专利名称：一株能防治马铃薯青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能防治马铃薯青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术，专用于防治马铃薯青枯病问题。背景技术：
马铃薯青枯病是由茄科劳尔氏菌(W1Sitwia solanacearum)侵染所致，是一种细菌性土传病害，在高温、高湿、多雨的条件下容易发生，主要分布于热带、亚热带和温带地区， 一旦发生就难以控制，往往造成作物大面积死亡甚至绝收，是许多作物生产的主要限制因素。马铃薯在世界各地均有栽培，马铃薯青枯病已成为影响马铃薯高产的主要障碍。在印度，青枯病可使马铃薯产量损失24% 83%;在越南的河内，马铃薯因青枯病造成的产量损失可达15% 20%。马铃薯青枯病也是我国福建、云南等南方马铃薯产区的主要细菌性病害，每年因此造成的产量损失大约在10% 15%，发病严重的地块产量损失可达80%乃至绝收。目前国内外对其防治方法多种多样，但由于这种病原体在环境中变异较多，加之该菌传播途径多，寄主范围广，尚没有一种比较好的防治方法。另一方面，水稻、小麦、玉米、油菜等作物秸秆就地焚烧、规模化养殖后的畜禽粪便随地弃置等，使大量的养分资源流失于土壤_植物系统之外，不仅严重污染了环境，也极大地浪费了能作为有机肥和生物有机肥生产原料的有机物资源，不利于我国农业的可持续发展。如何将从土壤中因作物收获而取走的营养元素最大限度地归还到土壤中去，唯一的途径就是将这些固体有机废弃物制成商品有机肥料再施入土壤。将这些固体有机废弃物经过高温发酵合成高品位的有机堆肥，再用作功能菌的载体，制成功能明确的微生物有机肥料， 具有广阔的应用前景。三
发明内容
1.技术问题
本发明的目的在于研制一种能防治马铃薯青枯病的微生物有机肥料，有效防治马铃薯青枯病，使大量的马铃薯连作障碍土壤得到生物修复，确保集约化农业的顺利发展。技术方案
一株能克服或消除连作马铃薯青枯病的拮抗菌1-23，属于枯草芽孢杆菌OfeciBm subtilis\保藏日期2010年9月14日，保藏号为CGMCC NO. 4159 ；地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。1-23的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，芽孢中生，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，V. P反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性， 硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。用上述能防治马铃薯青枯病的1-23所生产的微生物有机肥料中拮抗菌含量达 IXlO8 cfu · g—1以上，全氮含量为4 5% (90%以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6 10%、有机质含量为30 35%。其生产方法包括1)将拮抗菌1-23分别接种到改良牛肉膏液体培养基，进行发酵生产，发酵生产的条件为培养温度范围3(T35°C，搅拌速度为18(T300 rpm，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量SIXIOki Cfu-HiF10所用改良牛肉膏培养液配制方法为牛肉膏2g、玉米粉 5g、麸皮 5g、土豆淀粉 5g、NaCl 5g，定容至 1000 ml，pH 值调至 7. 2-7. 4，121°C 灭菌 20 min。2)将拮抗菌1-23与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到IXlO8 cfu .g-1以上，获得拮抗菌 1-23的微生物有机肥。该种微生物有机肥在温度不超过60°C的条件下干燥至含水量低于 30%，包装出厂即为防治马铃薯青枯病的微生物有机肥料。其中
腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30%。菜粕微生物酶解物的制备方法将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单胞 MUtenotrophomonas maltophiIia)菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物。腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次。上述微生物有机肥料可专用于防治马铃薯青枯病。有益效果
本发明涉及能防治马铃薯青枯病拮抗菌及其微生物有机肥产品，该产品具有如下优占.
