专利名称：苜蓿花药悬浮培养方法
技术领域：
本发明涉及花药悬浮培养技术，具体涉及一种苜蓿花药悬浮培养方法。
背景技术：
名称为《用于培育肉苁蓉愈伤组织的悬浮细胞培养系的构建方法》的中国专利 申请(申请号200310113090)公开了 一种用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系 的构建方法，为将固体培养基上生长的由肉苁蓉种子诱导得到的愈伤组织转移到添加 0. 5-10mg/L的2，4-D的B5固体培养基上进行继代培养形成的浅黄色，半透明，松软易碎的 愈伤组织，再转接到相同组分和含量的液体培养基中，控制适当的培养条件并进行多次继 代培养，使得到本发明稳定的用于培育肉苁蓉愈伤组织的细胞悬浮培养系，该细胞悬浮培 养系生长良好，次级代谢产物含量高，可以达到肉苁蓉愈伤组织的工业化规模培育生产的 目的。在上述方法中，肉苁蓉(Cistanche deserticola Ma.)属于列当科多年生寄生草 本植物，而苜蓿为豆科多年生草本植物，两者在遗传、性状方面有一定差距，并且以苜蓿Fl 代花药为愈伤组织的诱导材料对外界的培养条件更为敏感，肉苁蓉愈伤组织的培养方法显 然不能用于苜蓿属植物悬浮培养，培养体系需要重新建立。细胞悬浮培养分散性好、细胞或细胞团大小均勻，生长迅速，重复性好。本实验对 苜蓿采用花药悬浮培养，明确苜蓿花药悬浮培养条件，建立体系为苜蓿体细胞杂交提供优 良的培养条件。
发明内容
为了解决苜蓿属植物悬浮培养技术的空白，本发明提供了一种苜蓿花药悬浮培养 方法。本发明所说的苜蓿花药悬浮培养方法，包括以下步骤a.取苜蓿花蕾将其放入冰箱内4°C低温处理24h，然后取其花药接种在愈伤组 织诱导培养基上，诱导愈伤；所说的愈伤组织液体培养基为NB培养基，培养基中含2， 4-DO. 3mg/L、NAA0. 3mg/L、蔗糖 2-3% ；b.愈伤组织形成后，选取鲜重l_2g继代5次以后、将第6次继代20d左右的淡黄 色或乳白色、生长快、结构疏松颗粒状胚性愈伤组织置于含有NB、Ms液体培养基中(基本 成分同诱导培养基，液体培养基配制过程不加琼脂)，控温摇床上遮光下培养，摇床转速为 110-120rpm，培养温度25士 1°C。控制悬浮培养条件并且继代培养。花药悬浮培养是选取经固体培养基诱导、最后一次继代20d左右的淡黄色或乳白 色生长快，结构疏松颗粒状苜蓿花药胚性愈伤组织，置于NB、MS液体培养基(2，4-DO. 3mg/ L+NAAO. 3mg/L)中，振荡培养24h后用100目尼龙网过滤、离心，将所得的单细胞于液体培 养基培养。控制培养条件，多次继代获得苜蓿花药稳定悬浮细胞系。该悬浮细胞系生长良 好，可广泛应用于苜蓿细胞形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，为基因工程在植物细胞水平操作提供理想的材料和途径。本发明通过一系列苜蓿花药悬浮培养的实验，探索了苜蓿悬浮细胞系建立的基本 条件，优化了苜蓿悬浮细胞系建立的培养基组合。通过本发明的方法，以苜蓿花药培养诱导 愈伤组织，建立苜蓿悬浮培养体系，从而快速高效获得具有亲本全套遗传基因的单倍体植 株，为通过细胞悬浮培养建立苜蓿DH群体提供技术支持。同时细胞悬浮体系建立后有利于 提高苜蓿产品的质量，控制次级代谢产物含量和工业化规模培育生产等目的。
图1是苜蓿悬浮细胞系培养物生长曲线，图2是起始密度对悬浮细胞生长的影响，图3是2. 4-D浓度对悬浮细胞生长的影响，图4是蔗糖质量浓度对悬浮细胞生长的影响，图5是苜蓿悬浮培养液中糖浓度的变化规律。
具体实施例方式1.试验目标本试验从不同来源苜蓿种质中筛选出具有多叶性状和株高性状的苜蓿单株， 移栽至种质资源圃进行杂交，播种F1代，取其花药通过花药培养的方式，建立苜蓿悬浮 培养体系，为苜蓿快繁体系的建立提供理论依据。本试验培养所用花药来自选系多叶 0501 X Sanditi 组合。试验品种为自选培育品系。该品系通过以下方法获得1. 2005年从澳大利亚品系PL34HQ田间选择多叶率较高的苜蓿品系，命名为 0501 (2005年田间移栽，编号为01)，同时选择株高性状优良的Sanditi品系，确定作为目标 性状。2. 2007年5-6月于苜蓿初花期以0501为母本，Sanditi为父本进行人工授粉杂
