专利名称：具有改良生长特性的植物及其制备方法
具有改良生长特性的植物及其制备方法本申请为2005年5月30日提交的、发明名称为“具有改良生长特性的植物及其制 备方法”的PCT申请PCT/EP2005/052465的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日 期为2007年1月26日，申请号为200580025230. 2。本发明涉及用于改良植物生长特性的方法。更具体地，本发明涉及通过增加植物 茎干组织中E2F 二聚化配偶体(DP)编码基因的表达和/或通过增加植物茎干组织中DP蛋 白质的活性来改良植物生长特性的方法。本发明还涉及在茎干优选的控制元件控制下的DP 编码基因转化的植物，相对于对应的野生型植物，该植物具有改良的生长特性。由于世界人口的持续增加，提高农业效率一直是研究的主要目标。农作物和园艺 改良的常规手段利用选育技术来鉴定具有期望特性的植物。然而，这种选育技术具有若干 缺点，即这些技术一般是劳动密集型的，而且产生通常含有异质遗传组分的植物，这并非总 是产生自亲本植物传递过来的期望性状。相反，分子生物学的发展已经使人们能够更精确 地操作植物的种质。植物的基因工程需要分离和操作遗传物质(通常以DNA或RNA的形 式)和继之将遗传物质导入植物。这类技术导致具有多种改良的经济学、农艺学或园艺性 状的植物的开发。具体的目标经济性状包括高的产量和生物量。改良一种或多种植物生长特性的能力将在农作物改良、植物育种、观赏植物的生 产、树木栽培、园艺、林学以及在藻类或植物的生产领域具有多种应用(用作生物反应器， 例如用于药物如抗体或疫苗的生产，或用于有机废物的生物转化，或在高产的藻类和植物 的实例中用作燃料)。相对于对应的野生型植物，已发现在植物茎干组织中，DP编码基因表达的增加和 /或DB蛋白质活性的增加使植物具有改良的生长特性。DP蛋白质是广泛保守的蛋白质并且涉及细胞周期的控制(Gutierrez等人(2002) Current Opinion in Plant Biology 5:480-486)。DP 因子与 E2F 因子一起作用，形成能 够起始S期特异基因转录的异二聚体。Magyar等人，2000 (FEBS letters, 486 :79_97)报道 T E2F因子、DP因子和E2F-DP样(DEL)因子的鉴别。基于序列比较，如Vandepoele等人， 2002 (Plant Celll4(4) :903_16，在此处完整引入作为参考)所述，将编码这些蛋白质的拟 南芥属(Arabidopsis)基因划分为不同的种类。此外，由Magyar等人报道(在此处也完整 引入作为参考)了典型DP蛋白质的结构特性。例如，Magyar等人的图3A和B显示在拟南 芥DP蛋白质中特征性DNA结合结构域和二聚化结构域的位置。Vand印oele等人的图5很 好地说明由于存在一个DNA结合结构域和一个二聚化结构域，DP蛋白质与相关的蛋白质， 如E2F因子和DEL不相同。以Pioneer Hi-Bred之名公布的国际专利申请W000/47614表明使用组织特异性 或细胞特异性启动子控制DP表达提供不同的生长特性。具体而言，其表明(i)使用种子特 异性启动子将刺激细胞分裂速率，产生增加的种子生物量；(ii)使用强表达的早期雄花穗 特异性启动子将增加这一完整生殖结构的发育；和(iii)使用根特异性启动子将产生更大 的根和更快的生长(即更多的生物量积累)。然而，在该申请中没有产生或例证具有这类不 同生长特性的植物。
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后来以Consejo Superior De Investigaciones Cientificas为名申请的国际专 利申请W001/21644仅表明可以通过重组DP的表达控制植物生长，而没有例证。尽管陈述 “特别有用的是使用组织特异性启动子或化学诱导型启动子控制表达的核酸”，没有提到或 例证使用这类核酸转化并且具有改良生长特性的植物的应用。尽管存在上述启示，使用现有技术的教导还没有产生改良的转基因植物，其说明 如现有技术所启示的，使用DP在改良植物生长特性中是无效的。出人意料地，现已发现可以通过增加植物茎干组织中DP蛋白质的活性和/或通过 增加DP编码基因在植物茎干组织中的表达来改良植物生长特性。本发明提供相对于对应的野生型植物，用于改良植物生长特性的方法，其包括特 别在植物茎干组织中增加DP蛋白质或其同源物活性和/或在植物茎干组织中增加DP编码 基因或其功能变体的表达。有利地，相对于对应的野生型植物，本发明方法的操作使植物具有多种改良的生 长特性，特别是增加的生物量。所述改良的生长特性可以是稳定的并且可以遗传至下一代。术语“生长特性”在下文详述的关于生长的其他特性中包括增加的生物量。术语“生物量”指产生的生物物质的量。