专利名称：一种鲍鱼育苗方法
技术领域：
本发明涉及海水贝类养殖技术领域，具体涉及鲍鱼育苗方法，特别涉及一种利用 光合细菌(Photosynthetic bacteria, PSB)和芽孢杆菌(Bacillus)提高育苗过程中鲍鱼 幼苗成活率的方法。
背景技术：
鲍鱼是传统的名贵食材，肉质鲜美，营养丰富，素称“海味之冠”，是海产八珍之一， 也是四大海味之首。近年来，随着人们生活水平的提高，市场对鲍鱼的需求量在增加，鲍鱼 育苗也成为了水产养殖领域中倍受人们关注的环节。但是目前在鲍鱼的育苗过程中存在着 很多问题，如水体中致病菌、有害物质的大量富集导致幼苗壳长及体重增长缓慢，各种病害 的增加也使得幼苗成活率低，育苗成本增加，从而给养殖户带来了消极的影响。流水养殖是较普遍的生产模式，但这种养殖模式对饲料及药品的耗费都较大，需 要消耗大量的海水及能源，而且一旦出现灾害性天气(如雨季_造成低密度海水、风暴等) 或海况恶化(赤潮等)，则即使有足够的设备也难以保证正常供水，甚至连续几天无法抽 水，影响了育苗车间的正常运转。全封闭式养殖虽然耗水少，且不易污染海洋环境，但不利于废物的排出，在一定程 度上限制了鲍苗生长率的提高。同时，投资大，运行成本高，不易被广大养殖户所接受。各种新型配合饲料的研制和抗生素的使用也是目前水产养殖业较为常用的养殖 模式，但是抗生素的使用会在鲍鱼中有残留，而配合饲料却见效慢、生产效率低、容易污染 养殖水域，这些都直接影响了育苗的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能提高鲍鱼幼苗免疫力 与成活率的育苗方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一种鲍鱼育苗方法，包含以下步骤(1)制备复合菌液分别将光合细菌和芽孢杆菌活化，培养至对数生长期，离心， 取沉淀，然后用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀，分别得到光合细菌溶液和芽孢杆菌溶液，将二者 混合，得到复合菌液；(2)选池培藻对育苗池进行消毒处理，加装遮光装置和曝气装置，在布卵前开始 培藻；(3)布卵与育苗往育苗池中布卵，育苗过程中每过5 40天换一次水，并往养殖 水体中添加营养盐和步骤(1)制备得到的复合菌液；(4)采收经过培育，剥离稚孢，得到鲍鱼苗。步骤(1)中所述光合细菌为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.，保藏编 号为CGMCC1. 2193，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心)或沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris,保藏编号为CGMCC1. 2349，购买于中国普通微 生物菌种保藏管理中心)中的至少一种；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis(Ehrenberg)C0hn，保藏编号为GIM1. 136，购买于广东省微生物研究所)；步骤(1)中所述光合细菌活化的方法为将光合细菌按体积百分比0. 接种到 RCVBN液体培养基中，于30°C、光照强度为30001x下光照厌氧培养48h，得到活化的光合细 菌菌液；所述芽孢杆菌活化的方法为将芽孢杆菌按体积百分比0. 接种到营养肉汤培养 基中，于37°C、250rpm摇床培养18h，得到活化的芽孢杆菌菌液；步骤(1)中所述光合细菌培养的方法为将活化的光合细菌菌液按体积百分比 10%接种到RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48 96h，期间搅拌，然后5000 8000rpm 离心5 15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为108 1012cfu/ml的光合细菌菌液；所述芽孢杆菌培养的方法为将活化的芽孢杆菌菌液按体积百 分比10%接种到营养肉汤培养基中，置于37°C、250rpm摇床培养24h，然后5000 8000rpm 离心5 15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为108 1012cfu/ml的芽孢杆菌菌液；步骤(1)中所述复合菌液是由等菌液浓度等体积的光合细菌溶液与芽孢杆菌溶 液混合得到；步骤(2)中所述对育苗池的消毒处理是指将育苗池彻底洗刷干净后，采用质量百 分比为10%的高锰酸钾溶液消毒；步骤(2)中所述加装遮光装置是在育苗池上方盖一层遮光率为60%的黑色遮阳 网，使光照率为3500 50001uX ；所述加装曝气装置是在育苗池池两边等距离对称放置输 气管各4条；步骤⑵所述培藻是在布卵前40 45天开始培藻；步骤⑵所述培藻的条件和方法为育苗池水温控制在15 20°C，均勻投放藻种 到附着基上，将附着基均勻排放在养殖池中培养，曝气，培藻过程中不断地将附着基上的老 化藻搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培养十天再布卵，所述附着基为黄色 聚乙烯波纹板。