专利名称：一种抗香蕉枯萎病微生态菌剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种抗香蕉枯萎病微生态菌剂及其制备方 法。
背景技术：
香蕉枯萎病被称为香蕉的“癌症”，是典型的土传病害，病原菌为古巴尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cubense, FOC)。由于化学防治效果不理想、易产生抗性、污 染环境等缺点，采取生物防治香蕉枯萎病已逐步成为了枯萎病防治的新方向。枯草芽孢杆菌是一种嗜温性、好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，其分布广泛，极 易分离培养，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生耐热抗逆的芽孢。目前该菌已经在黄瓜、 辣椒、水稻、小麦、玉米等农作物上显出很好的病害防治效果。该菌批量生产工艺简单，成本 也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。目前用枯草芽孢杆菌制备生防制 剂防治植物病害的研究已成为国内外研究的热点，有关枯草芽孢杆菌在植物生物防治上的 应用报道很多，而发酵条件方面的研究较少。
发明内容
本发明提供了一种抗香蕉枯萎病微生态菌剂及其制备方法，并以提高其抑菌活性 为目标，优化了该枯草芽孢杆菌的液体发酵培养基配方和发酵条件，降低成本，提高效价， 发酵完成后可作为一种抗香蕉枯萎病微生态菌剂，为枯草芽孢杆菌在生物防治方面的进一 步开发和应用提供了依据。本发明的抗香蕉枯萎病微生态菌剂为枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液的发酵培养 基配制为玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10% (重量比);豆粕、黄豆粉、麸皮或牛肉膏1-10% (重量比)；水1000ml ；PH6-9 ；在121°C下高压灭菌30min。所述抗香蕉枯萎病微生态菌剂的制备步骤如下 (1)枯草芽孢杆菌液体发酵培养基配制
玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10%(占水的重量比);豆粕、黄豆粉、麸皮或牛肉膏1-10% (占水的重量比)；水1000ml ；PH6-8 ；在121°C下高压灭菌30min。(2)枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌菌株活化后接种到细菌液体发酵培养基中，置于25-35°C、100-200r/ min条件下震荡培养10-50h ；所述细菌液体发酵培养基为牛肉膏-蛋白胨培养基。( 3 )枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将枯草芽孢杆菌种子液接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量1-10% (v/v), 在温度20-30°C下培养10-50h ；
(4)收集
发酵完成后收集枯草芽孢杆菌发酵液；
(5)检测
用平板计数法测定生物量，用打孔法检测抑菌效果。
步骤(2)所述的活化在细菌培养斜面上活化，活化时间24h ；所述细菌培养斜面的 配制如下牛肉膏5 g, NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2。步骤(2)所述接种为菌株活化后挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体发
酵培养基中。本发明的抗香蕉枯萎病微生态菌剂的抑菌效果通过用平板计数法测定生物量，用 打孔法检测抑菌效果；
所述的打孔法步骤如下
将香蕉枯萎病病原菌以划线法接种到PDA培养基上，置于26°C下培养9天；从上挑 取1环孢子至10ml无菌水中，混勻，制成病原菌孢子悬液，按体积比1 :100加入冷却至 40°C -60°C的PDA培养基，倒入培养皿中；待凝固后用打孔器打孔，加入步骤(4)所述枯草芽 孢杆菌发酵液，在26°C培养72h，观察抑菌圈大小。本发明以发酵后发酵液的抑菌活性高低为标准，综合了降低成本，节约能源，简化 环节，提高效率等因素，针对枯草芽孢杆菌的生物学特性，筛选培养温度、培养条件、发酵温 度、接种量等。本发明采用的发酵培养基原料经济便宜，发酵培养基浓度、接种量、装瓶量适中， 可使发酵后产物具有较高的抗香蕉枯萎病菌活性。采用的发酵培养基配方和发酵条件可使 发酵产物具有良好的抑菌活性，且成本较低；采用的检测方法快速方便，可获得直接明了的 检测结果。本发明的显著优点
1、常见枯草芽孢杆菌液体发酵所用的培养基大多以牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等为主，生 产成本较高，本发明选用的发酵培养基为淀粉、玉米粉、豆粕、黄豆粉等农产品，容易获得且 价格经济便宜；
2、发酵培养基浓度、接种量、装瓶量适中，可使发酵后产物具有较高的抗香蕉枯萎病菌 活性。3、本发明以发酵后发酵液的抑菌活性高低为标准，综合了降低成本，节约能源，简 化环节，提高效率等因素，针对枯草芽孢杆菌的生物学特性，筛选出优化的培养温度、培养 条件、发酵温度、接种量等。
具体实施例方式以下为本发明的几个具体实施案例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
糖蜜0. 5%，牛肉膏1%，水1000ml ；pH7. 5 ；55ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭 菌 30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS12菌株(保存在福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室) 在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于 28°C、160r/min条件下震荡培养24h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
4将CS12种子液接种到发酵培养基中(接种量5%)，30°C、180r/min条件下震荡培养50h。4、发酵完成后收集发酵液。5、检测