交，套袋。3. 2007 年 7 月收种。通过以上方法获得的杂交Fl品系即为本试验中采用的材料。因本研究中采用的原始材料为已公开品系，故以上方法也可适用于已公布品系， 公众也可依此方法获得相关材料。2.试验内容2. 1悬浮细胞系生长特性的测定各取6瓶第四次继代后4d的稳定悬浮细胞，倒入无菌的250ml三角瓶，分别混合 均勻，静置2min后，按照继代的方法，用吸管吸取密实体积约Iml的悬浮细胞至150ml的三 角瓶中，加入30ml液体培养基，每个品种做18瓶(共做54瓶)。每2d取2瓶进行密实细 胞体积(PCV)、鲜重、干重测定，重复三次取平均值。2. 1. 1密实细胞体积(PCV)测定培养一定时间的悬浮细胞系，取其充分摇勻的悬 浮培养物10ml，放入刻度离心管中，IOOOrpm下离心5min，读取密实细胞体积。2. 1. 2鲜重的测定将悬浮培养物倒在已知重量的湿尼龙网(100目)上，用去离子水洗去培养基。真空抽滤除去细胞上沾着的多余水分，然后称重。2. 1. 3干重的测定悬浮细胞经干尼龙网(100目)过滤，烘干(60°C，IOh)后称重。分别以悬浮细胞的PCV (ml)、鲜重(g)、干重(g)生长量为纵坐标，以悬浮培养时间 (d)横坐标作苜蓿悬浮细胞系培养物生长曲线，如图1。2. 2悬浮细胞生长的影响因素2. 2. 1不同培养密度对苜蓿悬浮细胞生长的影响(从稳定悬浮细胞系中分别吸取 密实体积为 0. Iml, 0. 5ml, 1. 0ml, 2. 0ml, 3. 0ml, 4. Oml 进行培养)从初始试验材料中分别吸取以上浓度的悬浮培养物，6d继代一次，在第三次继代 后的第6d分别测定PCV，鲜重、干重的增殖数量，重复三次取平均值。以起始接种PCV (ml)量为横坐标，以悬浮细胞的PCV (ml)、鲜重(g)、干重(g)增殖 倍数为纵坐标作起始密度对苜蓿悬浮细胞生长的影响曲线图，如图2。2. 2. 2生长调节剂对悬浮细胞生长的影响(2，4-D浓度0. 3mg/L, 0. 5mg/L, lmg/L, 2mg/L,3mg/L,4mg/L)将稳定悬浮系培养物接种到附加不同2，4-D浓度的液体培养基中培养，继代6d后 测定PCV增殖情况。重复三次取平均值。初始接种量均为200mg/瓶。以2，4-D浓度(mg/L)为横坐标，以PCV增殖倍数为纵坐标作2，4_D浓度对悬浮细 胞生长的影响图，如图3。2. 2. 3蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响(蔗糖浓度分别为10g，15g，20g, 25g，30g, 35g)2. 2. 3. 1采用不同浓度蔗糖浓度(分别为10g，15g，20g，25g，30g，35g)培养基进行 细胞悬浮培养，并对继代3次达到稳定状态的悬浮细胞系进行检测，每6d继代一次。以糖浓度(g/L)为横坐标，以同一时期悬浮细胞鲜重(g)为纵坐标作糖的质量浓 度对苜蓿悬浮细胞生长的影响曲线，如图4。2. 2. 3. 2苯酚-浓硫酸法测定培养液中的残糖浓度(1)标准曲线的绘制精确称取50g糖溶于比蒸馏水中，吸取01^、21^、41^、61^、81^、1011^溶液于IOOmL 容量瓶中定容，其浓度梯度分别为Og · L-1UOg · DOg · L-1JOg · Γ1、* · L-1JOg · L-1。 取上述标准液各lmL，W ImL 5%酚水溶液(5%酚水溶液精确称取5g苯酚溶于IOOmL蒸馏 水定容)，混勻后加5mLH2S04(98% )。放置20min后，在487nm处，以第一管溶液作为空白， 测得不同浓度下吸光度值，以吸光度值为横坐标，糖浓度为纵坐标作图，如图5，绘制标准曲 线，求回归方程。(2)培养液中残糖浓度的定量分析吸取样品液ImL按上述标准曲线绘制方法处理样品液，以蒸馏水为空白参比，测 定样品液吸光度。测得吸光度值代入回归方程式求解样液中残糖浓度。3.试验方案本试验供试材料于2008. 09. 01在甘肃农业大学草业学院在25°C下经培养皿发 芽，于2008. 09. 06移栽至花盆培养。本试验共计三个处理，每处理设三个重复，每重复预设 10个随机区组。3. 1试验器材
