专利名称：鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法
技术领域：
本发明属于水产遗传育种技术领域，具体涉及一种鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方 法，即通过染色体组操作批量化生产鲆蝶鱼类三倍体鱼。
背景技术：
以牙鲆、半滑舌鳎、星鲽和大菱鲆等为主的鲆鲽鱼类是我国重要的海水养殖鱼类， 目前这些鲆鲽鱼类养殖业的年产值超过100亿元；而且鲆鲽鱼类养殖业的规模越来越大， 产值越来越高。不过，一些鲆鲽鱼类由于性腺发育影响了鱼体生长和肉质、并且性腺发育造 成的腹部凸起降低了鱼的商品质量。因此，对这些鲆蝶鱼类开展不育技术的研究，研制出不 育群体，对于提高这些鱼类的养殖产量和商品价值至关重要。另外，目前我国引进的海水鲆 鲽鱼类种类也越来越多，例如，大菱鲆、漠斑牙鲆、大西洋牙鲆和大西洋庸蝶等；这些外来生 物如果逃逸到自然界中，将会给我国海水鱼类种质资源造成污染。因此，研制这些鱼类的高 效不育技术，培育不育群体，在海水养殖业中推广外来种类的不育苗种，这对于保护我国海 洋渔业种质资源，显得非常迫切。三倍体鱼因染色体组成不平衡，性腺不能发育成熟，属于不育的鱼类。研制鲆鲽鱼 类三倍体批量化诱导技术、大量生产不育的三倍体鱼苗，抑制其性腺发育，将生殖腺发育消 耗的能量用于生长，克服性腺发育时期的生长停滞和鱼肉质量下降等不利影响，这对于提 高鲆蝶鱼类的生长速度、缩短鲆鲽鱼类养殖周期、提高养殖产量、提高养殖的经济效益，推 动鲆鲽鱼类养殖产业的发展，具有重要的现实意义和重大的应用价值。同时，三倍体不育苗 种的推广必将产生巨大的经济和社会、环保效益。鉴于三倍体诱导技术在遗传育种、渔业生产、水环境保护和水生生物遗传多样性 保护上的重要意义和应用价值，国际上也非常重视鱼类等水产养殖动物三倍体诱导技术的 研究。国外在一些淡水鲑鳟鱼类上开展了三倍体诱导的研究。迄今已先后研究了虹鳟、银 大马哈鱼、大鳞大马哈鱼、大西洋鲑等鱼类三倍体的诱导技术；除虹鳟外，日本还开展了诱 导三倍体香鱼的研究与开发，发现三倍体香鱼的生长速率和抗寒能力都明显优于二倍体香 鱼，很受消费者和养殖业主的欢迎，具有很大的商业价值和开发潜力。不过，上述研究获得 的三倍体诱导率不高，难以满足产业化生产的需要。另外，迄今为止，有关我国海水鲆鲽鱼 类三倍体鱼苗的批量化生产技术以及三倍体成鱼生长和性腺发育等方面的研究目前尚未 见报道。并且，由于种类上的差异，将已报道的淡水鱼类三倍体诱导的技术参数用于海水鲆 鲽鱼类三倍体诱导时，根本就诱导不出三倍体，无法在实际中得到应用。因此必须建立适合 鲆鲽鱼类的三倍体批量化生产方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲆鲽鱼类三倍体鱼苗批量化生产方法，即建立通过低温 诱导受精卵染色体组加倍大量生产鲆鲽鱼类三倍体鱼苗的技术方法，确定最佳的诱导条 件，达到产业化生产不育三倍体的目的，以弥补现有技术的不足。
本发明其技术内容包括三个方面一、三倍体鱼苗的批量化诱导技术；二、三倍体 鱼苗的鉴定技术；三、三倍体鱼的生长性能和性腺发育状况评价技术。一、三倍体鱼苗的批量化诱导技术三倍体鱼苗的批量化诱导包括有1)精、卵采集及人工授精和2、三倍体诱导步