步骤(3)中所述布卵是布鲍鱼卵，布卵密度为每立方米水体中布卵10000 30000 粒；步骤(3)中所述营养盐是指硅藻营养元素(N P Si Fe = 5 1 1 1)， 育苗过程中营养盐每2 4天添加一次，每次投放量为3 5g/m3养殖水体；步骤(3)中所述育苗条件是光照控制在2200 3000lux，水温控制在20 25°C ；步骤(3)中所述添加复合菌液是每次换水后都加入步骤(1)制备得到的复合菌 液，使水体中混合菌液终浓度达到102 108cfu/ml ；步骤⑷中所述的培育，其培育时间为35 45天。光合细菌(Photosynthetic bacteria, PSB)细胞含有62%蛋白质，丰富的VB1、 VB2.VB3和能促进动物生长的生物素，而且无毒、易消化，是优良的饲料添加剂，有利于增强 鲍鱼的免疫功能和抗病力；此外，光合细菌能净化氨氮、亚硝基氨及降解有机物，能将养殖 水域的水质保持在一个清洁的水平。芽孢杆菌(Bacillus)是常用的益生菌之一，可以抑制 病原微生物的生长。光合细菌与芽孢杆菌的协同使用能够提高水产动物的生长率和成活率，还能够达到改善水质，减少病害的目的。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果1、本发明复合菌液的制备方法简单，工序少，可有效降低成本。2、本发明复合菌液可提高鲍鱼的免疫力，使鲍苗成活率显著提高，同时能促进鲍 鱼快速生长，降低生产成本，提高经济效益。3、本发明的鲍鱼育苗方法能避免滥用抗生素所带来的副作用，以及使用配合饲料 所带来的海水污染问题。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例本发明的具体实施地点为山东省某育苗场，实施时间85天，试验地海域的具体水 源水质符合中华人民共和国国家标准渔业水质标准(GB11607-89)要求，海水经过砂滤、沉 淀处理后进入养殖池，符合农业部《无公害食品海水养殖用水水质》(NY5052-2001)要求。 鲍鱼的养殖池建在养殖大棚内，育苗池的规格为2. 5X2X0. 75m3。育苗依照以下步骤进行(1)制备复合菌液取红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)(购于中国普通微生物菌种保藏管理中 心，保藏编号为CGMCC1. 2193)，按体积百分比0. 1 %接种到RCVBN液体培养基中，于30°C、光 照强度为30001x下光照厌氧培养48h，得到活化的红假单胞菌菌液；将活化的红假单胞菌 菌液按体积百分比10 %接种到RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养72h，期间加以搅拌，然 后6500rpm离心lOmin后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度 为108 1012cfu/ml的红假单胞菌菌液；取枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis (Ehrenberg) Cohn)(购于广东省微生物研究 所，保藏编号GIM1. 136)，按体积百分比0. 接种到营养肉汤培养基(蛋白胨10g，牛肉膏 粉3g，氯化钠5g，pH 7. 4士0.2，下同)中，于37°C、250rpm摇床培养18h，得到活化的枯草 芽孢杆菌菌液；将活化的枯草芽孢杆菌菌液按体积百分比10%接种到营养肉汤培养基中， 置于37°C、250rpm摇床培养24h，然后6500rpm离心lOmin后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬 浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为108 1012cfu/ml的枯草芽孢杆菌菌液；将等菌液浓度等体积的红假单胞菌溶液与枯草芽孢杆菌溶液混合，得到复合菌 液。(2)选池培藻将育苗池彻底洗刷干净后，采用质量百分比为10%的高锰酸钾溶液消毒，再用水 冲洗干净。在育苗池上方盖一层遮光率为60%的黑色遮阳网，使光照率为3500 50001UX， 在育苗池两边等距离对称放置输气管各4条。在布卵前45天开始培藻，水温控制在15 20°C，附着基为黄色聚乙烯波纹板，投 放藻(藻种由山东烟台龙口黄山馆永和育苗场保存并提供)到波纹板上，将波纹板均勻排 放在养殖池中培养，适度曝气，曝气量为10 100L/h/m3，培藻过程中不断地将附着基上的 老化藻搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培养十天再布卵。
