专利名称：以去胚子叶为外植体花生再生体系的建立方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是一种花生再生体系的建立方法。
背景技术：
花生是世界重要的油料作物之一，我国的花生产量居世界首位。一些生物及非生物胁迫都会影响花生的产量，尤其是地下害虫、真菌及细菌病害。尽管传统的杂交育种可以得到一些抗虫抗病的品系(Garcia et al.，2006)，但是花生栽培品种遗传多样性低 (Kochert et al.，1991)，杂交育种周期长，育成的抗病性状通常与其他非预期的性状连锁，因此，目前通过分子育种手段培育花生品种，改良花生品质具有明显的优势。再生体系的效率是基因转化成功与否的关键，植物再生体系就是利用细胞的全能性，通过组织培养途径或其他非组织培养途径，在外源激素的作用下经过器官发生或胚体细胞高效、稳定地得到再生植株。外植体的选择要求有较强的再生能力、对抗生素敏感、适宜外源基因的导入及整合。花生的组织培养开始于20世纪40年代，我国则起始于70年代， 但再生效率较低。因此，建立一个高效的花生再生体系，对改良花生品质、提高花生产量具有重要的意义。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种以去胚子叶为外植体花生再生体系的建立方法，该方法的芽诱导率能达到48%左右，继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。以去胚子叶为外植体花生再生体系的建立方法，包括如下步骤(1)将去胚子叶正置于含有6-BA的芽诱导培养基上培养出不定芽，所述正置为将远离胚的位置接触培养基，6-BA的浓度为SjOmgr1 ；(2)将带有不定芽的去胚子叶，转移到含有6-BA的伸长培养基上促进不定芽伸长，6-BA的浓度为5-lOmgr1 ；(3)将伸长的不定芽去胚子叶转到含有NAA的生根培养基上培养生根，NAA的浓度为 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常规方法移植栽培。所述芽诱导培养基为MS基础培养基。所述芽诱导培养基中的6-BA的浓度为lSIOmgr1，步骤(1)培养时间为两周。所述伸长培养基为MS基础培养基。所述伸长培养基中的6-BA的浓度为Smgr1，步骤⑵培养时间为两周。所述生根培养基为的MS基础培养基。所述生根培养基中的NAA的浓度为0. Smgr1，步骤(3)培养时间为一周。所述去胚子叶为分开的1/2子叶或是未分开的全子叶。所述去胚子叶取出前需对花生作无菌处理。
所述无菌处理的方法为花生去壳，放置于75%乙醇中lmin，弃乙醇，0. 升汞中放置％iin，灭菌水洗3次，放置于无菌纸上至晾干。本发明采用去胚子叶作为花生再生体系的外植体，在含有6-BA的芽诱导培养基上诱导出芽后，降低6-BA的浓度，在含有6-BA的伸长培养基上促进不定芽伸长，再于含有 NAA的生根培养基上培养生根，得到生根小苗，可以按常规方法移植栽培。本发明建立的再生体系，其芽诱导率高达48 %左右。
图1外植体制备放置方式，1.正置，2.倒置，图2以1/2去胚子叶为外植体诱导芽，A 1/2去胚子叶B 1周在近胚处产生不定芽C 诱导芽(两周)图36-BA浓度对去胚子叶芽诱导率的影响(1/2子叶)，图46-BA浓度对去胚子叶芽诱导率的影响(全子叶)，图5以去胚子叶为外植体诱导芽的伸长、移栽及结实。
具体实施例方式芽诱导培养基为MS基础培养基，添加不同浓度的6_BA(即6_苄氨基嘌呤)伸长培养基为MS基础培养基，添加不同浓度的6-BA生根培养基为MS基础培养基，添加不同浓度的NAA(即萘乙酸)花生是市售的任一品种。MS基础培养基可以市售，也可以自行配制。实施例11.以去胚子叶为外植体芽诱导培养基的确定1.花生去壳，放置于75%乙醇中lmin，弃乙醇，0. 1 %升汞中放置％iin，灭菌水洗 3次，放置于无菌纸上至晾干；2.用无菌的手术刀，将花生两个子叶分开，去除胚后，将子叶纵向切成两部分，将 1/2子叶放置在含有不同浓度6-BA(0、5、10、15和ZOmgr1)的芽诱导培养基上，放置方式分为两种正置及倒置(正置，远离胚的位置接触培养基；倒置，近胚的位置接触培养基)，见图1，或将未切分的子叶，正置放在含ZOmgrie-BA的芽诱导培养基上，每种培养基上大约放置35个外植体，独立重复3次；