1)肥料产品中含有抑制马铃薯青枯病病原细菌生长的专一性高效菌株(1-23)，其抑制效果显著，肥料中该高效菌株的含量达到IXlO8 cfu · g-1以上，施入土壤后能形成优势群， 并在土壤中存活下来。2)肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳和有机氮，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了功能菌在土壤中的定殖和活力。3)本发明产品全磷和全氮含量较高，均达到4%。本产品原料之一为腐熟的猪粪堆肥，全磷和有效磷含量高，在制成的微生物有机肥料产品中无需添加任何含磷化肥，使用本产品后能使作物顺利度过苗期磷素敏感期。本产品原料之一为菜粕微生物酶解物，不仅全氮含量高，而且含有丰富的氨基酸和小分子多肽，确保了肥料氮素持续稳定的供应，使作物生长和抗逆能力大大增强。4)试验结果表明，在青枯病发生严重的土壤上施用本产品后，能显著降低青枯病的发病率，防治效率达80%以上。施用本肥料的土壤，马铃薯青枯病能够得到有效防治。四
图1拮抗菌株对病原菌(茄科劳尔氏菌)的抑菌图2盆栽试验株高图3盆栽试验的植株生物量五具体实施方式
(一)菌株的分离和鉴定
拮抗菌的获得从马铃薯青枯病发病田块中的健康马铃薯植株根际土壤中分离拮抗菌。再通过盆栽试验和大田试验最终复筛出高效拮抗菌株1-23，鉴定到属种，菌种于15%甘油中-70°C保存。拮抗菌株1-23的抑菌圈如图1所示。1-23的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，芽孢中生，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，V. P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性， 硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。(二)菌剂生产
1)将拮抗菌1-23接种到改良牛肉膏液体培养基，分别进行发酵生产，发酵生产的条件为培养温度范围3(T35°C，搅拌速度为18(T300 rpm，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量SIXIOki Cfu-HiF10所用改良牛肉膏培养液配制方法为牛肉膏2g、玉米粉 5g、麸皮 5g、土豆淀粉 5g、NaCl 5g，定容至 1000 ml，pH 值调至 7. 2-7. 4，121°C 灭菌 20 min。2)将拮抗菌1-23与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到IXlO8 cfu .g-1以上，获得含有拮抗菌1-23的微生物有机肥。该种微生物有机肥在温度不超过60°C的条件下干燥至含水量低于30%，包装出厂即为防治马铃薯青枯病的微生物有机肥料。其中
腐熟后的猪粪堆肥由江苏新天地生物肥料工程中心有限公司提供，本品发芽指数为 98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2-2%，含水量质量比25-30%。菜粕微生物酶解物的制备方法(公知公用，见发明专利ZL200610086126. 0，一种农用氨基酸的生物制取方法及其肥料产品)将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单 mMUtenotrophomonas maltophiIia)菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物。腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2次。上述生产的微生物有机肥为用于防治马铃薯青枯病的微生物有机肥料，其中拮抗菌1-23含量达1 X IO8 cfu · g—1以上、全氮含量为4 5% (90%以上为有机氮)，总氮磷钾养分为6 10%，有机质含量为30 35%。(三)盆栽试验
试验一 BI023生物有机肥对马铃薯青枯病的防治效果育苗选取健康砂壤土作为育苗土。营养钵采用一次性塑料杯，每杯装土 300g，微生物肥料施用量为2%，BI023处理每杯施用6g微生物有机肥(5-1-1)，OF处理单施6g “田娘” 牌普通有机肥(5-1-1)，1-23处理单加18 ml 5 X IO8 cfu · ml—1的1-23菌悬液，各处养分用化肥肥料(尿素、过磷酸钙、氯化钾)等量补齐，具体设置如(表1)，每个处理重复30次。盆栽大盆钵每钵装5 kg连作土，连作土采自山东邹城连作马铃薯田块内(马铃薯连作20年的田块)。大盆钵中微生物有机肥施用量为0. 5%，各处理用化肥等量补齐，肥料与连作土充分混合均勻。待马铃薯幼苗长至4-5片真叶时将营养钵中的马铃薯幼苗连育苗土一起移栽到装有马铃薯连作土的大盆钵中。共设置4个处理，大盆钵各处理与营养钵育苗相同(表1)，每处理重复30次。该盆栽试验于2009年9月至12月在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室的温室中进行。自移栽40天时发现青枯病发病植株，随后每天观察植株发病情况，记录发病率。采集各处理的植株及土样带回实验室分析测定。
