专利名称：一种霍山石斛体细胞胚发生的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种霍山石斛体细胞胚发生的方法。
背景技术：
%^\^%iDendrobium huoshanense C. Ζ. Tang et S. J. Cheng)，又名霍石角斗、 霍斛、米斛，隶属兰科石斛属，具有益精强阴、生津止渴、补虚赢、除胃中虚火之功效，被历代本草推崇为石斛中的上品，深受现代人们的青睐。但是，霍山石解的生长对环境要求极其严格，加之历代药农的采集及近代生态环境的改变，野生霍山石解资源濒临灭绝，现在只有极少量被移栽在霍山县长冲药材场。霍山石斛虽然开花多，但结果少，而且霍山石斛的种子胚未分化、无胚乳，导致萌发率极低。无法满足规模化人工栽培的需求。植物组织培养技术中的体细胞胚发生技术，能够提供繁殖数量大、繁殖速度快、后代遗传性状稳定的体细胞胚。 体细胞胚具有和植株同样的物质代谢和形态发育潜能，可用来代替原药材生产相关的活性物质。因此，体细胞胚发生技术受到了广泛关注。霍山石斛体细胞胚的发生技术为霍山石斛药用价值的持续利用和种质资源的有效保护提供了一种重要手段。石斛体细胞胚的发生是间接方式，即体细胞胚是从愈伤组织发育而成的，当前， 该发生方式存在以下不足(1)胚性愈伤组织的诱导需要添加外源激素，外源激素将通过体细胞胚富集到完整植株中，克隆植株中残留的外源激素对人体健康潜伏着严重的危害； (2)体细胞胚发育阶段不一致、同步性很小(低于50%)、大小差异较大、再生植株的存活率很低(小于10%)。因此，难以满足霍山石斛体细胞胚的规自动化生产及大面积人工栽培种苗的需要。本专利通过控制培养基的氧化还原电位以诱导产生胚性愈伤组织，胚性愈伤组织在控制一定湿度的环境中发生为霍山石斛体细胞，通过过筛法、饥饿法或后期液体培养法获得大量同步化的霍山石斛体细胞胚，这方面的技术目前尚未见报道。
发明内容
霍山石斛是一种传统而名贵的保健药材，其野生资源濒临灭绝。为了解决现有霍山石斛体细胞胚发生技术中存在的愈伤组织的诱导需要外源激素，体细胞胚发育阶段不一致、同步性很小、大小差异较大导致再生植株的存活率很低等问题，本发明提供的一种霍山石斛体细胞胚发生的方法。实现上述目的的技术解决方案如下
一种霍山石斛体细胞胚发生的方法包括以下操作步骤 (1)无菌试管苗的诱导
取霍山石斛成熟果实，先用质量分数为1%的次氯酸钠水溶液进行表面消毒60 min，再用无菌双蒸馏水冲洗3 5次，然后切开果实，取出种子，并将种子撒在固体MS培养基上， 于温度22士2°C、光照强度2000 3000勒克斯、每天光照12小时的条件下培养6 7个月，获得4-6 cm长的霍山石斛无菌试管苗；(2)胚性愈伤组织的诱导
取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端，插入氧化还原电位为-0. 03 -0. 02伏的固体透导培养基中，于温度22士2°C、黑暗中诱导培养20 25天，得胚性愈伤组织；
(3)体细胞胚的诱导
将胚性愈伤组织转移到固体MS培养基中，在相对湿度为70 85%、温度22士2°C、光照强度2000 3000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养3周后，转接到固体MS培养基中，在相对湿度为70 85%、温度22士2°C、光照强度2000 3000勒克斯、每天光照12 小时的条件下诱导培养3周；按本步骤的诱导操作条件连续转接10 15次，转接培养基为固体MS培养基，得体细胞胚；
(4)体细胞胚的同步化增殖
将体细胞胚转移到液体MS培养基或固体MS培养基中，在温度22士2°C、光照强度 2000 3000勒克斯、每天光照12小时的条件下，采用过筛法或饥饿法同步化增殖培养，得霍山石斛体细胞胚。所述固体透导培养基是在固体MS培养基的基础上加入质量分数为50 100 mg/ L的磷酸钠。所述过筛法按如下步骤操作将液体培养25天的体细胞胚先通过10目筛，收集透过的体细胞胚继续培养5天后再通过20目筛，收集截留的体细胞胚；所述饥饿法按如下步骤操作将体细胞胚在新鲜MS培养基中培养25天后，用无菌的10目筛过滤，透过的体细胞胚再用20目筛过滤，将截留的体细胞胚转移到无铁盐的MS培养中饥饿培养2天后，转入新鲜的MS培养基中继续培养5天。与现有技术相比，本发明的方法具有如下优点
(1)本发明通过取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端为外殖体，并控制诱导培养基的氧化还原电位，而不需要添加外源激素诱导获得霍山石斛胚性愈伤组织，避免了外源激素通过体细胞胚富集到完整植株中而危害人体健康；
