专利名称：紫花苜蓿花青素还原酶基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种紫花苜蓿花青素还原酶相关基因，还涉及由该基因编码的蛋白， 以及含有所述紫花苜蓿花青素还原酶基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿花青素还原酶基因及其编码的蛋白和含有该基因的表达载体及细胞在培育高单宁含量的植物中的应用。
背景技术：
紫花苜蓿是我国乃至世界上最重要的豆科牧草，被誉为“牧草之王”。长期以来，紫花苜蓿的利用方式以收获干草和调制青贮为主，不宜让家畜在放牧过程中直接利用。这是因为反刍家畜采食新鲜苜蓿后易在瘤胃内形成大量泡沫样物质而不能排出从而导致鼓胀病，从而限制了紫花苜蓿在放牧系统中的应用。
单宁又称单宁酸或鞣质，是多酚中高度聚合的化合物，单宁被认为是一种抗鼓胀病因子，在家畜瘤胃内单宁可与包括紫花苜蓿在内的牧草中的蛋白质形成复合物，产生大量过瘤胃蛋白，使牧草中的蛋白质可在家畜小肠中得到更好的吸收利用，从而使家畜避免 鼓胀病的发生。但苜蓿等豆科牧草其含量非常低，在采食新鲜的苜蓿后极易引起家畜的鼓胀病。
随着分子生物学的发展，生物技术在育种中得到了广泛地应用。但对紫花苜蓿中单宁合成的分子机制的研究还相对较少。因此，紫花苜蓿中单宁合成相关的分子生物学机制还有待于进一步的研究。发明内容
本发明基于对紫花苜蓿中单宁合成相关的分子生物学机制的研究，一方面提供了紫花苜蓿花青素还原酶基因及该基因编码的蛋白，另一方面还提供了含有所述紫花苜蓿花青素还原酶基因的表达载体和细胞，以及培育高单宁含量的紫花苜蓿的方法，还提供了它们的应用。
本发明提供了一种紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No :2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No :2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有花青素还原酶活性的氨基酸序列。
本发明还提供了一种紫花苜蓿花青素还原酶基因，其中，该基因具有SEQ ID No 1 所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因。
本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因。
本发明还提供了一种培育紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到单宁含量高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。
本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育单宁含量高的植物中的应用。
单宁是黄酮类化合物生物合成中的一种重要的分支产物，该途径位于苯丙烷途径下游，主要以花青素作为前体物质，通过一步或多步酶促反应而形成。本发明人经过研究发现，本发明提供的MsBAN基因(SEQ ID NO I)是紫花苜蓿中的一种花青素还原酶的编码基因，这种源自紫花苜蓿的花青素还原酶是紫花苜蓿中类黄酮物质合成途径中与单宁合成有关的一种重要的酶，可促成单宁的合成。
本发明从紫花苜蓿中克隆的花青素还原酶基因为克服主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)易引发家畜发生鼓胀病提供了基因资源，在基因工程改良牧草植物的研究中将发挥重要作用。
图1显示了实施例1中对紫花苜蓿植株进行农杆菌介导的MsBAN基因转化所用的插入有MsBAN基因的pCAMBIA1302载体的结构。
具体实施方式
本发明提供了一种由紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有 SEQ ID No :2所不的氣基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No :2所不的氣基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有花青素还原酶活性的氨基酸序列。优选情况下，该蛋白具有SEQ ID No :2所示的氨基酸序列。
相应地，本发明还提供了一种紫花苜蓿花青素还原酶基因(MsBAN)，其中，该基因具有SEQ ID No 1所不的核昔酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No 2所不的氣基酸序列的核苷酸序列。优选地，该基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。
本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因(MsBAN)是发明人通过以下方法筛选得到的
根据截型苜蓿中已经克隆的花青素还原酶基因(Genbank登记号为 AY184243)保守域设计引物(RT-PCR 引物为F :5 ' -TCAAGATCCTGAGAATGACA-3 ' ；R 5' -ATATCCTCGACATGAGTG A~3')，从紫花苜蓿(Medicago sativa L. cv. Zhongmu No.1, 中苜一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司) 中进行扩增，回收预期大小为450bp的片段(跑电泳后回收此长度的片段)，将回收的片段连入PMD18-T Vector(Takara),测序测序结果在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析；将分析结果中与花青素还原酶类有关的4条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现I条具有连续的ORF (长度为 452bp);用该序列设计特异引物(MsBAN-RT-F GCTAGCTGAAAAGGCTGCAT ；MsBAN-RT-R TCCTCGACATGAGTGAGGA)，且利用该序列设计5’ RACE引物与3’ RACE引物，以紫花苜蓿荚果组织为材料，获得其全长序列，具体步骤为
利用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, USA)分别对该 EST 序列进行了 5’ RACE和3’ RACE克隆，最后获得了该基因全长序列(SEQ ID N0:1)。其中，基因克隆的方法为分子生物学领域的常规实验操作，具体方法如下
RACE-ready cDNA 的合成
A.准备基本液体2. 0μ I 5X 第一链缓冲液，1. 0μ I DTT(20mM)，1. 0μ IdNTP Mix (IOmM)；
B.制备用于 5’ RACE 的 cDNA :2. 75 μ I RNA,1. O μ I 5' -CDS PrimerA ；
制备用于3’ RACE 的 cDNA :3. 75 μ I RNA,1. O μ 13' -CDS PrimerA ；
C.将准备好的液体放于72°C 3分钟，再放于42°C冷却2分钟。
D.向 B 中 5’ RACE 的 cDNA 中加入 I μ I 的 SMARTer IIA oligo。