生物量的增加可以是在相对于对应的参考 植物的生物量(例如相对于对应的野生型植物的生物量)的植物的一个或多个部分。本发 明植物的特征在于增加的地上生物量，其对于农作物植物的营养组织生长特别重要。例如， 对于青贮饲料玉米，典型的经济价值参数是地上生物量和叶的能量含量；对于树和甘蔗，典 型的经济价值参数是茎的地上生物量。本文所用的术语“增加的生物量”还可以包括增加的产量，特别是增加的种子产量。本文所定义的术语“增加的产率”意指相对于对应的野生型植物，在如下的一个或 多个方面的增加(i)植物一个或多个部分增加的生物量(重量)，特别是地上(可收获) 部分，增加的根生物量或增加的任何其他可收获部分的生物量，( )增加的种子产率，其可 能源于增加的种子生物量(粒重)，可以是每株植物粒重的增加或单个种子基础上的增加， 并且所述粒重的增加可以是因改变的种子大小所致，如种子长度和/或种子宽度和/或种 子面积；(iii)增加的(饱满)种子数；(iv)增加的种子大小，其还可以影响种子的组成； (ν)增加的种子体积，这也可能影响种子的组成；(Vi)增加的收获指数，其可以表达为可收 获部分如种子的产量占总生物量的比率；和(Vii)增加的千籽粒重(TKW)，其是从所计的饱 满种子数和它们的总重量推断的。增加的TKW可能源于增加的种子大小和/或粒重。以玉米为例，产量增加可以表现为以下一个或多个方面每公顷或每英亩植物数 的增力口、每株植物穗的增力口、畦数、每畦种子数、粒重、千籽粒重、穗长度/直径的增加。以稻 为例，产量的增加可以表现在下列的一个或多个方面的增加每公顷或每英亩的植物数、每 株植物圆锥花序数、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花数、种子饱满率的增加、千 籽粒重的增加等等。产量的增加还可以产生改变的构造或可以作为改变的构造的结果发 生。因为本发明的转基因植物具有增加的产率，相对于处于其生活周期的相应阶段的 对应野生型植物的生长速率而言，这些植物很可能显示出增加的生长速率(在它们至少部 分的生活周期期间)。增加的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特异性的，或可以基本存在于整个植物中。具有增加的生长速率的植物甚至可以呈现提早开花。生 长速率的增加可以发生在植物生命周期的一个或多个阶段或基本在整个植物生命周期中。 在植物生命周期中早期增加的生长速率可以反映增强的活力。生长速率的增加可以改变植 物的收获周期，使得植物能够比可能的情形更晚播种和/或更早收获。如果生长速率充分 增加，可能允许播种相同植物物种的更多种子(例如播种和收获稻类植物，接着播种和收 获更多的稻类植物，所有这些都在一个常规的生长期内)。类似地，如果生长速率充分增加， 可能允许播种不同植物物种的更多种子(例如播种和收获稻类植物，接着，例如，播种和任 选地收获大豆、马铃薯或任何其它合适的植物)。在一些植物的情形下从同一根茎收获增加 的次数也是可能的。改变植物的收获周期可能导致每英亩年生物量产量的增加(由于(比 方说在一年里)任何特定植物生长和收获的次数增加)。与野生型相似物相比，生长速率 的增加还可以使能够在更广阔的地域栽培转基因植物，因为种植作物的地域限制通常由种 植时(早季)或收获时(晚季)不利的环境条件所决定的。如果缩短收获周期，可以避免 这类不利条件。可以通过生长实验测绘生长曲线得到多个参数来确定生长速率，这类参数 可以是=T-Mid(植株达到其最大大小的50%所需的时间)和T-90(植物达到其最大大小的 90%所需的时间)等等。本文所用的术语“生长特性”还包括植物构造。本发明的植物呈现改变的构造，其 为由于增加的生物量而表现出的地上部分改变的形状和尺寸。这一特性对于多种观赏植物 是有利的。本文所用的术语“构造”包括植物的外观或形态，包括任何一种或多种结构特性 或结构特性的组合，所述结构特性如植物的细胞、组织、器官或植物的细胞、组织或器官的 组的形状、尺寸、数量、位置、质地、排列和模式。特别优选的是具有下列任一项或多项的植 物增加的分蘖(或相应的植物部分)的数量、尺寸、形状；增加的枝条和/或叶的数量。在植物处于无胁迫条件，或植物相对于对照植物暴露于多种胁迫下发生任何前述 生长特性的改良。植物通常通过更为缓慢地生长来应答暴露的胁迫。在严重胁迫的条件中， 植物甚至可以完全停止生长。另一方面，中等胁迫在本文中定义为当植物暴露于此而不导 致植物完全停止生长的任何胁迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进展，栽培 的农作物植物常常不会遭遇到严重胁迫。因此，中等胁迫诱导的受损的生长经常是农业上 的不理想特性。中等胁迫是植物可能接触的典型胁迫。这些胁迫可以是植物可以被暴露于 其的日常生物的和/或非生物的(环境的)胁迫。典型的非生物或环境胁迫包括由反常的 热或冷/冰冻温度产生的温度胁迫；盐胁迫；水胁迫(干旱或过量的水)。非生物胁迫还可 以由化学药品产生。生物胁迫一般是由病原体，如细菌、病毒、真菌和昆虫产生的那些胁迫。
