专利名称：一种大豆胞囊线虫抗性鉴定方法
技术领域：
本发明涉及农作物抗病性鉴定领域，具体涉及一种大豆胞囊线虫抗性鉴定新方法。
背景技术：
大豆胞囊线虫病(soybean cyst nematode，SCN)是大豆的主要病害，是由大豆胞囊线虫Qleterodera的侵染造成的，是世界上大豆生产上流行性、毁灭性病害之一。大豆胞囊线虫病一般会造成大豆产量损失5 10%，严重发生地块减产达30%以上，甚至颗粒无收。选育和推广抗病的大豆品种是最为经济有效的防治措施。针对大豆胞囊线虫的抗病育种难度较大，其原因在于抗性鉴定工作量大，而且现有的鉴定方法对材料是破坏性的，鉴定为抗性的育种材料也很难保存下来。为了准确鉴定种质资源材料的抗性，线虫学家和育种家建立了许多抗性鉴定的方法，主要包括田间鉴定和温室鉴定两种。然而，无论哪种方法，最后均要将待鉴定的材料从土壤中拔出，将根系清洗干净后来计数根部胞囊数目，根据抗感标准来界定材料的抗病性。 经过根系清洗后的抗性植株很难再移栽成活，而且受季节限制，鉴定结束时必须在大豆适宜播种期才能移栽。如何保存所获得的大豆抗性材料是胞囊线虫研究者所要解决的技术难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，该方法不损伤待鉴定材料，从而使抗性材料得以完整保存。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是 一种大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，包括以下步骤
(1)播种将感病对照品种和待鉴定品种在蛭石中培育成苗株或按常规方法播种于田间育成苗株；
(2)取样当所育苗株生长至分枝期时，分别剪取感病对照品种和待鉴定品种的大豆营养体的幼嫩部分组织；
(3)生根将上步所剪取的幼嫩部分组织在lg/L的ABT生根粉乙醇溶液中浸泡15 20秒，然后取出放入清水中，保持水温23 ^°C，每2 3天更换一次清水，培养7 10 天，使所取幼嫩部分组织生根成为幼苗；
(4)移栽当上述幼苗的根系长到8 IOcm时，将其移栽至土壤中培养；
(5)接种当上步移栽成活后对幼苗接种含卵和/或二龄幼虫400个/mL的胞囊线虫悬浮液每株5mL，接种后保持土壤温度在20 30°C之间继续培养；
(6)统计鉴定继续培养观 30天后，当幼苗根部出现白色胞囊时，分别计数感病对照品种和待鉴定品种的根部胞囊数目，根据抗性分级标准界定材料的抗病性。所述幼嫩部分组织为大豆营养体的分枝或主茎顶端，并保留1片刚展开的复叶。
所述胞囊线虫悬浮液的制备方法如下
先将感病品种播种于病土中培育，当根部出现白色胞囊时，用水轻轻将根部土壤洗去， 用850 μ m +500 μ m +250Mm组筛收集胞囊，在研钵中挤破胞囊，配制成含卵和/或二龄幼虫 400个/mL的悬浮物。在所述步骤(5)中，接种方法为
用玻璃棒在待接种的幼苗旁边捣一个2cm深的小洞，用移液器进行接种，每株4 6mL 胞囊线虫悬浮液。在所述步骤(5)中，分别计数感病对照品种和待鉴定品种的根部胞囊数目后，按下述公式计算寄生指数，即IP
寄生指数=供试品种的平均胞囊数/感病对照品种的平均胞囊数X100%, 再依下述IP标准鉴定大豆品种的抗病性
0彡IP < 10%时，为高抗；10%彡IP < 30%时，为中抗；30%彡IP < 60%时，为中感； IP彡60%时，为高感。所述感病对照品种为Lee或hsex。本发明具有积极有益的效果
1.营养体生根不改变基因型，因此，营养体的抗性可以代表母体材料的抗性；利用待鉴定材料营养体的一部分代替整个植株做鉴定，可以将抗性材料完整保存。2.对于分离世代的群体(如F2)来说，可以在1个单株上取3 5个分枝来鉴定， 从而实现分离群体有重复鉴定。
具体实施例方式下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1 一种大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，包括以下步骤 (1)播种将待鉴定材料在蛭石中发芽或按常规方法播种于田间。(2)取样当植株长到分枝期剪下主茎及分枝顶部幼嫩部分，保留1片刚刚展开的复叶。(3)生根将剪下的枝条根部放入0. 1%的ABT生根粉溶液中浸泡15_20秒，然后放入清水中，保持水温25士 1°C，每2天更换一次清水，10天后当根系长到IOcm左右时移栽到土壤中使其生长。(4)移栽将壤土和沙子以2 1混合，在150°C条件下烘4小时，装在Φ6 cmXhl2 cm的塑料杯中，杯子底部钻孔，每60杯装在一个70 cmX 40 cm的塑料筐中。当待鉴定枝条上新生根长到IOcm左右开始移栽到装有消毒土的塑料杯中，3天后接种。(5)接种首先将感病品种种于病土中，当根部出现白色胞囊时，用水轻轻将根部土壤洗去，用850 μ m+500 μ m+250Mm组筛收集胞囊，在研钵中挤破胞囊，配置成400个卵和二龄幼虫/mL的胞囊悬浮物。