平板计数法测定生物量。打孔法检测抑菌效果将香蕉枯萎病病原菌福建4号生理小种(FJ4)以划线法接 种到PDA培养基上，置于26°C下培养9天；从上挑取1环孢子至10ml无菌水中，混勻，制成 FJ4孢子悬液，再以1 :100的比例加入熔化后冷却至45°C左右的PDA中，倒入培养皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS12发酵液，在26°C培养72h，观察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 径在19mm-22mm范围内，说明发酵液具有较高的抑菌活性。6、瓶装或桶装成成品。实施例2
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
玉米粉0. 5%，豆粕1%，水1000ml ；pH7. 0 ；50ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭 菌 30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS18菌株(保存在福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室) 在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于 30°C、180r/min条件下震荡培养24h。4、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS18种子液接种到发酵培养基中(接种量4%)，30°C、180r/min条件下震荡培养10h。5、发酵完成后收集发酵液。6、检测
平板计数法测定生物量。打孔法检测抑菌效果将香蕉枯萎病病原菌福建4号生理小种(FJ4)以划线法接 种到PDA培养基上，置于26°C下培养9天；从上挑取1环孢子至10ml无菌水中，混勻，制成 FJ4孢子悬液，再以1 :100的比例加入熔化后冷却至45°C左右的PDA中，倒入培养皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS18发酵液，在26°C培养72h，观察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 径在19mm-22mm范围内，说明发酵液具有较高的抑菌活性。实施例3
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
蔗糖0. 4%，黄豆粉1. 2%，水1000ml ；pH7. 6 ；45ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压 灭菌30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS16菌株(保存在福建省农科院土壤肥料研究所农业微生物研究室) 在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体培养基中，置于 30°C、180r/min条件下震荡培养28h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS16种子液接种到发酵培养基中(接种量6%)，20°C、200r/min条件下震荡培养25h。4、发酵完成后收集发酵液。
5、检测
平板计数法测定生物量。打孔法检测抑菌效果将香蕉枯萎病病原菌福建4号生理小种(FJ4)以划线法接 种到PDA培养基上，置于26°C下培养9天；从上挑取1环孢子至10ml无菌水中，混勻，制成 FJ4孢子悬液，再以1 :100的比例加入熔化后冷却至45°C左右的PDA中，倒入培养皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS16发酵液，在26°C培养72h，观察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 径在19mm-22mm范围内，说明发酵液具有较高的抑菌活性。实施例4
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
玉米粉10%，豆粕9%，水1000ml ；pH8 ；45ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭菌 30mino2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS16菌株在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三 角瓶细菌液体培养基中，置于35°C、180r/min条件下震荡培养28h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS16种子液接种到发酵培养基中(接种量10%)，28°C、200r/min条件下震荡培养
50h。4、发酵完成后收集发酵液。实施例5
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
玉米粉5%，豆粕6%，水1000ml ；pH6 ；45ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭菌 30mino2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS16菌株在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三 角瓶细菌液体培养基中，置于25°C、180r/min条件下震荡培养28h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS16种子液接种到发酵培养基中(接种量1%)，28°C、200r/min条件下震荡培养24h。4、发酵完成后收集发酵液。实施例6
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