(2)本发明通过控制环境湿度使胚性愈伤组织发生为体细胞胚，达到球形体细胞胚一致性90%以上，再生植株存活率85%以上；
(3)本发明操作工艺简单，不受时间、季节限制，可在室内工厂自动化生产霍山石斛体细胞胚及试管苗以供生产栽培的需要，实现霍山石斛药用价值的持续利用和种质资源的有效保护。
图1为步骤1取得的霍山石斛无菌试管苗图。图2为步骤2取得的胚性愈伤组织图。图3为步骤3取得的体细胞胚图。图4为本发明培养的霍山石斛体细胞胚图。
具体实施例方式下面通过实施例，对本发明作进一步地说明。实施例1 一种霍山石斛体细胞胚发生的方法包括以下操作步骤 步骤1、无菌试管苗的诱导
取产于安徽省霍山县太平畈乡的野生霍山石斛成熟果实，先用质量分数为1%的次氯酸钠水溶液进行表面消毒60 min，再用无菌双蒸馏水冲洗3次，然后切开果实，取出种子， 并将种子撒在MS固体培养基上，于温度22士2°C、光照强度2000勒克斯、每天光照12小时的条件下培养7个月，获得4 cm长的霍山石斛无菌试管苗，见图1。步骤2、胚性愈伤组织的诱导
取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端，插入控制氧化还原电位为-0. 02伏的固体透导培养基中，于温度22士2°C、黑暗中诱导培养20天，得胚性愈伤组织，见图2。固体透导培养基是在固体MS培养基的基础上加入质量分数为100 mg/L的磷酸钠。步骤3、体细胞胚的诱导
将胚性愈伤组织转移到的新鲜的固体MS培养基中，在相对湿度为70%、温度22士2°C、 光照强度3000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养后，转接到新鲜的固体MS培养基中，在相对湿度为70%、温度22士2°C、光照强度3000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养3周；按本步骤的诱导操作条件连续转接10次，转接培养基为固体MS培养基，得体细胞胚，见图3。步骤4、体细胞胚的同步化增殖
将体细胞胚转移到新鲜的固体MS培养基中，在温度22士2°C、光照强度3000勒克斯、每天光照12小时的条件下，采用饥饿法同步化增殖培养，具体操作如下将体细胞胚在新鲜固体MS培养基中培养25天后，用无菌的10目筛过滤，透过的体细胞胚再用20目筛过滤， 将截留的体细胞胚转移到无铁盐的固体MS培养中饥饿培养2天后。转入新鲜的固体MS培养基中继续培养5天，得霍山石斛体细胞胚，见图4。实施例2:
一种霍山石斛体细胞胚发生的方法包括以下操作步骤
步骤1、无菌试管苗的诱导取产于安徽省霍山县太平畈乡的野生霍山石斛成熟果实， 先用质量分数为1%次氯酸钠水溶液进行表面消毒60 min，再用无菌双蒸馏水冲洗5次，然后切开果实，取出种子，并将种子撒在MS固体培养基上，于温度22士2°C、光照强度2500勒克斯、每天光照12小时的条件下培养7个月，获得5 cm长的霍山石斛无菌试管苗。步骤2、胚性愈伤组织的诱导取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端，插入控制氧化还原电位为-0. 03伏的固体透导培养基中，于温度22士2°C、黑暗中诱导培养25天， 得胚性愈伤组织；固体透导培养基是在固体MS培养基的基础上加入质量分数为50 mg/L的磷酸钠。步骤3、体细胞胚的诱导将胚性愈伤组织转移到的新鲜的固体MS培养基中，在相对湿度为80%、温度22士2°C、光照强度2000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养后，转接到新鲜的固体MS培养基中，在相对湿度为80%、温度22士2°C、光照强度2000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养3周；按本步骤的诱导操作条件连续转接15次，转接培养基为固体MS培养基，得体细胞胚。步骤4、体细胞胚的同步化增殖将体细胞胚转移到新鲜的液体MS培养基中，在温度22士2°C、光照强度2000勒克斯、每天光照12小时的条件下，采用饥饿法同步化增殖培养，具体操作如下将体细胞胚在新鲜液体MS培养基中培养25天后，用无菌的10目筛过滤，透过的体细胞胚再用20目筛过滤，将截留的体细胞胚转移到无铁盐的液体MS培养中饥饿培养2天后，转入新鲜的液体MS培养基中继续培养5天，得霍山石斛体细胞胚。实施例3
一种霍山石斛体细胞胚发生的方法包括以下操作步骤