E.制备5’ RACE和3，RACE-Ready cDNA反应液4. O μ I的步骤A得到的缓冲液，0.25 μ I RNA 酶抑制剂(40U/ μ I)，1. O μ I SMARTScribe 逆转录酶(100U)。
F.将步骤E中的液体加入到步骤C中，完成3’RACE-Ready cDNA合成反应液的制备；将步骤E中的液体加入到步骤D中，完成5’ RACE-ReadycDNA合成反应液的制备。
G.将制备好的反应液放于42°C中90分钟，最后70°C中10分钟，完成Ready-cDNA 的合成。
cDNA末端的快速合成
H.准备基本液体34· 5 μ I PCR 用水，5. O μ I 10 X Adcantage 2PCR 缓冲液，1.0μ I dNTP Mix(IOmM),1. 0μ I 50 X Advantage 2 聚合酶 Mix;
1.制备用于 5’RACE 的 PCR反应2. 5μ I 5’RACE-ready cDNA, 5· O μ IUPM(IOX)，1. O μ I GSPl 5' -GCAAAGCCACCCACTTGGGGTTATC-3' ；41. 5 μ I 的步骤 H 中制备的缓冲液
制备用于3’RACE 的 PCR 反应2· 5μ I 3’ RACE-ready cDNA，5· O μ IUPM(IOX)，1.O μ I GSP25' -GCTGGTTTTATCATGTCA-3' ；41. 5 μ I 的步骤 H 中制备的缓冲液
RACE反应体系为94°C 30秒，72°C 3分钟，共5个循环94°C 30秒，70°C 3分钟， 72 0C 3分钟，共5个循环；94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分钟，共20个循环。
取PCR产物于1.0重量％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，回收目的条带，连接回收产物与pEGM T-Easy载体上，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，提取质粒并测序，进行序列拼接，测序结果显不该基因具有SEQ ID Νο I所不的核昔酸序列(1247bp)。
本发明还提供了一种表达载体，其中，该表达载体含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本发明提供的基因可以通过现有的方法构建到表达载体中，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。
本发明还提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者编码SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述细胞可以为单子叶植物的细胞，也可以为双子叶植物的细胞，如水稻、小麦、玉 米、黄瓜、番茄或苜蓿等的细胞。优选为苜蓿细胞，更优选为紫花苜蓿细胞。
本发明还提供了一种培育单宁含量高的紫花苜蓿的方法，其中，该方法包括将具有SEQ ID No :1所示的核苷酸的基导入到紫花苜蓿细胞中，得到单宁含量提高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。
根据本发明所述将有本发明提供的基因导入到紫花苜蓿细胞中的方法为基因工程领域常规的方法，例如可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，之后将转化的植物细胞培育成植株。
本发明还提供了本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因、及其编码的蛋白、含有所述基因的表达载体、含有所述基因的转基因细胞在培育单宁含量高的植物中的应用。 优选地，所述植物为紫花苜蓿。
实施例1
农杆菌介导的MsBAN基因转化紫花苜蓿植株
一、材料与试剂
1、植物材料
供试苜猜品种为紫花苜猜(Medicago sativa L. cv. Zhongmu No.1,中苜一号，北京中畜东方草业科技有限责任公司)。
发芽7天的无菌苗子叶为遗传转化的受体材料。
2、农杆菌菌株和质粒载体
所用的农杆菌菌株为根癌农杆菌LBA4404(北京天恩泽基因科技有限公司)
农杆菌培养基
权利要求
1.一种由紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其特征在于，该蛋白具有SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No :2所示的氨基酸序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有花青素还原酶活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中，该蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列。
3.一种紫花苜蓿花青素还原酶基因，其特征在于，该基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者该基因具有编码SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其中，该基因具有SEQID No :1所示的核苷酸序列。
5.—种表达载体,其特征在于,该表达载体含有权利要求3所述的基因。
6.ー种转基因细胞，其特征在干，该转基因细胞含有权利要求3所述的基因。
7.根据权利要求6所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为紫花苜蓿转基因细胞。
8.一种培育紫花苜蓿的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求3所述的基因导入到紫花苜蓿细胞中，得到单宁含量高的紫花苜蓿细胞及转基因植株。
9.权利要求1所述的蛋白、权利要求3所述的基因、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的转基因细胞在培育单宁含量高的植物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述植物为紫花苜蓿。
全文摘要
本发明公开了一种由紫花苜蓿花青素还原酶基因编码的蛋白，其中，该蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者该蛋白具有将SEQ ID No2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有花青素还原酶活性的氨基酸序列。本发明还涉及该蛋白的编码基因，以及含有该基因的表达载体和细胞，同时还涉及一种培育单宁含量高的紫花苜蓿的方法和它们的应用。本发明提供的紫花苜蓿花青素还原酶基因(MsBAN)在紫花苜蓿中的表达可以显著提高紫花苜蓿中单宁的含量。该基因的发现为克服主要牧草植物(特别是豆科植物，如紫花苜蓿)易引发家畜发生鼓胀病提供了基因资源，在基因工程改良牧草的研究中将发挥重要作用。
文档编号C12N9/02GK103031282SQ20111029720
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者王学敏, 高洪文, 王赞, 董洁 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所