玉米粉0. 1%，豆粕1%，水1000ml ；pH6. 5 ；45ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭 菌 30min。2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS16菌株在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三 角瓶细菌液体培养基中，置于25°C、180r/min条件下震荡培养28h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS16种子液接种到发酵培养基中(接种量1%)，28°C、200r/min条件下震荡培养10h。4、发酵完成后收集发酵液。实施例71、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
淀粉1%，豆粕1%，水1000ml ；pH6. 5 ；45ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭菌 30mino2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS16菌株在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三 角瓶细菌液体培养基中，置于28°C、180r/min条件下震荡培养28h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS16种子液接种到发酵培养基中(接种量1%)，26°C、200r/min条件下震荡培养20h。4、发酵完成后收集发酵液。实施例8
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
糖蜜1%，麸皮5%，水1000ml ；pH7 ；45ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭菌 30mino2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS16菌株在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三 角瓶细菌液体培养基中，置于25°C、180r/min条件下震荡培养28h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS16种子液接种到发酵培养基中(接种量1%)，29°C、200r/min条件下震荡培养30h。4、发酵完成后收集发酵液。实施例9
1、枯草芽孢杆菌发酵培养基制备
蔗糖0. 5%，豆粕5%，水1000ml ；pH6 ；45ml/250ml的三角瓶装量，在121°C下高压灭菌 30mino2、枯草芽孢杆菌种子液制备
将枯草芽孢杆菌CS16菌株在细菌培养斜面上活化24h，挑两环接种到50ml/250ml的三 角瓶细菌液体培养基中，置于25°C、180r/min条件下震荡培养28h。3、枯草芽孢杆菌摇瓶发酵
将CS16种子液接种到发酵培养基中(接种量1%)，27°C、200r/min条件下震荡培养18h。4、发酵完成后收集发酵液。
权利要求
一种抗香蕉枯萎病微生态菌剂，其特征在于所述抗香蕉枯萎病微生态菌剂为枯草芽孢杆菌发酵液，该发酵液的发酵培养基配制为玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1 10%(重量比)；豆粕、黄豆粉、麸皮或牛肉膏1 10%(重量比)；水1000ml；pH6 9；在121℃下高压灭菌30min。
2.一种抗香蕉枯萎病微生态菌剂的制备方法，其特征在于所述制备方法的具体步骤 如下(1)枯草芽孢杆菌液体发酵培养基配制玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10% (重量比)；豆粕、黄豆粉、麸皮或牛肉膏1-10% (重 量比)；水1000ml ；PH6-9 ；在121°C下高压灭菌30min ；(2)枯草芽孢杆菌种子液制备将枯草芽孢杆菌菌株活化后接种到细菌液体发酵培养基中，置于25-35°C、100-200r/ min条件下震荡培养10-50h ；所述细菌液体发酵培养基为牛肉膏-蛋白胨培养基；(3)枯草芽孢杆菌摇瓶发酵将枯草芽孢杆菌种子液接种到枯草芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量1-10% (v/v), 在温度20-30°C下培养10-50h ；(4)收集发酵完成后收集枯草芽孢杆菌发酵液即为抗香蕉枯萎病微生态菌剂。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的活化是在细菌培养斜 面上活化，活化时间24h。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述细菌培养斜面的配制如下牛肉 膏 5 g, NaCl 5 g，蛋白胨 10 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.2。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述接种为菌株活化后挑两 环接种到50ml/250ml的三角瓶细菌液体发酵培养基中。
全文摘要
本发明提供了一种抗香蕉枯萎病微生态菌剂及其制备方法。所述抗香蕉枯萎病微生态菌剂发酵液的发酵培养基为玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10%；豆粕、黄豆粉、麸皮或牛肉膏1-10%；水1000ml；pH6-9。通过制备枯草芽孢杆菌种子液，接种到发酵培养基中培养；发酵完成后收集枯草芽孢杆菌发酵液。本发明采用的发酵培养基原料经济便宜，发酵培养基浓度、接种量、装瓶量适中，可使发酵后产物具有较高的抗香蕉枯萎病菌活性。采用的发酵培养基配方和发酵条件可使发酵产物具有良好的抑菌活性，且成本较低；采用的检测方法快速方便，可获得直接明了的检测结果。
文档编号A01P3/00GK101911954SQ201010274100
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月7日 优先权日2010年9月7日
发明者张慧, 林戎斌, 林新坚, 林陈强, 白丹红, 蔡海松, 陈济琛 申请人:福建省农业科学院土壤肥料研究所