在多种植物物种可以有利地修饰上述生长特性。 本文所用得术语“植物”包括整个植物、植物和部分植物的祖先和后代，包括种 子、茎干、茎、根(包括块茎)以及植物细胞、组织和器官。术语“植物”还因此包括悬浮 培养物、胚、分生区、胼胝体组织、叶、种子、根、茎干、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本 发明的方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，特 别是单子叶和双子叶植物，包括选自如下物种的饲料或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作 物、乔木或灌木金合欢属物种(Acacia spp.)、槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种 (Actinidia spp.) >^PfWMi^ft (Aesculus spp.) >IfM^JHtE^ (Agathis australis)、 Albizia amara、Alsophila tricolor、须芒草属物禾中(Andropogon spp.)、落花生属
6物禾中(Arachis spp·)、模榔(Arecacatechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、 Baikiaea pluri juga、|^7KjS (Betula spp.) λ^^Μ (Brassica spp. )、7^_ (Bruguiera gymnorrhiza) Λ Burkea 已fric^n已、胃锡P (Butea frondosa) Λ Cadaba f&rinos&、^:—^^jS^/ 禾中(Calliandra spp.)、大口十茶(Camellia sinensis) ,^AM (Canna indica)、辣椒属物 禾中(Capsicum spp·)、决明属物禾中(Cassia spp·)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜 属物禾中(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、 Colophospermum mopane、变异小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂 属物种(Crataegus spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、桕木属物种(Cupressus spp.)、 Cyathea dealbata、媪梓(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅 属 禾中(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、tm W (Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山马蟥属物种(Desmodium spp·)、粗糙 虫丰贝蔽(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、,廉扁豆属物 禾中(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、 禾參子(Eleusine coracana) Λ IjM ^M^ft (Eragrestis spp.)、束Ij桐属·禾中(Erythrina spp.)、㈱属·禾中(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、胃*属·禾中 (Fagopyrum spp.)、费约果(Feijoa sellowiana)、草莓属物禾中(Fragaria spp.)、千斤拔 属物禾中(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银禅属物 禾中(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄蔑属物禾中(Hedysarum spp.)