产生诱导芽的外植体数2.两周后统计芽诱导率，牙诱导率=- ο
总外植体数2以去胚子叶为外植体的花生再生体系1.花生去壳，放置于75%乙醇中lmin，弃乙醇，0. 1 %升汞中放置％iin，灭菌水洗 3次，放置与无菌纸上至晾干；2.用无菌的手术刀，将花生两个子叶分开，去除胚后，将子叶正置放在含有含 20mgr16-BA的芽诱导培养基上，两周后诱导的不定芽产生；3.将产生不定芽的外植体继代，转移到含有Smgll-BA的伸长培养基上，两周左右，不定芽伸长；
4.将伸长的诱导芽转到含有0. SmgF1NAA的生根培养基上，一周左右生根；将生根的小苗移栽，转移到含有营养土和蛭石(体积比为2/1)的花盆中，移到温
室培养。结果以1/2去胚子叶为外植体(图2A)，正置于含有6-BA的培养基上，光照培养。1周后，在近胚处有不定芽产生(图2B)。两周左右，不定芽分化成明显可见的小芽(图2C)。在 5种不同浓度的6-BA上，除了不添加6-BA的培养基没有诱导不定芽的产生，其他4种培养基均可以不同程度的诱导不定芽，不定芽的诱导率在4. 2% 16.0%之间(图幻。在含有 lSmgH-BA的培养基上不定芽的诱导率最高，达到16%。倒置不能诱导出芽。基于上面的结果，又选用未切分的去胚子叶为外植体，正置于含有6-BA的培养基上光照培养。两周后，在外植体的近胚端产生诱导芽。在不同浓度的6-BA(5、10、15、20和 SOmgF1)培养基上，芽诱导率从11. 6%到44. 0% (图4)，在含有ZOmgH-BA的培养基上诱导效率最高，经重复，最大的芽诱导率可以达到48. 3% (表1)。结果显示，以未切分的去胚子叶为外植体在含有6-BA的培养基上产生诱导芽的效率明显的高于以1/2去胚子叶为外植体高。表1最大芽诱导率的确定
权利要求
1.以去胚子叶为外植体花生再生体系的建立方法，包括如下步骤(1)将去胚子叶正置于含有6-BA的芽诱导培养基上培养出不定芽，所述正置为将远离胚的位置接触培养基，6-BA的浓度为SjOmgr1 ；(2)将带有不定芽的去胚子叶，转移到含有6-BA的伸长培养基上促进不定芽伸长， 6-BA 的浓度为 5-lOmgr1 ；(3)将伸长的不定芽去胚子叶转到含有NAA的生根培养基上培养生根，NAA的浓度为 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常规方法移植栽培。
2.根据权利要求1所述的方法，所述芽诱导培养基为MS基础培养基。
3.根据权利要求2所述的方法，所述芽诱导培养基中的6-BA的浓度为lSIOmgr1，步骤(1)培养时间为两周。
4.根据权利要求1所述的方法，所述伸长培养基为MS基础培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，所述伸长培养基中的6-BA的浓度为Smgr1，步骤(2) 培养时间为两周。
6.根据权利要求1所述的方法，所述生根培养基为的MS基础培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，所述生根培养基中的NAA的浓度为O.Smgr1，步骤(3) 培养时间为一周。
8.根据权利要求1所述的方法，所述去胚子叶为未切分子叶或1/2子叶。
9.根据权利要求1所述的方法，所述去胚子叶取出前需对花生作无菌处理。
10.根据权利要求9所述的方法，所述无菌处理的方法为花生去壳，放置于75%乙醇中lmin，弃乙醇，0. 升汞中放置％iin，灭菌水洗3次，放置于无菌纸上至晾干。
全文摘要
本发明涉及“以去胚子叶为外植体花生再生体系的建立方法”，属于生物技术领域。本发明采用去胚子叶作为花生再生体系的外植体，在含有6-BA的芽诱导培养基上诱导出芽后，降低6-BA的浓度，在含有6-BA的伸长培养基上促进不定芽伸长，再于含有NAA的生根培养基上培养生根，得到生根小苗，可以按常规方法移植栽培。本发明建立的去胚子叶为外植体花生再生体系，最大的芽诱导率为48.3％。
文档编号A01H4/00GK102239807SQ20111017984
公开日2011年11月16日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者宋福平, 张 杰, 束长龙, 耿丽丽, 黄大昉 申请人:中国农业科学院植物保护研究所