专利名称：一串红植株的再生方法
技术领域：
本发明属于农业领域，特别涉及一串红通过愈伤组织获得再生植株的方法。
背景技术：
一串红(Salvia splendens Ker-Gawl)属于唇形科(Labiatae)，鼠尾草属(Salvia L)多年生草本植物，原产南美洲热带地区，现在中国各地普遍栽培，常作一年生栽培。一 串红以其生长周期短、植株矮壮、适应性强、花色艳丽等特点，被广泛用来布置城市广场、花 坛、花境、道路、庭院等，而且其花萼、花冠的红艳色泽为其他花草所不及，宜与浅色花卉配 合布置，是中国节日里装点环境、烘托节日喜庆气氛的最为常用的红色草花(李凤兰等，东 北农业大学学报,2008，39 (8) :131-135)。当前生产上一串红颜色比较单一，只有红色系、白色系和紫色系，而且我国一串红 主要应用在“五一”至“十一”期间，这期间我国南方的大部分省份温度远超过一串红的生长 适温，由于受种质资源和其它条件的限制，目前我国还没有抗高温的专用一串红品种，因此 如果要提高一串红的园林利用价值，就必须培育出新的花色和抗逆性好的一串红品种。利 用遗传改良培育观赏植物新品种是减轻环境胁迫条件对花卉观赏品质不利影响的有效措 施，也是改变观赏植物花色、提高观赏品质的一条捷径。目前常用的植物转基因方法较成熟 的还是通过农杆菌介导，但通过农杆菌介导，植物必须建立起通过愈伤组织途径获得再生 植株的再生体系。因此，建立稳定的一串红组织培养再生体系则是开展一串红遗传转化的 基础，目前，通过茎段、叶片、根尖等外植体诱导愈伤组织及其分化这一途径获得再生植株 的机率相当低，只是偶然性，有时甚至得不到分化苗(杨晓红等，2007，12，农业科技通迅)， 因此难以满足外源基因的遗传转化要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种一串红通过愈伤组织途径获得再生植株的 方法，采用该方法能获得大量的一串红再生植株，今后可用于一串红外源基因的遗传转化。为了解决上述技术问题，本发明提供一种一串红植株的再生方法，依次包括以下 步骤1)、一串红种子消毒2)、无菌培养将消毒后的一串红种子接种在MS固体基本培养基上进行无菌培养22 ^h，培养 条件25士 1°C，暗培养；3)、愈伤组织的诱导将无菌培养后所得的种子纵切成两半，然后去掉种皮后切面朝下接种于诱导愈伤 培养基上培养15 20天，培养条件25 士 1°C，暗培养；4)、愈伤组织继代1 2次将步骤幻所得诱导后产物(包括愈伤组织和长大的子叶等)接种在另一份新的诱导愈伤培养基上继代1 2次，每次15 20天(直至子叶边缘有较多愈伤组织出现为 止)，培养条件25 士 1°C，弱光培养，光照强度为50 IOOmol m_2 · s—1 ；得继代后愈伤组织；5)、愈伤组织的分化选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织(即选取较为膨松、且质地较硬无 玻璃化的继代后愈伤组织)转接到分化培养基上进行不定芽的分化，直至长出3 5cm的 不定芽；培养条件25士 1°C，需光培养，光照强度为200 300mol m_2 · s"1 ；6)、再生苗的生根培养割取步骤幻所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小 苗上长出至少3条且长度> 2cm的不定根；得到可出瓶移栽的种苗；培养条件25士 1°C，需 光培养，光照强度200-300mol m_2 · s—1 ；上述步骤1) 步骤6)均在无菌环境中进行。作为本发明的一串红植株的再生方法的改进MS固体基本培养基为MS基本培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L ；pH值为 5. 7 5. 9 ；诱导愈伤培养基为1/2MS基本培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+6_BA 0. 8 1. 2mg/L+2，4-D 1. 8 2. 2mg/L+水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+脯氨酸 0. 4 0. 6g/L, PH值为5. 7 5. 9; 分化培养基为1/2MS基本培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+TDZ 1. 8 2. 2mg/L+KT 0. 8 1. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 0. 6g/L，pH 值为 5. 7 5. 9 ；生根培养基为1/2MS固体培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+NAA 0. 4 0. 6mg/L, pH值为5. 7 5. 9作为本发明的一串红植株的再生方法的改进步骤1)的消毒 为在无菌操作台上，选取一串红优质种子放置于带有过滤网的球状壳体内，先用质量浓度 75%酒精消毒lmin，然后用无菌蒸溜水洗3次，再用质量浓度0. 1% HgCl2溶液消毒8min， 最后用无菌蒸溜水冲洗3次。