用玻璃棒在塑料杯中枝条旁边捣一个2cm深的小洞，用移液器进行接种，每株5 mL胞囊悬浮物。(6)胞囊统计将塑料筐放在温室内，保持土壤温度在25°C左右，培育30天左右， 当根部出现白色胞囊后计数胞囊数目。实施例2实施1所述鉴定方法的验证试验(1)试验材料感病材料采用国际通用感病寄主Lee，抗病材料为兴县灰皮支 (ZDD2315)。(2)试验方法将感病寄主Lee、抗病材料兴县灰皮支(ZDD2315)两个品种各20粒种子分别放在蛭石中发芽，然后移栽到装有消毒土的杯子中。当植株长出2 3片复叶时， 将每株顶端剪掉8cm左右。将剪掉的部分在0.1% ABT生根粉溶液中浸泡20秒，然后放入清水中，保持水温25°C左右，每2天更换一次清水，8天左右当根系长到IOcm左右时移栽到土壤中使其生长，成活后与原来的植株同时接种胞囊线虫悬浮液，结果见表1。从表1中的结果可以看出，生根粉诱导的根系胞囊线虫数量与原来植株无显著差异，这表明以本发明方法诱导生根的营养体材料可以替代原植株来进行抗胞囊线虫鉴定。表1营养体材料与原植株抗胞囊线虫鉴定结果比较
权利要求
1.一种大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，包括以下步骤(1)播种将感病对照品种和待鉴定品种在蛭石中育苗或按常规方法播种于田间育苗；(2)取样当所育苗株生长至分枝期时，分别剪取感病对照品种和待鉴定品种的大豆营养体的幼嫩枝条；(3)生根将上步所剪取的幼嫩枝条在lg/L的ABT生根粉乙醇溶液中浸泡15 20秒， 然后取出放入清水中，保持水温23 ，每2 3天更换一次清水，培养7 10天，使所取幼嫩部分组织生根成为幼苗；(4)移栽当上述幼苗的根系长到8 IOcm时，将其移栽至土壤中培养；(5)接种当上步移栽成活后对幼苗接种含卵和/或二龄幼虫400个/mL的胞囊线虫悬浮液每株5mL，接种后保持土壤温度在20 30°C之间继续培养；(6)统计鉴定继续培养洲 30天后，当幼苗根部出现白色胞囊时，分别计数感病对照品种和待鉴定品种的根部胞囊数目，根据抗性分级标准界定材料的抗病性。
2.根据权利要求1所述的大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，其特征在于，所述幼嫩部分组织为大豆营养体的分枝或主茎顶端，并保留1片刚展开的复叶。
3.根据权利要求1所述的大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，其特征在于，所述胞囊线虫悬浮液的制备方法如下先将感病品种播种于病土中培育，当根部出现白色胞囊时，用水轻轻将根部土壤洗去， 用850 μ m +500 μ m +250Mm组筛收集胞囊，在研钵中挤破胞囊，配制成含卵和/或二龄幼虫 400个/mL的悬浮物。
4.根据权利要求1所述的大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，其特征在于，在所述步骤(5) 中，接种方法为用玻璃棒在待接种的幼苗旁边捣一个2cm深的小洞，用移液器进行接种，每株4 6mL 胞囊线虫悬浮液。
5.根据权利要求1所述的大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，其特征在于，在所述步骤(5) 中，分别计数感病对照品种和待鉴定品种的根部胞囊数目后，按下述公式计算寄生指数，即 IP 寄生指数=供试品种的平均胞囊数/感病对照品种的平均胞囊数X100%,再依下述IP标准鉴定大豆品种的抗病性0彡IP < 10%时，为高抗；10%彡IP < 30%时，为中抗；30%彡IP < 60%时，为中感； IP彡60%时，为高感。
6.根据权利要求1所述的大豆胞囊线虫抗性鉴定方法，其特征在于，所述感病对照品禾中为Lee或Essex。
全文摘要
本发明涉及一种大豆胞囊线虫抗性鉴定方法。该方法是先剪取感病对照品种和待鉴定品种的大豆营养体的幼嫩部分组织进行诱导生根培养，移栽成活后对幼苗接种含卵和/或二龄幼虫400个/mL的胞囊线虫悬浮液，在20～30℃下继续培养，当幼苗根部出现白色胞囊时，分别计数感病对照品种和待鉴定品种的根部胞囊数目，根据抗性分级标准界定材料的抗病性。本发明具有积极有益的效果营养体生根不改变基因型，因此，营养体的抗性可以代表母体材料的抗性；利用待鉴定材料营养体的一部分代替整个植株做鉴定，可以将抗性材料完整保存；对于分离世代的群体(如F2)来说，可以在1个单株上取3～5个分支来鉴定，从而实现分离群体有重复鉴定。
文档编号A01G7/06GK102246662SQ20111012539
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者单志慧, 卢为国, 张辉, 文自翔, 李海朝, 李金英, 李锦锦, 武永康 申请人:河南省农业科学院