建立版纳甜龙竹芽尖高效再生体系的方法
【专利摘要】一种版纳甜龙竹芽尖高效再生体系的建立方法，按如下五个步骤进行：一是侧芽愈伤组织的诱导培养，二是愈伤组织的继代培养，三是幼苗的分化培养，四是幼苗的生根培养，五是再生植株的炼苗和移栽。本发明涉及一种以竹子的侧芽芽尖为外植体的植物组培方法，是对以竹子侧芽为外植体经组培获得高效胚性愈伤组织的诱导率的有益尝试，采用本方法能够使外植体高效诱导出愈伤组织，建立高效的体细胞再生体系，为该竹子遗传转化和细胞工程研究创造有利条件，为利用转基因技术育种奠定了良好的基础，本方法简单易行、利于推广，实施条件宽松，效果显著。
【专利说明】建立版纳甜龙竹芽尖高效再生体系的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养技术，具体是以版纳甜龙竹的芽尖为外植体，经过愈伤组织诱导、分化、生根，实现高效再生，以更进一步为农杆菌遗传转化工作打好基础。
【背景技术】
[0002]版纳甜龙竹(Dendrocalamus hamiltonii)属于禾本科竹亚科牡竹属，是世界三大甜龙竹之一，为优良的笋材两用竹种。由于传统育种方法存在消耗竹种多、繁殖系数低等缺点，采用基因工程对竹子进行品种改良已成为当前生物【技术领域】研究的重点与难点。版纳甜龙竹基因转化主要是农杆菌侵染法，作为基因转化的受体系统要求具有高效的再生能力、稳定的遗传特性、便捷的外植体来源、对农杆菌敏感等。因此，采用便捷的外植体建立高效稳定的再生体系一直是科研工作者追寻的目标。竹类植物的组织培养起步于1968年，之后，对牡竹属(Dendrocalamus),箣竹属(Bambusa)、寒竹属(Chimonobambusa)等多种竹子以种胚为外植体已建立起了再生体系，但由于竹子较难开花，有效种子较难获得，因而具有很大的局限性，不能根据科研者的需要随时进行取材、实验。以芽尖为外植体可以免受季节限制，取材方便，更具有普遍性与可行性。本专利申请以芽为外植体探索得到了高的胚性愈伤组织诱导率，建立了高效稳定的再生体系，为遗传转化奠定坚实的基础，对此，尚未见有关资料的报道。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种建立版纳甜龙竹芽尖高效再生体系的方法。
[0004]解决该技术问题采用如下技术方案:本建立版纳甜龙竹芽尖高效再生休系的方法包括以下步骤:
[0005](1)侧芽愈伤组织的诱导培养:从生长健壮的无病斑和虫疤的版纳甜龙竹植株中取侧芽为外植体，自来水下冲洗lh，用质量比浓度为I %的次氯酸钠真空抽滤15分钟，无菌水冲洗5-6次，在超净工作台上切长度为1±0.2cm的芽尖，接种于诱导培养基中，基本培养基MS (Murashige and Skoog),添加外源激素2,4_D即2,4-二氯苯氧乙酸和6-BA即6-节基腺嘌呤，2，4-D浓度为3-5mg.L—1，6-BA浓度为0.5-lmg.L-1，再添加500mg.L-1的CH即水解酪蛋白、500mg.L—1的Pro即脯氨酸和500mg.L—1的Gln即谷氨酰胺；调节pH为5.7,在25±2°C温度中暗培养，诱导培养30±2d，愈伤组织形成；
[0006](2)愈伤组织继代培养:取淡黄色颗粒状愈伤组织接种于继代培养基中，继代培养基的基本培养基为MS，添加外源激素为浓度0.1-0.5mg.l-1的2，4-D，有机添加物、pH值和诱导培养基相同，在25±2°C温度中暗培养30±2d ；
[0007](3)分化培养:选致密颗粒状的愈伤组织在分化培养基中诱导幼苗分化，分化培养基以MS为基本培养基，添加浓度为l_2mg.l-1的6-BA、浓度为0.3-0.5mg.l-1的NAA即萘乙酸、浓度为0-2mg.l-1的KT即激动素:pH值5.7，光强24001ux，光周期16/8h，温度25±2°C ；[0008](4)生根培养:当分化培养出的再生植株长至4_6cm高时移入生根培养基中进行生根培养，基本培养基为1/2MS，添加外源激素为3-511^171的IBA即吲哚丁酸，pH值5.7，光强24001ux，光周期16/8h，温度25±2°C ；