(3)布卵与育苗鲍苗为皱纹盘鲍，每池布卵5万粒。根据藻的生长状态，添加硅藻营养元素(购于 厦门健成水产科技研究所)，2 4天添加一次，每次投放量为3 5g/m3养殖水体。育苗过 程中，光照控制在2200 30001uX，水温控制在20 25°C，每过5 40天换一次水，每次 换水后都加入步骤(1)制备得到的复合菌液，使水体中混合菌液终浓度达到102 108cfu/ ml。(4)采收经过40天的培育，此时波纹板上的藻类已部分老化，少数板上的藻已被吃光，稚 鲍体长已长至3. 89-5. 69mm，前期育苗结束，将稚鲍从波纹板上剥离。试验结束时分别进行鲍鱼苗的生长指标，免疫力相关酶指标的检测。育苗阶段采用随机区组试验设计，分为3个试验组(A C)，每组2个重复。三个 实验组的分配如下A组采用流水育苗，勻速流水，日换水量为池水量的2倍，不添加菌液；B组不流水，不加菌液，定期换水；C组不流水，定期换水，且每次换水之后向育苗水体中加入不同浓度的复合菌 液。B组分为B1 B8组，其中B1组为不加菌液，5天换一次水；B2组为不加菌液，10天换一次水；B3组为不加菌液，15天换一次水；B4组为不加菌液，20天换一次水；B5组为不加菌液，25天换一次水；B6组为不加菌液，30天换一次水；B7组为不加菌液，35天换一次水；B8组为不加菌液，40天换一次水。C 组也分为 C1 C8 组，C1 再分为 Cl-1，Cl-2，Cl-3，C1-4 组；C2 则分为 C2-1， C2-2, C2-3, C2-4 组；C3 分为 C3-1，C3-2，C3-3，C3-4 组...C8 分为 C8-1，C8-2，C8-3，C8-4组。C1，C2，C3. . .C7，C8同B组的换水频率，分别指以5天，10天，15天.. 35天，40天 换一次水。而C1分成的四组Cl-1，Cl-2，Cl-3，C1-4分别指代以下的设置组C1-1 5天换水，加入102cfu/ml的复合菌液；C1-2 5天换水，加入104cfu/ml的复合菌液；C1-3 5天换水，加入106cfu/ml的复合菌液；C1-4 5天换水，加入108cfu/ml的复合菌液。同理C2-1 10天换水，加入102cfu/ml的复合菌液；C2-2 10天换水，加入104cfu/ml的复合菌液；C2-3 10天换水，加入106cfu/ml的复合菌液；C2-4 10天换水，加入108cfu/ml的复合菌液。
.........C8-1 40天换水，加入102cfu/ml的复合菌液；C8-2 40天换水，加入104cfu/ml的复合菌液；C8-3 40天换水，加入106cfu/ml的复合菌液；C8-4 40天换水，加入108cfu/ml的复合菌液。一、鲍鱼苗的生长指标检测测定方法如下(1)平均壳长的测定每组中随机抽取50粒鲍苗，采用精密度为1mm的游标卡尺
度量测量壳长，取平均值。(2)壳长平均日增长量收苗平均壳长，取40天的平均值。(3)鲍苗平均个体重量随机抽取50粒鲍苗，称其总重后取平均值。(4)收苗量称取5g鲍苗，计算其粒数，将收集的鲍苗称其总重，后估算鲍苗的粒 数。(5)成活率试验结束时鲍苗量占该阶段投苗量的百分率。结果如下表一流水工业生产A组与对照组B组生长指标的检测
权利要求
一种鲍鱼育苗方法，其特征在于包含以下步骤(1)制备复合菌液分别将光合细菌和芽孢杆菌活化，培养至对数生长期，离心，取沉淀，然后用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀，分别得到光合细菌溶液和芽孢杆菌溶液，将二者混合，得到复合菌液；(2)选池培藻对育苗池进行消毒处理，加装遮光装置和曝气装置，在布卵前开始培藻；(3)布卵与育苗往育苗池中布卵，育苗过程中每过5～40天换一次水，并往养殖水体中添加营养盐和步骤(1)制备得到的复合菌液；(4)采收经过培育，剥离稚孢，得到鲍鱼苗。