、牛鞭 草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、 Hyparrhenia rufa、小连翅(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭蓝 (Indigo incarnata)、胃■属·禾中(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、古月fe〒属· 禾中(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaenaleucocephala、Loudetia simplex、罗屯页 豆(Lotonus bainesii)、百脉根属物种(Lotus spp. ) Λ Macrotyloma axillare、苹果属物 禾中(Malus spp.) λ Manihot esculenta、紫苜猜(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides) Λ(Musa sap i en turn)(Nicotianum spp.)、H
豆属物禾中(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、禾S属物禾中(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属物禾中(Pennisetum spp.)、Persea gratissima、碧冬前属物禾中 (Petunia spp.)、菜豆属物禾中(Phaseolus spp.)、模相β 竹(Phoenix canariensis)、 Phormium cookianum、石楠属物禾中(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松属 ^ 禾中(Pinus spp.M (Pisum sativum)λ fr H ^ ^r Χ 丰公(Podocarpus totara)、 Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、杨属·禾中(Populus spp.)、ft W (Prosopis cineraria)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西 洋梨(Pyrus communis)、栎属物禾中(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒 花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、荼 薦子属物种(Ribes spp·)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属物种(Rosa spp·)、悬 钩子属物种(Rubus spp.)、柳属物种(Salix spp. )、Schyzachyrium sanguineum、金松 (Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物禾中(Spinacia spp·)、Sporobolusfimbriatus> Stiburus alopecuroides> Stylosanthos humilis、^|p茶属物禾中(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属物种 (Trifolium spp·)、小麦属物种(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔 属物种(Vacciniumspp.)、野豌豆属物种(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穗沃森
(ffatsonia pyramidata)(Zantedeschia aethiopica)(Zeamays) >
洋蓟、芦笋、椰菜、孢子甘蓝、卷心菜、油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣绿甘蓝、亚麻、羽衣甘 蓝、小扁豆、油料种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番 茄、squash tea、树、草(包括饲料草)和藻类等。根据本发明优选的特性，植物是农作物植物，如浮游植物、大豆、向日葵、油菜、油 菜籽、棉花、苜蓿、番茄、土豆、莴苣、烟草、木瓜、南瓜、杨树、桉树、松树、leguminosa、亚麻、 lupinus和高梁。根据本发明更优选的实施方案，所述植物是单子叶植物，如甘蔗、洋葱或竹 子。进一步优选的植物是谷类，如稻、玉米(包括饲料玉米)、小麦、大麦、粟、燕麦和黑麦。术语“DP”意指E2F 二聚化配偶体。如名称所示，DP蛋白质能够与E2F/DEL转录因 子二聚化。这可以通过，例如，如Magyar等人，2000 (FEBSletters，486 :79_97)所述的双杂 交测定或通过免疫沉淀检测。