专利名称：甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种甜(辣)椒未成熟小孢子直接 诱导萌发成植株的方法。
背景技术：
甜(辣)椒(Capsicum annuum L.)属茄科一年生草本植物，我国栽培面积最大的 蔬菜作物之一。辣椒的杂种优势非常明显，为了提高辣椒的质量和产量，辣椒的育种工作对 生产起着重要的作用。但传统的育种方式存在周期长、效率低等问题。通过花药或花粉培养 获得大量单倍体植株，从而获得纯合二倍体植株，不仅大大加快了育种速度，而且显著地提 高了选择效果，节省了大量的人力物力。花粉培养(游离小孢子培养)则更优于花药培养， 花粉培养排除了药壁组织二倍体体细胞的干扰，获得的植株完全是由单倍体单细胞发育而 来，同时也避免了嵌合体的发生，在通过自发或人工诱导染色体加倍后，能获得遗传上完全 纯合的双单倍体(DH)。这种遗传稳定的材料，可用于杂交育种及种质资源的丰富和改良。自从20世纪70年代烟草和曼陀罗小孢子培养成功获得单倍体植株以来的三十多 年里，大白菜、油菜、大麦、小麦、水稻等作物的小孢子培养都获得了成功。油菜等作物的规 模化双单倍体(DH)植株生产技术在育种上得到了很好的应用。但目前国内外对于甜(辣) 椒游离小孢子培养获得植株的成功报道并不多见。Gonza' lez-Melendi等1996年，Regner 1996年，Mityko'和Fa' ri 1996年和1997年，Ba' ra' ny等2001年都报道了由辣椒游 离小孢子获得胚状体的研究，并没有得到再生植株。U. Bal等在2003年，L. . Biotechnology & Biotechnological Equipment, 17 (2) :38_43页曾报道用甘露醇饥饿、10°C预处理、无激 素并添加17%蔗糖的NLN培养基得到了小孢子愈伤组织；直到2006年，Supena等在Plant Cell Reports, (25) 1 1_10页报道了选用了 10个印度尼西亚辣椒品种，用9°C低温、含有 2%麦芽糖的双层Mtsch培养基培养辣椒花药，收集散落的小孢子，其中6个品种得到了胚 状体并获得单倍体植株。但是最高频率平均10个花蕾只获得了 1个正常植株；刘凡等在 2007年，分子生物学报40 (6) 371-379页报道从预培养15天的辣椒花药中机械游离小孢 子细胞团，只获得了发育程度不同的各类胚状体；Kim等在2008年，.Plant Cell Reports, 27 :425-434页上报道用热激、蔗糖饥饿以及含有9%蔗糖的NLNS培养基等方法培养辣椒游 离小孢子，建立了较高的胚状体发生率及完整的植株再生体系，共获得了 55个胚状体，平 均一皿(约含IOXlO4个花粉)获得5. 5个胚状体，但实验只在辣椒的一个品种上获得成功。 从上述报道可知，不同辣椒品种的游离小孢子培养方法差异非常大，从而说明了甜(辣)椒 品种间基因型的差异对于小孢子培养有着的重要影响。而且游离小孢子培养成功获得再生 植株的仅限于辣椒的几个品种。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种甜(辣)椒未成熟小孢子经诱导 直接萌发成植株的培养方法。
本发明的技术方案如下甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法，包括下述步骤(1)、无菌花药的获得对小孢子处于单核靠边期或双核期的花蕾进行表面消毒， 剥离花药；花蕾的选择方法是通过观察花蕾外部形态，挑选萼片和花瓣等长或花瓣稍长于 萼片，并且内部花药尖端至1/3或1/2处微紫的花蕾；(2)、无菌花药的预培养将步骤(1)中的无菌花药置于改良固体R培养基中，4°C 低温处理2 15天；对无菌花药进行低温预处理的目的在于一方面有利于保持小孢子活 力，另一方面由于花药已在固体培养基上培养了数天，在收集小孢子时，很容易挑选出状态 好且没有污染的花药用于小孢子收集，从而保证了花药的质量；(3)、小孢子的收集取步骤(2)中预培养后的花药，置于改良液体R培养基中，挤 压使小孢子游离，300目滤网过滤，离心收集小孢子；(4)、小孢子的诱导培养将步骤(3)获得的小孢子置于含蔗糖或麦芽糖3 15%、2，4-D浓度为0. 1 0. 5mg/L, KT浓度为0. 