2.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(1)中所述光合细菌为红假单胞菌Rhodopseudomonas sp.或沼泽红假单胞菌 Rhodopseudomonas palustris 中的至少一种；步骤(1)中所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus Subtilis(Ehrenberg)Cohn。
3.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(1)中所述光合细菌活化的方法为将光合细菌按体积百分比0. 接种到RCVBN 液体培养基中，于30°C、光照强度为30001x下光照厌氧培养48h，得到活化的光合细菌菌 液；步骤(1)中所述芽孢杆菌活化的方法为将芽孢杆菌按体积百分比0. 接种到营养肉 汤培养基中，于37°C、250rpm摇床培养18h，得到活化的芽孢杆菌菌液。
4.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(1)中所述光合细菌培养的方法为将活化的光合细菌菌液按体积百分比10% 接种到RCVBN培养基中，光照厌氧发酵培养48 96h，期间搅拌，然后5000 8000rpm离 心5 15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为108 1012cfu/ml的光合细菌菌液；步骤(1)中所述芽孢杆菌培养的方法为将活化的芽孢杆菌菌液按体积百分比10%接 种到营养肉汤培养基中，置于37°C、250rpm摇床培养24h，然后5000 8000rpm离心5 15min后取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液悬浮沉淀获得处于对数生长期的浓度为108 1012cfu/ ml的芽孢杆菌菌液。
5.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(1)中所述复合菌液是由 等菌液浓度等体积的光合细菌溶液与芽孢杆菌溶液混合得到。
6.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(2)中所述对育苗池的消毒处理是指将育苗池彻底洗刷干净后，采用质量百分比 为10%的高锰酸钾溶液消毒；步骤(2)中所述加装遮光装置是在育苗池上方盖一层遮光率为60%的黑色遮阳网，使 光照率为3500 50001UX ；所述加装曝气装置是在育苗池池两边等距离对称放置输气管各 4条。
7.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(2)所述培藻是在布卵前40 45天开始培藻；步骤⑵所述培藻的条件和方法为育苗池水温控制在15 20°C，均勻投放藻种到附着基上，将附着基均勻排放在养殖池中培养，曝气，培藻过程中不断地将附着基上的老化藻 搓洗掉，直至布卵前10天最后一次搓洗，搓洗后培养十天再布卵，所述附着基为黄色聚乙 烯波纹板。
8.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(3)中所述布卵是布鲍鱼卵，布卵密度为每立方米水体中布卵10000 30000粒； 步骤(3)中所述营养盐是指硅藻营养元素，育苗过程中营养盐每2 4天添加一次，每 次投放量为3 5g/m3养殖水体。
9.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(3)中所述育苗条件是光照控制在2200 30001uX，水温控制在20 25°C ； 步骤(3)中所述添加复合菌液是每次换水后都加入步骤(1)制备得到的复合菌液，使 水体中复合菌液终浓度达到102 108cfu/ml。
10.根据权利要求1所述的鲍鱼育苗方法，其特征在于步骤(4)中所述的培育，其培 育时间为35 45天。
全文摘要
本发明提供一种鲍鱼育苗方法。该方法是在育苗过程中，每过5～40天将养殖水体更换一次，并同时向养殖水体中添加由光合细菌和芽孢杆菌组成的复合菌液，使水体中复合菌液终浓度达到102～108cfu/ml。本发明的方法能提高鲍苗的免疫力，使鲍苗成活率显著提高，同时能促进鲍鱼快速生长，降低生产成本，提高经济效益，从而克服了目前流水养殖模式对能源和资源的巨大耗费、全封闭养殖中鲍苗生长率不高、采用配合饲料和抗生素饲养所造成的养殖水域污染，抗生素在鲍鱼中残留等问题。
文档编号A23K1/18GK101946734SQ20101027076
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者李娜, 蔡俊鹏 申请人:华南理工大学