马聚ο1)精、卵采集和人工授精选择性成熟鲆鲽鱼的雌鱼和雄鱼，采集成熟卵和精子，将采集的卵放入适当温 度的干燥烧杯中；再将精液加入到未受精卵中，精液和卵的授精最小体积比为500 IOOOyL 100 400ml，采用干法受精，轻轻摇动精卵混合混勻，然后加入2倍于卵量体积 的适当温度的海水完成授精过程；其中牙鲆卵置于15 19°C的干燥烧杯中，加入的海水温度为15 19°C ；半滑舌鳎卵置于20 的干燥烧杯中，加入的海水温度为20 ；条斑星鲽卵置于8 9°C的干燥烧杯中，加入的海水温度为8 9°C ；2)三倍体鱼苗批量化诱导在授精3 9min后将受精卵放入_2 6°C的海水中进行低温休克处理诱导三倍 体，处理时间为15 80min，处理完成后将受精卵移入海水中培育成三倍体鱼苗；其中牙鲆在授精后3 ％iin，将授精卵放入2 4°C冰海水中进行低温休克处理， 处理时间为25 30min ；低温处理后将受精卵移入15 19°C海水中培养；半滑舌鳎在授精5 6min后，将授精卵置于4 6°C冰海水中进行冷休克处理，处 理时间为20 23min ；低温处理后将受精卵移入20 海水中培养；条斑星鲽在授精7 9min后，将授精卵置于_2 1°C冰海水中进行冷休克处理， 处理时间为50 80min ；低温处理后将受精卵移入8 9°C海水中发育。其中，三倍体诱导起始时间的确定如下褐牙鲆在授精后不同时间CMin和^iin)，将褐牙鲆授精卵分别放入冰海水浴中 进行低温休克处理；处理水温为2 4°C，处理时间15 65min ；低温处理后将受精卵移入 15 19°C海水中培养。结果表明，在授精后3min，在3°C冰水浴中冷休克处理15 65min 均可产生近100%的三倍体鱼苗，且处理15 35min时，处理后三倍体鱼苗的成活率都很 高，达78 90%，这个成活率明显高于在授精后4分钟冷休克处理15 35min的各组。因 此确定褐牙鲆三倍体诱导的最佳起始时间为授精后:3min左右。半滑舌鳎在授精后不同时间(3，4，5，6，7，8，9min)，将舌鳎授精卵分别放入3 6°C的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为15 35min，冷休克处理完毕后将卵移 入20 海水中培养。统计受精率和三倍体率。发现在授精后4 7min进行冷休克处 理都能够诱导产生三倍体，且以授精后5 6min的诱导率最高，三倍体比率达95%左右。 因此确定褐牙鲆三倍体诱导的最佳起始时间为授精后5 6min。条斑星鲽在授精后不同时间(3，4，5，6，7，8，9，llmin)，将星鲽授精卵放入-2 1°C的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为30 lOOmin，冷休克处理完毕后将卵 移入8 9°C海水中培养。统计受精率和三倍体率。发现在授精后5 Ilmin进行冷休克 处理能够使染色体加倍，可以产生三倍体，且以授精后7 9min的诱导率最高，达95%左 右。因此确定条斑星鲽三倍体诱导的最佳起始时间为授精后7 9min。
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诱导三倍体冷休克处理持续时间的确定褐牙鲆在授精3 ^iin后，将受精卵置于2. 5 3. 5°C的海水中分别处理15， 25，35，45，65min后，分别移入15 19°C海水中培养，根据成活率和三倍体诱导率的高低， 确定三倍体褐牙鲆诱导的最佳低温休克时间为25 30min。综上，褐牙鲆三倍体诱导的的最佳条件是在授精后3min，将受精卵在3°C冰水浴 中进行低温休克处理，处理时间为25 30min，最佳为25min。