供试苜蓿种子各数粒，培养皿，滤纸，蒸馏水，NB (N6大量元素+B5微量元素和有机 成分)。生长素有2，4-0、離々，细胞分裂素有1(1\6-84，80 120目尼龙网。培养基的设计本试验拟以NB为花药愈伤组织的诱导培养基，以NB、MS液体培养基进行苜蓿胚性 细胞悬浮培养，在不同阶段加入不同浓度梯度的激素培养。3. 2细胞悬浮培养体系的建立3. 2. 1花药愈伤组织的诱导取试验苜蓿品种的花蕾并将其放入4°C冰箱内低温处理24h，然后接种在愈伤组 织诱导培养基上，附加不同浓度组合的2，4-D、NAA、KT、6-BA等激素。蔗糖浓度为6%，琼脂 为0. 7%，PH值为5. 6 6. 1。接种后将培养皿放入25°C的暗培养箱中暗培养15d后转入 温度为25°C、光强ΙΟΟΟΙχ、光照时间16h/d、湿度40%的培养箱内培养，20d后观察愈伤组织 诱导情况，并注意愈伤组织的时间和状态。3. 2. 2继代培养与筛选(增殖)应用NB培养基，附加不同浓度组合的2，4_D、KT、6_BA等激素，将所诱导的愈伤 组织进行继代。每次继代挑选颜色鲜绿或黄绿色、生长迅速的愈伤组织予以继代。前两次 继代周期为25d，然后选择颗粒较细、色泽淡黄、生长迅速的愈伤组织，加快继代频率(1次 /20d)。培养条件同上。3. 2. 3胚性细胞悬浮培养愈伤组织形成后，选取鲜重l_2g继代5次以后、最后一次继代20d左右的淡黄 色或乳白色生长快，结构疏松颗粒状胚性愈伤组织，置于盛有30ml NB、MS液体培养基 的IOOml三角瓶中，用镊子将愈伤组织轻轻夹碎，然后置于摇床上振荡培养，摇床转速为 110 120rpm，24h后用100目尼龙网过滤，除去愈伤组织碎片及大的细胞团，再经IOOOrpm 离心2min，除去上面的碎渣，将所得的单细胞放入加有30ml液体培养基的三角瓶中，制成 细胞悬浮液，置于摇床上在散射光下培养，摇床转速为110 120rpm，培养温度25 士 1 °C。前 几次继代时，待培养物静置2min后，用吸管吸出2/3左右上清液，补充加入新鲜液体培养基 至30ml。以后每次继代，均用吸管吸取密实体积(PCV)约lml(鲜重约2g)的悬浮细胞至 IOOml的三角瓶中，加入液体培养基至30ml，根据细胞的生长速度，每5 8d继代一次。5.实验数据5. 1苜蓿悬浮细胞系生长特性的测定结果如表1和图1表1.(初始接种量为1ml，约为2g)
权利要求
一种苜蓿花药悬浮培养方法，包括以下步骤a.取苜蓿花蕾放入冰箱内4℃低温处理24h，然后取其花药接种在愈伤组织诱导培养基上，诱导愈伤；所说的愈伤组织液体培养基为NB培养基，培养基中含2，4 D0.3mg/L、NAA0.3mg/L、蔗糖2 3%；b.愈伤组织形成后，选取鲜重1 2g继代5次以后，将第6次继代20d左右的淡黄色或乳白色、生长快、结构疏松颗粒状胚性愈伤组织置于含有NB 、Ms的液体培养基中，控温摇床上遮光下培养，摇床转速为110—120rpm，培养温度25士1℃；控制悬浮培养条件并且继代培养。
全文摘要
本发明涉及一种苜蓿花药悬浮培养方法，该方法具体是取苜蓿花蕾放入冰箱内4℃低温处理24h，然后取其花药接种在愈伤组织诱导培养基上，诱导愈伤；愈伤组织形成后，选取鲜重1-2g继代5次以后，将第6次继代20d左右的淡黄色或乳白色、生长快、结构疏松颗粒状胚性愈伤组织置于含有NB、Ms的液体培养基中，控温摇床上遮光下培养，控制悬浮培养条件并且继代培养。本发明以苜蓿花药培养诱导愈伤组织，建立苜蓿悬浮培养体系，从而快速高效获得具有亲本全套遗传基因的单倍体植株，为通过细胞悬浮培养建立苜蓿DH群体提供技术支持。同时细胞悬浮体系建立后有利于提高苜蓿产品的质量，控制次级代谢产物含量和工业化规模培育生产等目的。
文档编号A01H4/00GK101946710SQ20101026734
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者姚喜红, 耿小丽, 魏臻武 申请人:扬州大学