在本发明中6-BA 6-苄氨基腺嘌呤，6_Benzylaminopurine ；2，4-D :2，4_ 二氣苯氧乙酸，2，4-dichlorophenoxyacetic acid ；TDZ 噻苯隆，thidiazuron ；KT :6-HMSBln^,6-Furfurylamino purine ；；NAA :1-萘乙酸。本发明采用成熟的一串红种子为外植体，通过诱导种子成熟胚产生愈伤组织并分 化形成不定芽可以获得大量一串红再生植株；本发明较好地解决了一串红通过愈伤组织难 以获得再生植株的技术难题。本发明的一串红植株的再生方法，能为通过转基因技术来进 行一串红育种提供技术支持。采用本发明的方法，步骤5)的愈伤组织分化所需培养时间约为20 25天，步骤 6)的再生苗生根培养所需培养时间约为10 20天；因此一般仅需60 80天即可得到可 出瓶种植的种苗。本发明通过种子诱导愈伤组织及其分化这一途径获得再生植株的机率为70%以上，远远高于现有技术的偶然性。本发明的一串红植株的再生方法，是一种不受季节等因素影响，能高效、快速提供 大量一串红再生苗的方法，该方法可为今后大规模工厂化生产一串红种苗和通过转基因等 生物技术手段进行一串红品种改良提供技术支持。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1为本发明的步骤1中所用的消毒灭菌用装置。
具体实施例方式实施例1、一串红植株的再生方法，依次进行以下步骤注以下步骤中所用的培养瓶、培养基(配制完成后)、蒸馏水以及一串红种子的 消毒灭菌用装置等要在使用前进行灭菌，灭菌条件在1. 1个大气压、121°c条件下灭菌20 分钟。1)、一串种子的消毒在超净工作台上，选取一串红品种优质种子100 150粒放置于如图1所示的消 毒灭菌用装置内，该消毒灭菌用装置由2个半球状的壳体1组合而成，半球状的壳体1上设 有过滤网2。该消毒灭菌用装置可通过市购方式获得。先用质量浓度75%酒精消毒Imin后用无菌蒸馏水洗3次，再用质量浓度0. 1% HgCl2溶液消毒8min，消毒完后再用无菌蒸溜水冲洗3次。由于一串红种子在水中浸泡后会迅速在表面形成较粘的凝胶物质，这些凝胶物质 严重影响一串红种子的灭菌效果，因此选用上述装置可以使一串红种子消毒充分且易于冲 冼。2)、无菌培养将消毒后的一串红种子于MS固体基本培养基上进行无菌培养Mh，培养条件: 25 士 1°C，暗培养；MS固体基本培养基为MS基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH值为5. 8 ；其制 备方法如下在IL MS基本培养基内加入琼脂7g和蔗糖30g，利用lmol/L的KOH或lmol/ L的HCl调节pH为5.8。3)、愈伤组织的诱导将步骤2)无菌培养后所得的种子纵切成两半，去掉种皮后切面朝下接种于诱导 愈伤培养基上培养18天；培养条件25士 1°C，暗培养；得诱导后产物(包括愈伤组织和长 大的子叶等)；诱导愈伤培养基为1/2MS基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+6_BA lmg/L+2, 4-D 2mg/L+水解酪蛋白0. 5g/L+脯氨酸0. 5g/L，pH值为5. 8 ；其制备方法如下在IL的 1/2MS基本培养基(即大量元素减半，其他物质同MS基本培养基)内加入琼脂7g、蔗糖30g、 6-BA lmg、2，4-D 2mg、水解酪蛋白 0. 5g和脯氨酸0. 5g，利用 lmol/L 的KOH或 lmol/L 的HCl 调节PH为5. 8。4)、愈伤组织继代1次-2次
将步骤幻所得的诱导后产物(包括愈伤组织和长大的子叶等)在新的诱导愈伤 培养基上继代2次，每次15天，此时子叶边缘有较多愈伤组织出现，培养条件25士 1°C，弱 光培养(光照强度50 IOOmol πΓ2·^)；得继代后愈伤组织；该诱导愈伤培养基同步骤3) 中所用的诱导愈伤培养基。5)、愈伤组织的分化选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织(即选取较为膨松、且质地较硬无 玻璃化的继代后愈伤组织)转接到分化培养基上进行不定芽的分化，直至长出3 5cm的 不定芽(一般约为20 25天)；培养条件25士 1°C，光照强度200D 300mol πΓ2 · s—1 ；
分化培养基为1/2MS基本培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+TDZ 2mg/L+KT lmg/ L+0. 5g/L水解酪蛋白+脯氨酸0. 5g/L，pH值为5. 8 ；其制备方法如下在IL的1/2MS基本 培养基内加入琼脂7g、蔗糖30g、TDZ 2mg、KT lmg、水解酪蛋白0. 5g和脯氨酸0. 5g，利用 lmol/L 的 KOH 或 lmol/L 的 HCl 调节 pH 为 5. 8。6)、再生苗的生根培养将步骤幻所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小苗 上长出至少3条且长度> 2cm的不定根(一般需要15天左右)；得可出瓶种植的种苗。培 养条件:25士 1°C，需光培养(光照强度200 300mol m_2 · s-1)。