半滑舌鳎在授精5 6min后，将舌鳎受精卵置于4 6°C的海水中分别处理10， 15，18，20，23和沈分钟后，分别移入20 海水中培养，根据三倍体诱导率和成活率的 高低，确定适宜的冷休克处理时间。发现随着冷休克处理时间的延长，三倍体比率逐渐增 加，至^min达最高，但在26min后，鱼苗成活率又急剧下降，综合考虑三倍体比率和鱼苗的 成活率，确定三倍体舌鳎诱导的最佳低温休克处理时间为20 23min。综上，半滑舌鳎三倍体的最佳诱导条件是在授精5 6min时将受精卵放置在4 6°C冰海水中低温休克处理20 23min。条斑星鲽在授精7-9min后，将星鲽授精卵放入_2 1°C的海水浴中进行冷休克 处理，冷休克处理时间为30 llOmin，冷休克处理完毕后将卵移入8 9°C海水中培养。统 计受精率和三倍体率。发现冷休克处理50-80min能够使染色体加倍，可以产生三倍体。因 此确定条斑星鲽三倍体诱导的冷休克处理时间为50 80min。综上，条斑星鲽三倍体鱼苗的最佳诱导条件是在授精后7-9min时将受精卵放置 在-2 1°C冰海水中低温休克处理50 80min。二、三倍体鱼苗的鉴定三倍体鲆鲽鱼的鉴定方法，包括1)通过DNA含量鉴定三倍体；幻通过染色体数
量鉴定三倍体1)通过DNA含量鉴定三倍体采用商业上可获得的PARTEC倍性测定仪(PA)及一步法染色试剂进行三倍体鱼苗 和/或成鱼的倍性鉴定。采用正常二倍体鱼苗作对照，通过分析鱼苗或成鱼细胞DNA的相 对含量确定倍性。牙鲆二倍体鱼苗细胞DNA含量绝大多数集中在34处，而三倍体鱼苗绝大多数细胞 中的DNA含量在55 59处，是二倍体鱼苗的1. 6倍左右，从而确定细胞DNA含量在55 59的牙鲆鱼苗为三倍体。半滑舌鳎二倍体鱼苗细胞DNA含量绝大多数集中在25 27处，而三倍体鱼苗中 95%以上的个体的DNA含量在38 40处，是二倍体鱼苗的1. 5倍左右，从而确定细胞DNA 含量在38 40的舌鳎鱼苗为三倍体。2)通过染色体数量鉴定三倍体褐牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为2n = 48条；而三倍体鱼苗的染色体数目应该 为3n = 72，在授精后3min，将受精卵置于3°C低温下处理30 35分钟，产生的鱼苗都含有 72条染色体，即这些鱼苗为三倍体牙鲆鱼苗。半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n = 42条，而三倍体鱼苗的染色体数目应 该为63条；在授精后5 6min，将受精卵置于4 6°C的海水中冷休克处理20 25min， 产生的鱼苗都含有63条染色体，即这些鱼苗为三倍体舌鳎鱼苗。
三、三倍体鱼的生长性能和性腺发育状况评价它的技术内容包括1)生长性能评价；和2、性腺发育状况评价；1、三倍体鱼的生长性能评价；当三倍体鱼苗和二倍体鱼苗生长至10厘米左右时，进行荧光标记后混养在同一 个水泥池中，养殖1年多以后，随机采样各30尾以上，进行全长和体重测量，计算三倍体和 二倍体鱼的全长和体重平均数，并进行差异显著性分析，当P < 0. 05时，认为差异显著，由 此比较三倍体和二倍体鱼的生长性能。采用这种方法发现养殖630天的褐牙鲆三倍体鱼的 全长为39. 5士3. 1厘米，而二倍体对照鱼的全长为34. 7士4. 0厘米，三倍体全长比二倍体大 13.8%，差异极显著(P <0.01)；褐牙鲆三倍体鱼体重为634. 2士 149. 1克，而二倍体鱼体 重为490. 0士 159. 8克，三倍体鱼体重比二倍体高出29. 4%，差异极显著(P < 0. 01)。