g·L-1琼脂粉和0.4mg·L-1吲哚丁酸，pH5.6的培养基。
2.一种用于权利要求1所述的平邑甜茶叶盘再生不定芽的培养方法中的再生培养基， 其特征在于，它是在MS基本培养基中附加30g · Γ1蔗糖、6. 5g · Γ1琼脂粉、2. Omg · L^1N-苯 基-N，-1,2, 3-噻二唑-5-脲和0. 2mg · L-1吲哚丁酸，ρΗ5· 6的培养基。
全文摘要
本发明公开了一种平邑甜茶叶盘再生不定芽的培养方法，其是将平邑甜茶组培苗先在继代培养基上培养35天，继代培养后取面积0.1cm2的叶盘，接种在再生培养基上；接种后在温度(25±1)℃下暗培养14天，然后置于光周期16小时光照/8小时黑暗、光照强度为30μmol·m-2·s-1的条件下再培养30天，可再生出不定芽。本发明还公开了该培养方法中使用的再生培养基。使用本发明的培养技术，可以使苹果砧木平邑甜茶的叶盘不定芽再生频率达到100％，非常有利于进行平邑甜茶的转基因研究和快速繁殖。
文档编号A01H4/00GK101849508SQ201010210510
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者张强, 王媛花, 金万梅, 陈梅香 申请人:北京市农林科学院