专利名称：一个水稻卷叶基因及其应用方法
技术领域：
本发明属于水稻遗传育种研究领域，具体涉及一个高育种价值水稻卷叶基因rAy 的克隆及其应用。
背景技术：
叶片的适度卷曲是水稻株型育种中的重要组成部分，在高产水稻品种的培育中具 有重要的价值，当前推广的绝大多数超级稻品种的叶片均具有一定程度的卷曲。迄今已定 位的卷叶基因有近 20 个，如..rll、rl2、rl3、rl4、rl5、rl6(t)、rl(t)、rl7、rl8、rl9(t)、R110M、 rllO(t)、rlllM、urllM、sd-sl、nal3、SLLl、NRLl 和7。但是，克隆的卷叶基因只有 3 个，即SLLl、NRL1和0sAG07。SLLl和是功能丧失性突变，为隐性遗传。基因是 功能增强性突变，由一段外源可转移的DNA片段(简称T-DNA)插入到基因的5’非 翻译区(5’ UTR)，从而造成基因的过量表达，并导致叶片卷曲。总体而言，这些卷叶 基因造成的叶片卷曲度多超过50% (叶片过分卷会减少受光面积，不利于高产)，甚至近筒状 卷曲，有的还带来叶片变窄、植株矮小等负面效应；另外，以上多数卷叶基因为隐性遗传、少 数为显性遗传，它们在纯合状态下造成叶片过卷、杂合状态下造成叶片过卷或不卷。因此， 上述绝大多数卷叶基因的育种利用价值较低。研究表明具有较高的育种利用价值，该基因来自水稻品种日本流岗卷叶粳。 通过连续多代的回交，本实验室将r/y导入我国著名的杂交水稻保持系“珍汕97B”中，获 得“珍汕97B”的近等基因系“卷叶珍汕97B”(简称JZB，叶片卷曲度约70%)”(图1_A3、B2)。 利用JZB与平展叶籼稻品种奇妙香(简称QMX)杂交，Fl杂合体的叶片表现为微卷(卷曲度 约25%)(图1-A2)，证明为不完全隐性遗传，虽然在纯合状态下可致叶片卷曲度高达 70%，但是在杂合状态下表现微卷，且未发现任何负面效应(陈宗祥等，2002，2004，2005)。利 用“珍汕97B”及其近等基因系“卷叶珍汕97B”分别与“明恢63”、“盐恢559”配制杂交组 合(杂交稻)，获得2个叶片微卷的杂交稻(卷叶汕优63和卷叶汕优559)和2个平展叶杂交 稻(汕优63和汕优559)，对这4个杂交稻设置两种施肥水平，研究rAy卷叶基因对杂交稻 产量及产量构成因素的影响(陈宗祥等，2002，2004，2005)。结果表明，正常肥力水平下，卷 叶组合秧苗期的叶龄、茎蘖数、假茎粗、苗高等指标均低于对应组合，本田前期茎蘖数上升 较缓，高峰苗较少，而最终有效穗数显著或极显著多于对应组合，平均穗粒数和千粒重稍低 于对应组合，最终结实率和单株产量显著或极显著高于对应组合，增产效应约5%。增施穗肥 处理中，各组合倒数3张叶片均显著或极显著拉长，平展叶组合的叶基角和披垂度有较明 显的增加；各组合穗粒数显著或极显著增加，千粒重降低或显著降低，平展叶组合结实率显 著或极显著降低而卷叶组合结实率变化不明显，卷叶组合极显著增产而平展叶组合增产不 显著。说明基因在高肥水平下更有利于其丰产潜力的发挥，增产效应高达11%。邵元健等(2005)采用WinQTLCart2. 5软件中的复合区间作图法以及图位定位法 将rAy定位在水稻第2染色体上的一个134kb区域。但是，至今未见该基因被更精细定位 和克隆的研究报道。
发明内容
本发明的目的是分离并克隆一个高育种利用价值水稻卷叶基因rAy，用于改良水 稻株型，提高水稻产量。利用奇妙香为轮回亲本，与卷叶珍汕97B杂交并回交的BC4F2和BC4F3两群体为研 究材料对卷叶性状进行了遗传分析。精细定位群体来自BC4F2代中度卷曲植株自交后代，共 3650个单株，进一步定位群体来自BC4F3代中度卷曲植株自交后代，共5040个单株。利用 图位克隆法对行了精细定位，精细区间内只包含一个候选基因(图2)，通过RNA干涉 实验和功能互补验证实验验证了候选基因正确性(图4、6、7)。该基因编码一个HD-GL2类转 录因子，属于homeobox基因家族，控制水稻叶片的极性发育，其表达量强弱决定叶片的卷 曲度大小(图5、8)。rl(t)基因正常表达时，表现为平展叶(亲本奇妙香卷曲度约3. 4%);表达 量增强时，叶片表现不同程度的卷曲，如F1植株(表达量微量增加)的叶片卷曲度约25%，亲 本卷叶珍汕97B (表达量增加较多)的叶片卷曲度约70% (图7);而干涉该基因让其极弱或 不表达时，叶片表现为反向卷曲(图4)。所说水稻卷叶基因它在序列的3’ UTR中存在一个点突变，与公开的水稻基 因序列不同，如SEQ ID N0:1所示。该点突变(公开序列中为G，但基因在此位置处为T)可增强基因的 表达水平，导致叶片卷曲。