5 lmg/L的液体R培养基中，在24 28°C下，黑暗或光照培养；(5)、植株的获得当步骤(4)中的小孢子经诱导形成胚状体后，分别按照下述 (i)、(ii)、(iii)三种不同路径进行培养，得到正常植株；(i)小孢子经诱导后形成的胚状体为鱼雷型或子叶型胚时，转至1/2MS培养基或 含有浓度为1 3%蔗糖的1/2MS培养基中培养，得到正常植株；(ii)小孢子经诱导后形成的胚状体为畸形胚状体时，可用改良液体R培养基与它 的固体形式1 1混合包埋胚状结构，进行培养，得到正常植株，所述的畸形胚状体为畸形 心型胚或畸形鱼雷型胚；(iii)小孢子经诱导后形成不正常的小植株时，将植株转接至含有浓度为 1% -3%的蔗糖，BA 2毫克/毫升和NAA 0. 2毫克/毫升的MS固体培养基中培养，得到正 常植株，所述的不正常的小植株为没有完整的生长点或是生长畸形的再生植株；本发明上述步骤中的固体R培养基和液体R培养基，仅为R培养基的形态不同，R JtIfSWiIj^ nT#jAL Sibi M 等 1979 Obtention de plantes haploids par androgen ese in vitro chez Ie piment(Capsicum annuum L. )Ann Am elior Plantes,29 583-606.。上述技术方案中所述的方法，其中，步骤(1)中对花蕾进行表面消毒的步骤为用 70%酒精浸泡0. 5 1分钟，1 2%。氯化汞浸泡8 15分钟，无菌水冲洗3 5次。上述技术方案中所述的方法，其中，步骤(2)中的固体R培养基中还含有浓度为 3%的蔗糖或麦芽糖。上述技术方案中所述的方法，其中，步骤(3)中的液体R培养基中还含有浓度为 3 15%的蔗糖或麦芽糖。本发明具有以下有益效果1、本发明的方法适用于不同基因型的多种甜椒和辣椒的品种；2、本发明所用的游离小孢子培养方法对于不同类型的多个品种的甜(辣)椒的小 孢子培养中均获得了成功，该方法可用于不同基因型的多种甜(辣)椒的未成熟小孢子培 养；
3、使用本发明的方法能够直接由小孢子获得单倍体植株，缩短了育种时间。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说 明。实施例1 羊角型辣椒小孢子培养6月14日从种植大棚取回萼片和花瓣等长，并且内部花药尖端至1/3或1/2处微 紫，小孢子发育时期为单核期靠边期的花蕾，花蕾的表面消毒是指经75%酒精30秒，2%0升 汞8至10分钟，无菌水冲洗3次。小心将花药用小镊子取出，置于改良固体培养基R上，4°C 冰箱中低温处理10天后，挑出无污染，状态好的20个花药用针筒内芯进行挤压，把小孢子 挤出来，用改良液体R收集，300目滤网过滤，lOOOr/min离心3分钟后，弃上清液，重复2次， 取2毫升至直径为30mm培养皿中，24°C黑暗培养。改良的R液体培养基添加麦芽糖浓度为 12%,2,4-D 0.5毫克/升，KT 1毫克/升。22天肉眼可见胚性细胞团，30-40天，已有大量 胚状体产生，统计结果表明，20个花药就产生了至少80个胚状体，小孢子的诱导不同步，有 些胚状体已到鱼雷期或是子叶期，还有些只能看出是具有胚性结构的细胞团。挑出已分化 出两片小子叶的胚状体转至1/2MS0培养基，15-20天发育正常的胚状体长成根系发达的正 常完整植株。实施例2 牛角型辣椒小孢子培养5月31日从种植大棚取回萼片和花瓣等长，花瓣稍长于萼片，并且内部花药尖端 至1/3或1/2处微紫，小孢子发育时期为单核期靠边期的花蕾，花蕾的表面消毒是指经75% 酒精1分钟，2%。升汞10分钟，无菌水冲洗3次。小心将花药用小镊子取出，置于改良的固 体培养基是R上，4°C冰箱中低温处理7天后，挑出无污染，状态好的23个花药用针筒内芯 进行挤压，把小孢子挤压出来，用改良的液体R收集小孢子，300目滤网过滤，1000r/min离 心3分钟后，弃上清液，重复2次，取2毫升装于直径为30mm培养皿中，24°C黑暗培养，改良 R培养基即在R培养基中添加了麦芽糖12%，2，4-D 0.5毫克/升，KT 1毫克/升。培养 7天显微镜下观察到细胞分裂，30-40天，已有大量胚状体产生，统计结果表明，23个花药产 生了至少67个胚状体，小孢子的诱导不同步，有些胚状体已到鱼雷期或是子叶期，还有些 只是球形胚和心形胚时期。挑出已分化出两片小子叶的胚状体转至1/2MS0培养基，把发育 不是很正常的35个胚状体用改良R液体和固体培养基1 1混合后包埋，10-15天后有6 个被包埋胚状体生长正常转接至1/2MS0培养基中长成正常完整植株。实施例3 灯笼型甜椒小孢子培养6月14日从种植大棚取回萼片和花瓣等长，花瓣稍长于萼片，并且内部花药尖端 至1/3或1/2处微紫，小孢子发育时期为单核期靠边期的花蕾，花蕾的表面消毒是指经75% 酒精30秒，2%。