Magyar等人报道了典型的DP蛋白质的结构特性，其在此处完 整引入作为参考。例如，Magyar等人的图3A和B显示在拟南芥DP蛋白质中的特征性DNA 结合结构域和二聚化结构域的位置。Vand印oele等人，2002 (Plant Cell 14(4) 903-16) 的图5很好地说明由于存在一个DNA结合结构域和一个二聚化结构域，DP蛋白质与相关的 蛋白质，如E2F因子和DEL不相同。图3显示在拟南芥(Arabidopsis thaliana)DPb序列 中这些结构域的位置。本领域的技术人员基于可获得的知识将能够容易地鉴别DP蛋白质。根据本发明优选的特性，DP蛋白质由SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 2的同源物代表 这类同源物的具体实例包括Magyar等人，2000 (FEBS，486(1) :79_87)所述的拟南芥DP蛋 白质、Ramirez-Parra 和 Gutierrrez，2000 (FEBS，86(1) :73_8)所述的普通小麦(Triticum aestivum)DP蛋白质和以Du Pont名称公布的国际专利申请W099/53075中的凤仙花属 (Impatiens)、大豆和玉米的DP蛋白质。优选地，本文所定义的DP蛋白质或其同源物指与DP蛋白质，例如，与SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23中任一个具有一定的序列同一性的多肽，所述序列同一性按照 增加的优选顺序为至少 40 %、41 %、42 %、43 %、44 %、45 %、46 %、47 %、48 %、49 %、50 %、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%, 66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%或 99%。如Vand印oele 等人，2002 (Plant Cell 14 (4) :903_16)所示，可以将拟南芥的 DP 蛋白质细分为两个不同类别，DPa和DPb。本文所用的术语“同源物”也包括两类成员。在 本发明的方法中可以方便地使用这些不同类别的DP蛋白质或其编码核酸。用于本发明方法中的DP核酸或DP蛋白质优选获自从植物，优选来自双子叶植 物，进一步优选来自十字花科(Brassicaceae)，更加优选地来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)。根据另一实施方案，DP多肽是DPb多肽。“DPb”指相对于AtDPa更接近于AtDPb 的蛋白质。可以如下文所述通过计算序列同一性百分数，或者通过建立保守基序的存在来
8将查询序列分类为DPa或是DPb。鉴别查询序列为DPa或DPb的另一方法是将查询序列导 入系统树，如在图5所示的那个。相对于AtDPa，DPb蛋白质应该聚类更接近于AtDPb。用于本发明方法中优选的DP多肽或同源物是与DP蛋白质，例如，与SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的DP蛋白质中任一个具有一定序列同一性的那些，所述 序列同一性按照增加的优选顺序为至少40%A1%A2%A3%A4%A5%A6%A7%, 48%,49%,50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。可以经由一般存在于所有DP蛋白质中的保守 区计算百分数同一性。这一区域从残基CEKVES (如从SEQ ID N02的位置111)附近开始至 FVLKTM(如，到SEQ ID NO 2的位置290)附近；见图3。在DP蛋白质亚类中有三个基序是特别保守的，所述亚类包括拟南芥的DPb。在 这里由 SEQ ID NO 9(基序 1，LDIXXDDA)、SEQ ID NO 10 (基序 2，KKKK/RR)和 SEQ ID NO 11 (基序3，AXGXDK)代表这些“DPb”基序的共有序列(见图3)。优选地，本发明方法中使用的DP多肽或同源物中存在这些基序。图3显示具有 “DPb”基序位置的DP蛋白质的比对。由该比对所见，精制共有序列是可能的。例如，在基 序1的位置4有Q或H残基的高概率，并且在位置5有G或A残基的高概率。同样地，在基 序3的位置2有V、T或A残基的高概率，并且在位置4有P或A残基的高概率。本领域技 术人员将认识到SEQ ID NO 9、10或11所代表的DPb基序，其可以通过例如1或2个错配 与共有的DPb基序而不同，但没有任何功能损失。还可以使用上述新鉴别的“DPb”基序搜索数据库，并鉴别同源的DPb多肽和编码 序列。蛋白质结构域、基序和盒的鉴别在本领域技术人员的范围内将是容易做到的。 