2、三倍体鱼性腺发育状况评价；当三倍体和二倍体鱼养殖1年多以后，随机采样15尾以上个体测量全长和体重， 并解剖取出性腺后称重，按照公式性腺-体重指数(％)=(性腺重量/鱼体重)X100% 计算性腺-体重指数，性腺-体重指数越大，表明性腺发育越好，反之，性腺-体重指数越 小，表明性腺发育越差，从而评价三倍体鱼的性腺发育状况。本发明中测量了养殖630天的二倍体褐牙鲆和三倍体褐牙鲆鱼的体重和全长， 并解剖和称量了性腺重，测定结果表明，二倍体雌鱼的性腺-体重指数为0. 938士0. 140， 而三倍体雌鱼的性腺-体重指数为0. 282士0. 060; 二倍体雄鱼的性腺-体重指数为 0. 512士0. 155，而三倍体雄鱼的性腺-体重指数为0. 163士0. 028 ；雌性和雄性二倍体的性 腺 体重指数分别是三倍体的3. 3倍和3. 1倍，差异极显著(P < . 01)，三倍体牙鲆性腺明 显小于二倍体牙鲆性腺，性腺发育不良；同时在显微镜下观察发现，二倍体牙鲆雄鱼性腺含 有大量成熟的精子，用海水激活后可以观察到大量精子游动，而三倍体雄鱼性腺中则无成 熟的精子，用水激活后也无精子游动。本发明建立了采用低温休克批量化生产鲆鲽鱼类三倍体的方法，确定了三倍体诱 导的适宜起始时间和适宜的低温处理时间；并建立了三倍体鱼苗鉴定的方法；同时建立了 三倍体鱼生长和性腺发育状况评价方法。本发明建立的三倍体鱼苗诱导方法可高效、批量 化诱导产生三倍体鱼苗，三倍体鱼苗的诱导效率可高达100%，每次可生产5-15万三倍体 鱼苗，诱导得到的三倍体鱼生长速度比二倍体快20%以上、性腺滞育。通过本方法诱导出的 三倍体鱼苗倍性整齐、不含二倍体和四倍体，并且本发明的方法操作简单、实用性强、易行、 安全可靠，为牙鲆和舌鳎性别控制和多倍体育种开辟了新的技术途径，可推广应用于几乎 所有海水鱼类，对鱼类性别控制具有重要意义。
图1 褐牙鲆三倍体诱导适宜起始时间和冷休克处理持续时间的确定A 褐牙鲆卵授精后3min，3°C低温休克处理；B 褐牙鲆卵授精后％iin，3°C低温休克处理图2 褐牙鲆三倍体鱼苗和二倍体鱼苗细胞DNA含量比较A 正常二倍体鱼苗细胞DNA含量；B 三倍体鱼苗DNA含量。图3 褐牙鲆三倍体鱼苗和二倍体鱼苗染色体比较
A 正常二倍体鱼苗染色体；B 三倍体鱼苗染色体。图4 生长630天的牙鲆三倍体成鱼和二倍体成鱼的性腺比较A 左边为590g 二倍体牙鲆雌性性腺，右边为600g三倍体牙鲆雌性性腺；B 左边 为480g二倍体牙鲆雄性性腺，右边为810g三倍体牙鲆雄性性腺。图5 半滑舌鳎三倍体鱼苗和二倍体鱼苗细胞DNA含量比较A 正常二倍体鱼苗细胞DNA含量；B 三倍体鱼苗DNA含量。图6 半滑舌鳎三倍体鱼苗和二倍体鱼苗染色体比较A 正常二倍体鱼苗染色体；B 三倍体鱼苗染色体。
具体实施例方式采用同源精子与卵子受精，在授精后一定时间，采用可降温的恒温水浴箱对受精 卵进行低温休克处理，抑制受精卵第二极体的释放，可以大批量诱导鲆鲽鱼类三倍体鱼苗 的产生。建立鲆鲽鱼类三倍体鱼苗高效诱导技术，对于鲆鲽鱼类的性别控制，进行不育苗种 生产，提高鲆鲽鱼类生长速度、养殖产量、产品质量和经济效益，具有重要的现实意义和巨 大的推广应用潜力。下面以褐牙鲆和舌鳎为例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明实施例一、三倍体牙鲆批量化生产包括三个方面一)、三倍体褐牙鲆鱼苗的批量化生产；二)、三倍体褐牙鲆鱼苗的 鉴定；三)、三倍体褐牙鲆的生长性能和性腺发育状况评价。一 )、三倍体褐牙鲆鱼苗的批量化生产它的技术内容包括1)精、卵采集及人工授精和幻三倍体诱导步骤。