权利要求
1.一株能防治马铃薯青枯病的拮抗菌，该菌株1-23属于枯草芽孢杆菌OfeciBm 仰Mi^s)，保藏日期2010年9月14日，保藏号为CGMCC NO. 4159 ；1-23的主要生物学特性为革兰氏染色阳性G+，细胞为杆状，芽孢中生，过氧化氢酶阳性，淀粉水解阳性，V. P.反应阳性，甲基红试验阴性，纤维素分解阴性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，吲哚试验阳性，不能利用柠檬酸盐，能产氨，发酵葡萄糖产酸产气，发酵木糖、 L-阿拉伯糖、甘露糖只产酸。
2.用权利要求1所述拮抗菌生产的防治马铃薯青枯病微生物有机肥。
3.根据权利要求2所述的微生物有机肥料，其特征在于该肥料中拮抗菌和1-23含量在IXlO8 Cfu .g-1以上、全氮质量比含量为4飞％，全氮中质量比90%以上为有机氮，总氮磷钾养分质量比为6 10%，有机质质量比含量为30 35%。
4.权利要求2或3所述微生物有机肥料的生产方法，包括1)将拮抗菌1-23接种到改良牛肉膏液体培养基，分别进行发酵生产，发酵生产的条件为培养温度范围3(T35°C，搅拌速度为18(T300 rpm，发酵中后期形成芽孢，使发酵液中含菌或芽孢量彡1 X IO10 cfu · ml—1 ；2)将拮抗菌1-23与腐熟后的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物进行固体发酵， 每吨固体有机物料中加入拮抗菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆1次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵5天后结束，使拮抗菌含量达到1 X IO8 cfu · g—1以上，获得含有拮抗菌1-23的微生物有机肥，将该种微生物有机肥在温度不超过60°C的条件下干燥至含水量低于30%，包装出厂即为防治马铃薯青枯病的微生物有机肥料，其中腐熟后的猪粪堆肥发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 35%，有机氮质量比含量为1. 2 2%，含水量质量比25 30% ；菜粕微生物酶解物的制备方法将保藏号为CGMCC NO. 1543的嗜麦芽寡养单胞菌 iSteno trophomonas mal tophilia )菌株37_1发酵液加入到菜粕原料中，调节含水量 55-65%和pH 6. 0-7. 5，进行开放式固体发酵，待发酵温度上升至50°C时立即开始翻堆，以后每天翻堆，使堆温始终维持在35-50°C共5天，固体发酵开始后，堆物的pH会不断上升，每次翻堆时用含酸液体调节含水量和PH，使它们分别维持在55-65%和6. 0-7. 0，发酵终止时再用含酸液体进行喷洒，直至堆物PH调整为5. 0左右，再进行低温干燥或自然凉干，即为菜粕微生物酶解物；腐熟的猪粪堆肥和菜粕微生物酶解物的混合物制备方法将腐熟的猪粪堆肥与菜粕微生物酶解物按体积比5(Γ70% 5(Γ30%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟过程中翻堆2 次。
5.根据权利要求4所述微生物有机肥料的生产方法，其中步骤1)所用改良牛肉膏培养液配制方法为牛肉膏2g、玉米粉5g、麸皮5g、土豆淀粉5g、NaCl 5g，定容至1000 ml，pH值调至 7. 2-7. 4，121°C 灭菌 20 min。
6.权利要求2或3所述微生物有机肥料在防治马铃薯青枯病中的应用。
全文摘要
本发明涉及一株能防治马铃薯青枯病的拮抗菌及其生产的微生物有机肥料，属于农业集约化生产技术。本发明分离到了一株对马铃薯青枯病病原细菌有显著拮抗作用的拮抗菌(BacillussubtilisI-23)，拮抗菌与有机堆肥制成微生物有机肥料，肥料中拮抗菌含量1×108cfu·g-1以上,全氮含量为4~5%，总氮磷钾养分为6~10%，有机质含量为30~35%。试验表明，这种微生物有机肥料施入土壤后能够使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群，在马铃薯青枯病严重的连作土壤中对马铃薯青枯病的防治率达80%以上。施用本微生物有机肥料能有效防治马铃薯青枯病的发生。
文档编号C05G3/02GK102174428SQ20101060856
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者丁传雨, 杨兴明, 沈其荣, 陈巍 申请人:南京农业大学, 江苏新天地生物肥料工程中心有限公司