可以通 PRODOM(http://www. biochem. ucl. ac. uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj. html)、PIR(http://pir. georgetown. edu/)、PR0SITE (http://au. expasy. org/PROSITE/) 或pFAM(http://pFAM.mistl.edu/)数据库获得蛋白质结构域信息。为这类结构域搜索而 设计的软件程序包括，但不限于 MotifScan、MEME, SIGNALSCAN 和 GENESCAN。MotifScan 是优选的软件程序并且可获自http://hits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN,该程序使用 PR0SITE和pFAM的蛋白质结构域信息。MEME算法(版本3. 0)可以在GCG程序包或在 http //www. sdsc. edu/MEME/meme 找到。SIGNALSCAN 版本 4. 0 可获自 http //biosci. cbs.umn.edu/software/sigscan.html。 GENESGAN 可 在 http://gnomic. Stanford, edu/ GENESCANW. html 找到。DP多肽或同源物可以在(公共的)序列数据库中找到。DP蛋白质同源物在序列数 据库中比对和鉴别的方法是本领域公知的。这些方法涉及使用由本发明提供的序列，例如 SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23(或SEQ ID NO 1)筛选序列数据库。用于序列比对 和比较的不同的搜索算法和软件是本领域众所周知的，并且包括例如GAP、BESTFIT、BLAST、 FASTA和TFASTA。优选使用计算序列同一性百分比并进行序列之间相似性统计分析的 BLAST软件。被称为BLAST程序的程序组具有5个不同的执行程序三个为核苷酸序列查询 而设计(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)，两个为蛋白质序列查询而设计(BLASTP和TBLASTN)(Coulson, Trends in Biotechnology 76~80,1994 ；Birren 等人，GenomeAnalysis, 1 543,1997) 0用于进行BLAST分析的软件可以公开获自生物技术信息国家中心。有用的序 列数据库包括，但不限于 Genbank(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/web/Genbank)、欧洲分 子生物实验室核酸数据库(EMBL) (http:/w. ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)或它的 译本或 MIPS 数据库(http //mips. gsf. de/)。用于本发明方法中的优选DP多肽具有与SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23 中任一个至少40%序列同一性。可以使用配对全球比对程序执行Needleman-Wunsch算法 (J. Mol. Biol. 48 =443-453,1970)来计算序列同一性百分数，该算法最大化配对数且最小 化空位数。为了计算上述百分数，可以使用具有空位开放罚分为10并且空位延伸罚分为 0. 1的程序needle(EMB0SS包)。对于蛋白质，优选使用具有字长为3的blosum62矩阵。对 于核酸，使用由EMBOSS包提供的，字长为11的矩阵“DNA-full”。Needleman-Wunsch算法 最适于从蛋白质的全长上分析相关的蛋白质序列。备选地，可以在如以上提到的保守区、结 构域或基序中进行计算，分析相关的蛋白质，并确定如以上提到的序列同一性百分数。符合“DP多肽或其同源物”定义的多肽的实例是拟南芥DPb (SEQID NO 2和对应的 编码序列SE ID NO 1)。在图3中给出了 SEQ ID NO 12到23代表的DP蛋白质的其他实 例，以及它们的Genbank登录号、它们的编码序列和它们的蛋白质序列。目前可在公共数据 库如Genbank获得拟南芥和稻(Oryza sativa)的基因组序列，并且正在测序其他基因组。 因此，期望使用程序BLASTX或BLASTP或其他程序，通过与SEQ ID NO 1到4或12到23中 任一个进行序列比对，可以容易地鉴别更多的同源物。尽管其可能呈现“至少40 %同一性”的相对低序列同源性，DP蛋白质都具有DNA结 合结构域和二聚化结构域，是高度保守的。