基于该突变点，我们开发了 基因的特异分子标记，标记 名为 RltdCAPs-2 (前引物 5，-TTTACAGTGGATTTATGTCCG-3，，后引物 5，-GCCAGAGTCAATA CCgGtAC-3’)。该分子标记特异性扩增基因3’ UTR中的一个165bp序列(如图10和SEQ ID NO :2)，包含上述的突变碱基位点，在平展叶品种中，其扩增产物可被限制性内切酶 切割为147和18bp的两个片段，但在携带基因的卷叶品种中则不能被切割。在琼脂 糖凝胶电泳中，由于18bp过小而显示不出，最终显示的卷叶和平展叶亲本的扩增产物大小 分别为165和147bp，大小存在明显差异。本发明还公开了该基因在水稻育种中的应用。该基因在水稻高产育种中增产效应 约5%-11%，其利用途径有二。第一，应用于卷叶杂交水稻的培育即利用带有基因的卷叶珍汕97B (籼稻) 或卷叶日本晴(粳稻)与水稻不育系或恢复系杂交并回交；在各回交世代，采用基于r/y基 因中的特征位点开发的分子标记(RltdCAPs-2) Mrlω基因进行辅助选择，在苗期淘汰未 带Wrt,基因的植株；通过连续多代的回交、自交和标记辅助选择，并可获得遗传稳定、综合 性状优良的新型卷叶不育系或新型卷叶恢复系；利用新型卷叶不育系与平展叶恢复系，或 新型卷叶恢复系与平展叶不育系配制杂交组合(杂交水稻)，即可获得rAy基因为杂合状态 的叶片微卷的杂交水稻。第二，通过转基因策略，采用RNA干扰或超表达技术，降低或增加推广的平展叶水 稻品种中与基因等位的基因的表达水平，可获得叶片适度反卷或正卷的水稻新材料； 考察新的卷叶材料的株叶形态和产量结构，淘汰因转基因过程中可能存在的因组培变异而 综合性状不佳的材料，可获得综合性状与原推广品种相同且遗传稳定的卷叶水稻新品系。
图1 rl(t)基因定位研究中的平展叶亲本、卷叶亲本及杂合体的叶片表型注A1 平展叶亲本的叶片表型；A2 -.rlω基因杂合状态下的植株叶片表型(微卷，卷曲 度25%);A3 -.rlM基因纯合状态下的植株叶片表型(卷曲，卷曲度70%);B1 平展叶亲本整株 表型；B2 卷叶亲本整株表型。图2卷叶基因的精细定位区间及区间内的基因释义。图3卷叶基因在3’ UTR处的1个单核苷酸差异。图4 RNAi转基因植株及对照日本晴的植株形态；
注A =RNAi植株与日本晴对照的整株形态；B =RNAi植株叶片形态(反向近筒状卷曲)。图5 RNA干扰试验中各转基因植株的W&基因的表达量分析；
注A、B分别为卷叶日本晴和平展叶日本晴，1—12为不同的RNAi转基因植株。图6 BAC质粒AP005885的双酶切(方框内为目标序列)。图7互补载体的构建过程。图8 平展叶日本晴对照及互补片段导入平展叶日本晴的转基因植株的株叶形 态；
注图A中左边植株为平展叶日本晴对照，右边为互补转基因植株；图B为互补转基因 植株，其叶片呈现微卷。图9互补试验中各转基因植株的基因的表达量分析；
注A、B分别为平展叶日本晴和卷叶日本晴，1 一 12为不同的互补转基因植株。图10是分子标记RltdCAPs-2的扩增产物序列。其中括号内的碱基为平展叶品种 和r/y基因卷叶品种之间存在的单碱基差异，平展叶中为G ；下划线的6个碱基序列为限制 性内切酶式的识别基序)。图11 利用携带r/y基因的卷叶A配制的卷叶杂交水稻。图12 分子标记RltdCAPs-2在群体中的扩增效果
注M为分子量标准；P1、P2分别为卷叶和平展叶亲本；1-10分别为F3群体中的不同植 株；第3、8泳道为双带，表示这两个个体中的r/y基因为杂合型。
具体实施例方式实施例1
因的精细定位
精细定位群体为平展叶籼稻品种“奇妙香”(轮回亲本)与“卷叶珍汕97B”的杂交和 回交的BC4F2群体，其中卷叶珍汕97B携带卷叶基因，其剑叶的平均卷曲度为70% (图 1-A3、B2)；两个品种间的杂合体Fl的剑叶表现微卷，平均卷曲度为20% (图1-A2)。BC4F2群体共包含3650个单株，进一步定位群体来自BC4F3代中度卷曲植株自交后 代，共5040个单株(中选中度卷曲单株也经标记辅助选择，卷叶基因定位区段两侧标记为 杂合带型)。选择初级定位区间两侧的分子标记INDEL112. 6和INDEL121组成双引物分析BC4F2 群体中的3650个单株的标记基因型，结果发现181个交换株，再逐步用新发展的分子标记 对这些交换株进行检测，分析这些交换株的标记基因型和表型，最终将卷叶基因位于 标记P113. 2和D120935之间，物理间距为60kb (图2-A)。更精细定位群体来自BC4F2代中微卷植株的自交后代群体(BC4F3),共5040个单株。利用双侧标记Pl 13. 2和D120935分析这5040个单株的标记基因型，同时考察各单株 叶片卷曲表型，共发现120个交换株。利用这些交换株并发展新的分子标记，发现卷叶基因 与分子标记P98255和P102241共分离，与分子标记P95053和P113. 6之间各存在1个交换 个体，表明Hw位于分子标记P95053和P113. 6之间，物理间距为Ilkb (图2-A)。2、候选基因分析及序列测定