1)精、卵采集及人工授精选择自然发育性成熟或人工催产后达到性成熟的褐牙鲆雌鱼和雄鱼，采用人工挤 压腹部法采卵和采精，将采集的牙鲆卵置于室温为15 19°C的干燥烧杯中；将采集的牙鲆 新鲜精液加入未受精卵中，精液和卵的受精最小体积比为500 IOOOyL 100 400ml， 干法授精，轻轻摇动混勻，后加入2倍于卵量体积的海冰，海水温度褐牙鲆为15 19°C，完 成授精过程；2)三倍体诱导步骤包括有三倍体诱导起始时间的确定和三倍体冷休克处理持续时间确定两个主要 方面。本发明采用Huber生产的Polystat CC系列可降温的恒温水浴箱产生不同温度的 冷海水，对授精卵进行低温处理，抑制受精卵第二极体排出，从而使染色体加倍的方法进行 三倍体诱导。首先通过不同温度实验，初步确定了适宜褐牙鲆染色体加倍的冷休克处理水 温为2 4°C，然后再进行如下实验。在授精后不同时间CBmir^n ^iin)，将牙鲆授精卵分别 放入2 4°C冷海水浴中进行低温休克处理，每次可处理100 400毫升卵；处理时间15 65min，低温处理后将受精卵移入15 19°C海水中培养，再统计成活率、畸形率和三倍体比 率。结果表明，在授精后3min，在3°C冰水浴中冷休克处理15 65min均可产生近100%的 三倍体鱼苗，且处理15 35min时，处理后三倍体鱼苗的成活率都很高，达78 90%，这个 成活率明显高于在授精后4分钟冷休克处理15 35min的各组，因此确定牙鲆三倍体诱导的最佳起始时间为授精后3min(见图1)。低温诱导褐牙鲆三倍体处理时间的确定确定低温休克起始时间后，设定低温休克温度为3°C，处理时间为15，25，35，45， 65min进行低温休克处理，统计成活率、畸形率和三倍体比率。根据成活率和三倍体诱导率 的高低，确定适宜的低温休克处理时间，实验结果表明，牙鲆受精卵在;TC低温下休克处理 15 65分钟，三倍体鱼苗诱导率差异不大，均为100%左右，但随着低温休克处理时间的延 长，鱼苗成活率逐渐下降，只有在处理25min时三倍体鱼苗的成活率最高，达90 %左右，畸 形率最低，故确定牙鲆低温休克处理时间为25min左右(见图1)。褐牙鲆三倍体鱼苗批量化生产结果汇总采用上面建立的方法，我们进行了褐牙鲆三倍体鱼苗的批量化生产，在多次规模 化诱导实验中获得大量三倍体鱼苗，现将牙鲆三倍体诱导结果汇总如下表1 表1 褐牙鲆三倍体鱼苗诱导结果汇总(室温15-17°C )
权利要求
1.一种鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法，其特征在于该批量化生产方法包括有1)精、 卵采集和人工授精；幻三倍体鱼苗批量化诱导步骤1)精、卵采集和人工授精选择性成熟鲆鲽鱼的雌鱼和雄鱼，采集成熟卵和精子，将采集的卵放入温度 适合的干燥烧杯中；再将精液加入到未受精卵中，精液和卵的授精最小体积比为 500-1000 μ L 100 400ml，采用干法授精，轻轻摇动精卵混合混勻，然后加入2倍于卵量 体积的温度适合的海水完成授精过程；其中牙鲆卵置于15 19°C的干燥烧杯中，加入的海水温度为15 19°C ； 半滑舌鳎卵置于20 的干燥烧杯中，加入的海水温度为20 ； 条斑星鲽卵置于8 9°C的干燥烧杯中，加入的海水温度为8 9°C ；2)三倍体鱼苗批量化诱导在授精3 9min后将受精卵放入_2 6°C的海水中进行低温休克处理诱导三倍体，处 理时间为15 80min，处理完成后将受精卵移入一定温度的海水中培育成三倍体鱼苗；其中牙鲆在授精后3 ％iin，将授精卵放入2 4°C冰海水中进行低温休克处理，处理 时间为25 30min ；低温处理后将受精卵移入15 19°C海水中培养；半滑舌鳎在授精5 6min后，将授精卵置于4 6°C冰海水中进行冷休克处理，处理时 间为20 23min ；低温处理后将受精卵移入20 海水中培养；条斑星鲽在授精7 9min后，将授精卵置于_2 1°C冰海水中进行冷休克处理，处理 时间为50 80min ；低温处理后将受精卵移入8 90°C海水中培养。