应该理解的是，术语DP多肽或其同源物不限于 由SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的序列，而是具有DP特征性特点，即⑴二 聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构 域的任何多肽，所述多肽可以用于本发明的方法。具有这类特性的DP多肽保留了 DP蛋白 质的相似功能活性和/或生物活性，或至少部分的功能活性和/或生物活性。生物活性是 当蛋白质处于其天然环境下的活性。可以通过，例如在Magyar等人，2000 (FEBS letters, 486 79-97)所述的双杂交或使用免疫共沉淀检测二聚化活性(即，DP与E2F转录因子二聚 化的能力)。DP多肽/蛋白质或其同源物是由“DP编码核酸”或由“DP编码基因”编码；该术 语在此可互换使用，并意指编码上述DP多肽或其同源物的核酸。DP编码核酸的实例包括由 SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一个代表的那些。DP的编码核酸及其功能变体 可用于实施本发明的方法。DP编码核酸的功能变体包括这类核酸的部分和/或能够与DP 编码核酸杂交的核酸。用于本发明方法中的功能变体(部分或杂交序列)是编码多肽的那 些，所述多肽具有DP特征性特点，S卩(i) 二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化 结构域)和(ii)结合DNA的DNA结合结构域，所述功能变体可以用于本发明的方法中。本文所用的术语部分指包含至少80个核苷酸的DNA片段，并且该部分编码的多肽 具有DP的特征性特点，S卩(i) 二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域) 和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。这些部分可以用于本发明的方法。可以例如通过对 DP编码核酸进行一个或多个缺失来制备所述部分。所述部分优选地是SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一个代表的核酸的部分，并且该部分符合上述要求。DP编码核酸的另一功能变体是能够与DP编码核酸杂交，优选在严格条件下杂交 的核酸。本文定义的这类杂交序列在长度上是至少80个核苷酸并且编码的多肽具有DP特 征性特点，即(i) 二聚化活性(其属于部分，或优选属于整个二聚化结构域)和(ii)结合 DNA的DNA结合结构域。这类杂交序列可以用于本发明的方法。所述杂交序列优选能够与 SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一个代表的核酸杂交，并且该杂交序列符合上述 要求。本文所用的术语“杂交”意指在杂交过程中与基本同源的互补核酸序列的退火。杂 交过程可以完全发生在溶液中，即两条互补核酸都在溶液中。杂交过程还可以如此进行，即 其中互补核酸之一固定于基质如磁珠、琼脂糖凝胶珠子或任何其它树脂上。此外杂交过程 可还可以如此进行，即其中互补核酸之一固定于固相支持物如硝化纤维素膜或尼龙膜上， 或通过例如照相平版印刷术固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者称之为核酸阵列或微阵 列，或称之为核酸芯片)。为了使得杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双 链解链成两条单链和/或从单链核酸中除去发夹或其它二级结构。杂交的严格性受诸如温 度、盐浓度和杂交缓冲液组成条件等的影响。在简化的严格条件，优选地在严格条件下进行杂交。杂交的严格性受诸如温度、盐 浓度和杂交缓冲液组成条件等的影响。在简化的严格条件，优选地在严格条件下进行杂交。 严格条件的实例如下表1所示严格条件是那些至少如，例如条件A-L的严格性；并且简化 的严格条件是至少如，例如条件M-R的严格性。表1 杂交和洗涤条件的实例
1权利要求
相对于对应的野生型植物，改良植物生长特性的方法，其包括在植物茎干组织中特异性增加DP多肽或其同源物的活性，和/或增加植物茎干组织中DP编码基因或其功能变体的表达，以及任选选择具有改良生长特性的植物。
2.根据权利要求1的方法，其中优选在编码DP多肽或其同源物的基因座上引入遗传修 饰来实现所述增加活性和/或增加表达。
3.根据权利要求2的方法，其中通过定点诱变、定向进化、同源重组、TILLING、T-DNA激 活中的任一种或多种，以及通过将编码DP多肽或其同源物的DP编码核酸或其功能变体导 入植物来实现所述遗传修饰。
4.相对于对应的野生型植物，改良植物生长特性的方法，其包括将DP编码核酸或其功 能变体导入植物，并在茎干组织中特异性表达。