生根培养基为1/2MS固体培养基+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+NAA 0. 5mg/L, pH值为 5. 8 ；其制备方法如下在IL的1/2MS基本培养基内加入琼脂7g、蔗糖30g和NAA 0. 5mg，利 用 lmol/L 的 KOH 或 lmol/L 的 HCl 调节 pH 为 5. 8。上述步骤1) 步骤6)均在无菌环境中进行，整个过程一般需60 80天。通过种子诱导愈伤组织及其分化这一途径获得再生植株(即可出瓶种植的种苗) 的机率为70%以上。实施例2、再生植株的驯化与移栽将实施例1所得的再生植株(即可出瓶种植的种苗)连同培养瓶从培养室内取出 放在温室内进行炼苗，此时不打开瓶盖，1周后敞开瓶口，并加入少量水(加水的量一般控 制在培养基上有一层水即可)炼苗2 3天后进行移栽，温室内的环境为25士2°C，自然光 照。在温室内对一串红再生苗进行移栽，移栽时洗去根部的培养基，将苗移栽到营养 钵中(土质为营养土和珍珠岩重量比例为8 1)。待小苗长到5cm以上高度时，带基质移 栽至6X IOcm的塑料花盆中，并放于单体棚中，单体棚的环境为自然光照，温度25-30°C。 移栽后要适当遮荫并定时浇水，成活率可达75%以上。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一串红植株的再生方法，其特征是依次包括以下步骤1)、一串红种子消毒2)、无菌培养将消毒后的一串红种子接种在MS固体基本培养基上进行无菌培养22 培养条 件25士 1°C，暗培养；3)、愈伤组织的诱导将无菌培养后所得的种子纵切成两半，然后去掉种皮后切面朝下接种于诱导愈伤培养 基上培养15 20天，培养条件25 士 1°C，暗培养；4)、愈伤组织继代1 2次将步骤幻所得诱导后产物接种在诱导愈伤培养基上继代1 2次，每次15 20天， 培养条件25士 1°C，弱光培养，光照强度为50-100mol m_2 · s—1 ；得继代后愈伤组织；5)、愈伤组织的分化选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分 化，直至长出3 5cm的不定芽；培养条件25 士 1°C，需光培养，光照强度为200 300mol m_2 · s—1 ；6)、再生苗的生根培养割取步骤幻所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小苗上 长出至少3条且长度> 2cm的不定根；得到可出瓶移栽的种苗；培养条件25士 1°C，需光培 养，光照强度200 300mol m_2 · s-1 ；上述步骤1) 步骤6)均在无菌环境中进行。
2.根据权利要求1所述的一串红植株的再生方法，其特征是所述MS固体基本培养基为MS基本培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖观 32g/L ；pH值 为 5. 7 5. 9 ；所述诱导愈伤培养基为1/2MS基本培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+6_BA 0. 8 1. 2mg/L+2，4-D 1. 8 2. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 0. 6g/L, PH值为5. 7 5.9 ；所述分化培养基为1/2MS基本培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+TDZ 1. 8 2. 2mg/L+KT 0. 8 1. 2mg/L+ 水解酪蛋白 0. 4 0. 6g/L+ 脯氨酸 0. 4 0. 6g/L，pH 值为 5. 7 5. 9 ；所述生根培养基为=IAMS固体培养基+琼脂6 8g/L+蔗糖28 32g/L+NAA 0. 4 0. 6mg/L, pH 值为 5. 7 5. 9。
3.根据权利要求2所述的一串红植株的再生方法，其特征是所述步骤1)的消毒为在无菌操作台上，选取一串红优质种子放置于带有过滤网的球状壳体内，先用质量浓度75 %酒精消毒lmin，然后用无菌蒸溜水洗3次，再用质量浓度0. 1 % HgCl2溶液消毒 8min，最后用无菌蒸溜水冲洗3次。
全文摘要
本发明公开了一串红植株的再生方法，依次包括以下步骤1)一串红种子消毒；2)无菌培养；3)将无菌培养后所得的种子纵切成两半，然后去掉种皮后切面朝下接种于诱导愈伤培养基上培养；4)将步骤3)所得诱导后产物接种在诱导愈伤培养基上继代1～2次；5)选取步骤4)所得的生长良好的继代后愈伤组织转接到分化培养基上进行不定芽的分化；6)割取步骤5)所得的不定芽作为小苗转接到生根培养基上进行生根培养；直至小苗上长出至少3条且长度≥2cm的不定根；得到可出瓶移栽的种苗；上述步骤1)～步骤6)均在无菌环境中进行。采用该方法能获得大量的一串红再生植株。
文档编号A01H4/00GK102090333SQ20101054273
公开日2011年6月15日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者傅巧娟, 刘辉, 张国平, 方献平, 沈国正, 陈一 申请人:杭州市农业科学研究院, 浙江大学