升汞10分钟，无菌水冲洗3次。小心将花药用小镊子取出，置于改良固体培 养基是R上，4°C冰箱中低温处理5天后，挑出无污染，状态好的22个花药用针筒内芯进行 挤压，把小孢子挤出来，用改良液体R收集小孢子，300目滤网过滤，1000r/min离心1_3分 钟后，弃上清液，重复2次。取2毫升装于直径30mm培养皿中，24°C光照培养。改良R液体 培养基添加蔗糖糖浓度为15%，2，4-D 0.5毫克/升，KT 1毫克/升。培养7天显微镜下观 察到细胞分裂，30-40天，已有大量胚状体产生，统计结果表明，20个花药共产生了至少135
5个胚状体和具有胚性结构的细胞团，平均一个花药得到6. 7个胚状体和具有胚性结构的细 胞团。小孢子的诱导不同步，有些胚状体已到鱼雷期或是子叶期，还有些只能看出是具有胚 性结构的细胞团。将已长出子叶结构的胚状体转接至1/2MS0培养基，一个月后把有些长势 仍不好，没有生长点或是长得畸形的小植株转接至含有浓度为2 %的蔗糖，BA 2毫克/毫升 和NAA 0. 2毫克/毫升的MS固体培养基中培养，培养20-30天，20%的不正常小植株生长 正常。一共获得正常植株21棵，平均1个花药得到一棵单倍体植株。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
权利要求
甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法，包括下述步骤(1)、无菌花药的获得对小孢子处于单核靠边期或双核期的花蕾进行表面消毒，剥离花药；(2)、无菌花药的预培养将步骤(1)中的无菌花药置于改良的固体R培养基中，4℃低温处理2～15天；(3)、小孢子的收集取步骤(2)中预培养后的花药，置于改良的液体R培养基中，挤压使小孢子游离，300目滤网过滤，离心收集小孢子；(4)、小孢子的诱导培养将步骤(3)获得的小孢子置于含麦芽糖或蔗糖3～15％、2，4 D浓度为0.1～0.5mg/L，KT浓度为0.5～1mg/L的液体R培养基中，在24～28℃下，黑暗或光照培养；(5)、植株的获得当步骤(4)中的小孢子经诱导形成胚状体后，分别按照下述(i)、(ii)、(iii)三种不同路径进行培养，得到正常植株；(i)小孢子经诱导后形成的胚状体为子叶型胚时，转至含有浓度为1～3％蔗糖的1/2MS培养基中培养，得到正常植株；(ii)小孢子经诱导后形成的胚状体为畸形胚状体时，可用改良液体R培养基与它的固体形式1∶1混合包埋胚状结构，进行培养，得到正常植株，所述的畸形胚状体为畸形心型胚或畸形鱼雷型胚；(iii)小孢子经诱导后形成不正常的小植株时，将植株转接至含有浓度为1％ 3％的蔗糖，BA 2毫克/毫升和NAA 0.2毫克/毫升的MS固体培养基中培养，得到正常植株，所述的不正常的小植株为没有完整的生长点或是生长畸形的再生植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中对花蕾进行表面消毒的步骤 为用70%酒精浸泡0. 5 1分钟，1 2%。氯化汞浸泡8 15分钟，无菌水冲洗3 5次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中的改良的固体R培养基中还 含有浓度为3%的蔗糖或麦芽糖。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中改良的液体R培养基中还含 有浓度为3 15%的蔗糖或麦芽糖。
全文摘要
本发明甜(辣)椒未成熟小孢子直接诱导萌发成植株的方法，属于植物细胞工程技术领域，该方法包括以下步骤(1)从小孢子处于单核靠边期或双核期的无菌花蕾中获得无菌花药；(2)无菌花药在改良的R培养基中，4℃低温处理2～15天的预培养；(3)在改良的液体R培养基中收集小孢子；(4)小孢子在改良的液体R培养基中，24～28℃，黑暗或光照下诱导培养；(5)植株的获得。发明所用的游离小孢子培养方法对于不同类型的多个品种的甜(辣)椒的小孢子培养中均获得了成功，该方法可用于不同基因型的多种甜(辣)椒的未成熟小孢子培养。
文档编号A01H4/00GK101946713SQ201010274159
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者佟曦然, 朱至清, 李春玲, 邓晓梅 申请人:北京市海淀区植物组织培养技术实验室