2.权利要求1所述的鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法，其特征在于还包括三倍体鱼苗 的鉴定1)通过DNA含量鉴定三倍体采用PARTEC倍性测定仪和一步法染色试剂进行三倍体鱼的倍性鉴定，采用正常二倍 体鱼作对照，通过分析鱼细胞DNA的相对含量确定倍性，三倍体鱼苗的DNA含量为二倍体的 1. 5倍左右；其中牙鲆二倍体鱼苗细胞DNA含量在34左右，三倍体鱼苗的DNA含量在55 59处； 半滑舌鳎二倍体鱼苗细胞DNA含量在25 27处，三倍体鱼苗DNA含量在38 40处；2)通过染色体数量鉴定三倍体三倍体鱼苗的染色体数目为二倍体的1. 5倍左右其中牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为2n = 48条，三倍体鱼苗的染色体数目为3n = 72条；半滑舌鳎二倍体鱼苗的染色体数目为2n = 42条，三倍体鱼苗的染色体数目为63条。
3.权利要求1所述的鲆鲽鱼类三倍体批量化生产方法，其特征在于还包括三倍体鱼的 生长性能和性腺发育状况评价方法1)、三倍体鱼的生长性能评价方法当三倍体鱼苗和二倍体鱼苗生长至10厘米左右时，进行荧光标记后混养在同一个水 泥池中，养殖1年多以后，随机采样各30尾以上，进行全长和体重测量，计算三倍体和二倍 体鱼的全长和体重平均数，并进行差异显著性分析，当P < 0. 05时，认为差异显著，由此比 较三倍体和二倍体鱼的生长性能；2)、三倍体鱼性腺发育状况评价方法当三倍体和二倍体鱼养殖1年多以后，随机采样15尾鱼以上测量全长和体重，并解 剖取出性腺后称重，按照公式性腺-体重指数％=性腺重量/鱼体重X 100%来计算性 腺-体重指数，性腺-体重指数越大，表明性腺发育越好，反之，性腺-体重指数越小，表明 性腺发育越差，从而评价三倍体鱼的性腺发育状况。
全文摘要
本发明涉及一种鲆鲽鱼类三倍体鱼苗批量化生产方法，包括有三倍体鱼苗的诱导方法，以及本发明方法生产的三倍体的鉴定方法和三倍体成鱼生长性能和性腺发育评价方法。本发明建立了采用低温休克批量化生产三倍体鲆鲽鱼类鱼苗的方法，确定了三倍体诱导的适宜起始时间和适宜的低温处理时间；并建立了三倍体鱼苗鉴定的方法；同时建立了三倍体鱼生长和性腺发育状况评价方法。本发明建立的三倍体鱼苗诱导方法可高效、批量化诱导产生三倍体鱼苗，三倍体鱼苗的诱导效率可高达100％，诱导得到的三倍体鱼生长速度比二倍体快20％以上、性腺滞育。本发明的方法操作简单、实用性强、易行、安全可靠，为牙鲆和舌鳎性别控制和多倍体育种开辟了新的技术途径。
文档编号A01K61/00GK102106292SQ20111003571
公开日2011年6月29日 申请日期2011年2月10日 优先权日2011年2月10日
发明者刘海金, 季相山, 徐田军, 李文龙, 杨景峰, 王磊, 田永胜, 谢明树, 陈松林 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所