5.根据权利要求4的方法，其中所述功能变体是部分DP编码核酸，或者能够与DP编码 核酸杂交的序列，其中所述功能变体编码的多肽具有(i)属于部分，或优选属于整个二聚 化结构域的二聚化活性；和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。
6.根据权利要求1到5中任一项的方法，其中所述DP编码核酸或其功能变体，或DP多 肽或其同源物是植物来源的，优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，进一步优选来自 拟南芥。
7.根据权利要求1到6中任一项的方法，其中所述DP编码核酸是(i)包括SEQID NO 1、3、12、14、16、18、20或22，或其中任一个序列的功能变体的核 酸，其中所述核酸或功能变体编码的多肽包含(i)属于部分，或优选属于整个二聚化结构 域的二聚化活性；和( )结合DNA的DNA结合结构域；或(ii)编码SEQID NO 2、4、13、15、17、19、21或23代表的蛋白质，或编码其中任一个序 列的同源物的核酸，其中所述蛋白质或同源物包含(i)属于部分，或优选属于整个二聚化 结构域的二聚化活性；和(ii)结合DNA的DNA结合结构域。
8.根据权利要求4到7中任一项的方法，其中所述核酸或其功能变体在启动子的控制 下，能够在茎干组织中特异性表达所述DP编码核酸。
9.根据权利要求8的方法，其中所述启动子具有与β扩展蛋白启动子相当的表达谱。
10.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中相对于对应的野生型植物，所述改良的 植物生长特性是增加的生物量。
11.根据权利要求1到10中任一项的方法，其中相对于对应的野生型植物，所述改良的 植物生长特性是增加的产量，特别是增加的种子产量。
12.根据权利要求1到11中任一项的方法，其中相对于对应的野生型植物，所述改良的 植物生长特性是增加的生长速率。
13.根据权利要求1到12中任一项的方法，其中所述改良的植物生长特性是改变的构 造，特别是分蘖或对应植物部分的增加的数量、尺寸、形状中的一个或多个；枝条和/或叶 的增加的量。
14.根据权利要求1到13中任一项的方法，其中所述植物是单子叶植物。
15.根据权利要求1到14中任一项的方法获得的植物。
16.遗传构建体，其包括(a) DP编码核酸或其功能变体；(b)能够在茎干组织中驱动核酸(a)表达的一个或多个转录控制序列；及任选的(c)转录终止序列。
17.根据权利要求13的遗传构建体，其中所述控制序列能够在幼生茎干组织中特异性 表达所述DP编码核酸。
18.根据权利要求16或17的遗传构建体，其中所述控制序列是具有与β扩展蛋白启 动子相当的表达谱的启动子。
19.转基因宿主细胞，其包含权利要求16到18中任一项所定义的遗传构建体。
20.转基因植物或植物的部分，其包含权利要求16到18中任一项所定义的遗传构建体。
21.相对于对应的野生型植物，产生具有改良生长特性的转基因植物的方法，所述方法 包括(a)将根据权利要求16到18中任一项的遗传构建体导入植物细胞；(b)在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
22.相对于对应的野生型植物，具有改良生长特性的转基因植物，所述改良生长特性由 导入所述植物的，在茎干特异性启动子控制下的DP编码核酸或其功能变体产生。
23.根据权利要求15、19、20或22的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物，如甘蔗 或谷类，如稻、小麦、大麦、玉米、粟、黑麦、燕麦或高梁。
24.权利要求15、19、20、22和23中任一项所定义的植物的部分，优选可收获部分，例如 植物的种子或无性繁殖体。
25.权利要求15、19、20、22、23和24所定义的植物的后代，其中所述后代与其来源的亲 本植物呈现一种或多种相同的基因型特性。
26.直接来源于权利要求15、19、20、22、23到25中任一项所定义的植物或后代的产物。
27.在茎干特异性启动子控制下，DP编码核酸或其功能变体用于改良植物生长特性的 用途，所述植物生长特性选自以下一种或多种增加植物生物量、增加产量、增加种子产量、 改变植物构造和增加生长速率。
全文摘要
本发明涉及通过增加茎干组织中DP蛋白质的活性或通过增加植物茎干组织中DP编码基因的表达来改良植物生长特性的方法。本发明还涉及由本发明方法产生的，具有改良生长特性的转基因植物。
文档编号A01H1/00GK101946714SQ20101027418
公开日2011年1月19日 申请日期2005年5月30日 优先权日2004年5月28日
发明者C·鲁兹, V·弗兰卡德 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司