以水稻品种日本晴全基因组测序序列为参考序列，在水稻基因组释义数据库(Rice GAAS :http://ricegaas. dna. affrc. go. jp/rgadb/)和水稻释义计划数据库(RAP-DB)中， 发现上述11 kb的定位区间内只存在1个预测基因(图2-C)，位于BAC克隆P0657H12的反 向互补链上的第98647bp至104674bp之间，基因全长为6028bp，有9个外显子，编码区全长 2415bp。基因功能为预测编码 GL2 类 homeodomain 蛋白，包含 START (The steroidogenic acute regulatory protein (StAR)-related lipid transfer domain)、homeobox禾口HALZ (Homeobox associated leucine zipper)结构域。结构域 homeobox 禾口 START 分另lj位于该 基因的第99-156氨基酸之间和第308-547氨基酸之间。基因编码产物主要在分生组织的 Ll层、叶原基、叶片、花等侧生器官的表层表达。利用该基因预测的结构信息，设计了 19对测序引物(表1)，各引物对之间的扩增 DNA片段相互重叠并覆盖了整个预测基因的启动子区域、编码区和5’非翻译区(UTR)。利 用这19对测序引物扩增获得平展叶亲本QMX和卷叶亲本JZB中的相应DNA片段，整合后获 得2个亲本中的目标基因全序列。对这2个亲本中的目标基因全序列以及测序品种日本晴 和9311中该基因的全序列进行比较分析，认为平展叶品种中该基因的3’ UTR处的碱基“T” 突变为碱基“G”是造成卷叶的关键原因(图3)，表明碱基突变后的基因序列就是卷叶基因 rl(t)的序列(SEQ ID N0:1)。表1 19对测序引物序列
权利要求
一个水稻卷叶基因rl(t)，它的碱基序列如 SEQ ID NO1所示。
2.权利要求1所述的水稻卷叶基因rAy在水稻育种中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，具体是利用带有因的卷叶珍汕97B或 卷叶日本晴与籼型或粳型不育系或者与籼型或粳型恢复系杂交并回交；在各回交世代，采 用分子标记对r/y基因进行辅助选择，在苗期淘汰未带r/y基因的植株；通过连续多代 的回交、自交和标记辅助选择，并可获得遗传稳定、综合性状优良的新型卷叶不育系或新型 卷叶恢复系；利用新型卷叶不育系与平展叶恢复系，或新型卷叶恢复系与平展叶不育系配 制杂交组合，即可获得rAy基因为杂合状态的叶片微卷的杂交水稻。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所说的采用分子标记对基因进行辅 助选择，具体是利用前引物 5，-TTTACAGTGGATTTATGTCCG-3，，后引物 5，-GCCAGAGTCAATA CCgGtAC-3’，特异性扩增基因3’ UTR中的片段，扩增产物用限制性内切酶幻ml酶切 后进行琼脂糖凝胶电泳，显示扩增产物大小分别为165bp的是携带r/y基因的品种；显示 147bp的是不携带r/w基因的品种。
5.权利要求2所述的应用，其特征在于，具体是通过转基因策略，采用RNA干扰或超 表达技术，降低或增加平展叶水稻品种中与r/y基因等位的基因的表达水平，可获得叶片 适度反卷或正卷的水稻新材料；考察新的卷叶材料的株叶形态和产量结构，淘汰因转基因 过程中可能存在的因组培变异而综合性状不佳的材料，可获得综合性状与原品种相同且遗 传稳定的卷叶水稻新品系。
全文摘要
本发明属于水稻遗传育种研究领域，具体涉及一个高育种价值水稻卷叶基因rl(t)及其应用。所说水稻卷叶基因rl(t)的碱基序列如SEQIDNO1所示。该水稻卷叶基因rl(t)在水稻育种中应用可获得遗传稳定的卷叶水稻新品系；用于改良水稻株型，提高水稻产量。
文档编号A01H5/00GK101979580SQ201010542708
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者左示敏, 张亚芳, 李磊, 潘存红, 潘学彪, 陈宗祥, 马玉银 申请人:扬州大学