步骤1、无菌试管苗的诱导取产于安徽省霍山县太平畈乡的野生霍山石斛成熟果实， 先用质量分数为1%次氯酸钠水溶液进行表面消毒60 min，再用无菌双蒸馏水冲洗4次，然后切开果实，取出种子，并将种子撒在MS固体培养基上，于温度22士2°C、光照强度3000勒克斯、每天光照12小时的条件下培养6个月，获得6 cm长的霍山石斛无菌试管苗。步骤2、胚性愈伤组织的诱导取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端，插入控制氧化还原电位为-0. 02伏的固体透导培养基中，于温度22士2°C、黑暗中诱导培养22天， 得胚性愈伤组织。固体透导培养基是在固体MS培养基的基础上加入质量分数为100 mg/L 的磷酸钠。步骤3、体细胞胚的诱导将胚性愈伤组织转移到的新鲜的固体MS培养基中，在相对湿度为85%、温度22士2°C、光照强度2500勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养后，转接到新鲜的固体MS培养基中，在相对湿度为85%、温度22士2°C、光照强度2500勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养3周；按本步骤的诱导操作条件连续转接13次，转接培养基为固体MS培养基，得体细胞胚。步骤4、体细胞胚的同步化增殖将体细胞胚转移到新鲜的液体MS培养基中，在温度22士2°C、光照强度2500勒克斯、每天光照12小时的条件下，采用过筛法同步化增殖培养，具体操作如下体细胞胚在新鲜液体MS培养基中培养25天后，将体细胞胚通过无菌的 10目筛，收集透过的体细胞胚在新鲜的液体MS培养基继续培养5天后再通过无菌的20 目筛，收集截留的体细胞胚，即得霍山石斛体细胞胚。
权利要求
1.一种霍山石斛体细胞胚发生的方法，其特征在于包括以下操作步骤(1)无菌试管苗的诱导取霍山石斛成熟果实，先用质量分数为1%的次氯酸钠水溶液进行表面消毒60 min，再用无菌双蒸馏水冲洗3 5次，然后切开果实，取出种子，并将种子撒在固体MS培养基上， 于温度22士2°C、光照强度2000 3000勒克斯、每天光照12小时的条件下培养6 7个月，获得4-6 cm长的霍山石斛无菌试管苗；(2)胚性愈伤组织的诱导取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端，插入氧化还原电位为-0. 03 -0. 02伏的固体透导培养基中，于温度22士2°C、黑暗中诱导培养20 25天，得胚性愈伤组织；(3)体细胞胚的诱导将胚性愈伤组织转移到固体MS培养基中，在相对湿度为70 85%、温度22士2°C、光照强度2000 3000勒克斯、每天光照12小时的条件下诱导培养3周后，转接到固体MS培养基中，在相对湿度为70 85%、温度22士2°C、光照强度2000 3000勒克斯、每天光照12 小时的条件下诱导培养3周；按本步骤的诱导操作条件连续转接10 15次，转接培养基为固体MS培养基，得体细胞胚；(4)体细胞胚的同步化增殖将体细胞胚转移到液体MS培养基或固体MS培养基中，在温度22士2°C、光照强度 2000 3000勒克斯、每天光照12小时的条件下，采用过筛法或饥饿法同步化增殖培养，得霍山石斛体细胞胚。
2.根据权利要求1所述的一种霍山石斛体细胞胚发生的方法，其特征在于，所述固体透导培养基是在固体MS培养基的基础上加入质量分数为50 100 mg/L的磷酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种霍山石斛体细胞胚发生的方法，其特征在于，所述过筛法按如下步骤操作将液体培养25天的体细胞胚先通过10目筛，收集透过的体细胞胚继续培养5天后再通过20目筛，收集截留的体细胞胚；所述饥饿法按如下步骤操作将体细胞胚在新鲜MS培养基中培养25天后，用无菌的10目筛过滤，透过的体细胞胚再用20目筛过滤，将截留的体细胞胚转移到无铁盐的MS培养中饥饿培养2天后，转入新鲜的MS培养基中继续培养5天。
全文摘要
本发明涉及一种霍山石斛体细胞胚发生的方法。该方法包括以下操作步骤(1)无菌试管苗的诱导；(2)胚性愈伤组织的诱导；(3)体细胞胚的诱导；(4)体细胞胚的同步化增殖，得到大量霍山石斛体细胞胚。本发明通过取无菌试管苗的带节的茎段的形态学下端为外殖体，并控制诱导培养基的氧化还原电位，而不需要添加外源激素诱导获得霍山石斛胚性愈伤组织，避免了外源激素通过体细胞胚富集到完整植株中而危害人体健康。通过控制环境湿度使胚性愈伤组织发生为体细胞胚，达到球形体细胞胚一致性90%以上，再生植株存活率85%以上。本发明操作工艺简单，不受时间、季节限制，可在室内工厂自动化生产霍山石斛体细胞胚及试管苗以供生产栽培的需要。
文档编号A01H4/00GK102246697SQ20111017943
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者朱慧秋 申请人:芜湖华信生物药业股份有限公司