[0009](5)再生植株的炼苗和移栽:3-4周后根长粗、健壮时，将试管苗置于光强为200001ux的强光下炼苗一周后从试管中取出苗，用40±2°C的温水洗净根部的培养基，移栽于泥炭:珍珠岩:蛭石的体积比为1:1:1的混合基质中进行单株套袋培养，每天浇一次透水，一周后剪去塑科套袋两角，两周后脱去套袋，待长出新叶时移栽至温室，培养出健壮的再生植株苗。
[0010]本发明的有益效果是:采用本方法最高愈伤组织诱导率为86.7%，最高幼苗分化率为51.7%，最高生根率为95%:能够使外植体高效诱导出愈伤组织，建立高效的体细胞再生体系，为该竹子遗传转化和细胞工程研究创造有利条件，为利用转基因技术育种奠定了良好的基础。本方法实施步骤简单易行，实施条件宽松，效果非常显著。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为芽尖正在诱导的愈伤组织形态图。
[0012]图2为致密颗粒状愈伤组织形态图。
[0013]图3为柔软水溃状的愈伤组织形态图。
[0014]图4为变绿的愈伤组织形态图。
[0015]图5为致密颗粒 状愈伤组织分化出苗形态图。
[0016]图6为版纳甜龙竹再生苗形态图。
[0017]图7为版纳甜龙竹再生苗生根形态图。
[0018]图8为炼苗移栽后的植株形态图。
[0019]图9为愈伤组织诱导阶段五种基本培养基的诱导率对比图。
[0020]图10为愈伤组织诱导阶段2，4_D不同浓度的诱导率对比图。
[0021]图11为愈伤组织诱导阶段6-BA不同浓度的诱导率对比图。
[0022]图12为愈伤组织诱导阶段不同有机添加物的诱导率对比图。
【具体实施方式】
[0023]本发明以下结合附图和实施例作进一步详述:
[0024]本建立版纳甜龙竹芽尖高效再生体系的方法的步骤如下:
[0025](I)侧芽愈伤组织的诱导培养:从生长健壮的无病斑和虫疤的版纳甜龙竹植株中取侧芽为外植体，自来水下冲洗lh，用质量比浓度为I %的次氯酸钠真空抽滤15分钟，无菌水冲洗5-6次，在超净工作台上切长度为1±0.2cm的芽尖，接种于诱导培养基中，基本培养基MS (Murashige and Skoog),添加外源激素2,4_D即2,4-二氯苯氧乙酸和6-BA即6-节基腺嘌呤，2，4-D浓度为3-5mg.L—1，6-BA浓度为0.5, Img.L-1，再添加500mg.L-1的CH即水解酪蛋白、500mg.L—1的Pro即脯氨酸和500mg.L—1的Gln即谷氨酰胺:调节pH为5.7,在25±2°C温度中暗培养，诱导培养30±2d，愈伤组织形成；
[0026](2)愈伤组织继代培养:取淡黄色颗粒状愈伤组织接种于继代培养基中，继代培养基的基本培养基为MS，添加外源激素为浓度0.1-0.5mg.L-1的2，4-D，有机添加物、pH值和诱导培养基相同，在25±2°C温度中暗培养30±2d ；
[0027](3)分化培养:选致密颗粒状的愈伤组织在分化培养基中诱导幼苗分化，分化培养基以MS为基本培养基，添加浓度为l_2mg.L-1的6-BA、浓度为0.3-0.5mg.L-1的NAA即萘乙酸、浓度为0-2mg.l-1的KT即激动素；pH值5.7，光强24001ux，光周期16/8h，温度25±2°C:
[0028](4)生根培养:当分化培养出的再生植株长至4_6cm高时移入生根培养基中进行生根培养，基本培养基为1/2MS，添加外源激素为3-511^171的IBA即吲哚丁酸，pH值5.7，光强24001ux，光周期16/8h，温度25±2°C:
[0029](5)再生植株的炼苗和移栽:3-4周后根长粗、健壮时，将试管苗置于光强为200001ux的强光下炼苗一周后从试管中取出苗，用40±2°C的温水洗净根部的培养基，移栽于泥炭:珍珠岩:蛭石的体积比为1:1:1的混合基质中进行单株套袋培养，每天浇一次透水，一周后剪去塑料套袋两角，两周后脱去套袋，待长出新叶时移栽至温室，培养出健壮的再生植株苗。
[0030]下面将与本发 明相关的试验与附图进行介绍:
[0031]图1-图8，可以从附图本身结合各对应的【专利附图】
【附图说明】，一目了然看清，不另作介绍。
[0032]图9为版纳甜龙竹芽尖接种到五种不同基本培养基中愈伤组织诱导率情况对比图。基本培养基选用1/2MS、MS、B5、Heller、White (各种基本培养基配方详见:王蒂，植物组织培养，北京:中国农业出版社，2004)。图中可看出MS基本培养基中愈伤组织诱导率显著高于其他四种基本培养基，达85%，且愈伤组织绝大部分(61.7%)为淡黄色、颗粒状的良好愈伤组织，与其他基本培养基诱导的良好愈伤组织(26.6% -43% )差异显著。综上所述，版纳甜龙竹芽尖愈伤组织诱导的最适宜基本培养基为MS培养基。
[0033]图10为版纳甜龙竹芽尖接种到不同浓度2，4_D培养基中愈伤组织诱导率情况对比图。2，4-D浓度梯度为0、0.1、0.3、l、3、10mg.L'图中可看出不添加2，4-D及低浓度(0.1mg.L-1)时，没有愈伤组织产生；随着2，4-D浓度的增加，愈伤组织诱导率逐渐提高，浓度为3mg.1/1时达到85%且诱导的愈伤组织大多呈黄色、松脆颗粒状，增殖较快，与其它处理达到显著性差异，增加到IOmg.L-1时，愈伤组织诱导率下降，愈伤组织多疏松、水质团状，愈伤组织增殖较慢。综上所述，版纳甜龙竹芽尖愈伤组织诱导的最适宜2，4-D浓度为3mg eL10
[0034]图11为版纳甜龙竹芽尖接种到不同浓度6-BA培养基中愈伤组织诱导率情况对比图。6-BA浓度梯度为0、1、2、41^.!^。图中可看出随着6-BA浓度的增加愈伤组织诱导率呈下降趋势，但当6-BA浓度为Img.L-1时，致密颗粒状的良好愈伤组织诱导率为最高，达63.3%，利于增殖分化，与其他处理达到显著差异。综上所述，版纳甜龙竹芽尖愈伤组织诱导的最适宜6-BA浓度为Img.L'
[0035]图12为版纳甜龙竹芽尖接种到不同有机添加物的诱导培养基中愈伤组织诱导率情况对比图。有机添加物为 500mg.L 1QUOOmg.L 1Pro^SOOmg.L 1GlruSOmg.L 1Ads、500mg.L 1YE 即酵母提取物、500mg.L ^H+SOOmg.L 1Glr^SOOmg.L 1Pro0 图中可看出有机添加物对版纳甜龙竹芽尖愈伤组织诱导没有显著作用，各处理与对照之间愈伤组织诱导率没有显著性差异。其中酵母提取物诱导的愈伤组织水化严重，增殖培养中愈伤组织多褐化；而水解酪蛋白、脯氨酸与谷氨酰胺的组合处理诱导的愈伤组织约有63.3%为颗粒状松脆的良好愈伤组织，与其它处理达到显著性差异。综上所述，基本培养基中添加SOOmg.!/1水解酪蛋白、500mg.L-1脯氨酸与500mg.l-1谷氨酰胺时有利于改善版纳甜龙竹芽尖愈伤组织诱导率及其质量。
[0036]表1正交实验处理的版纳甜龙竹愈伤组织分化情况对比表
[0037]
【权利要求】
1.版纳甜龙竹芽尖高效再生体系的建立方法，其特征是按下列步骤进行: (1)侧芽愈伤组织的诱导培养:从生长健壮的无病斑和虫疤的版纳甜龙竹植株中取侧芽为外植体，自来水下冲洗lh，用质量比浓度为I %的次氯酸钠真空抽滤15分钟，无菌水冲洗5-6次，在超净工作台上切长度为1±0.2cm的芽尖，接种于诱导培养基中，基本培养基MS (Murashige and Skoog),添加外源激素2,4-D即2,4_ 二氯苯氧乙酸和6-BA即6_苄基腺嘌呤，2，4-D浓度为3-5mg.L—1，6-BA浓度为0.5-lmg.L-1，再添加500mg.L-1的CH即水解酪蛋白、500mg.L—1的Pro即脯氨酸和500mg.L—1的Gln即谷氨酰胺:调节pH为5.7,在25±2°C温度中暗培养，诱导培养30±2d，愈伤组织形成: (2)愈伤组织继代培养:取淡黄色颗粒状愈伤组织接种于继代培养基中，继代培养基的基本培养基为MS，添加外源激索为浓度0.1-0.5mg.L-1的2，4-D，有机添加物、pH值和诱导培养基相同，在25±2°C温度中暗培养30±2d ； (3)分化培养:选致密颗粒状的愈伤组织在分化培养基中诱导幼苗分化，分化培养基以MS为基本培养基，添加浓度为l_2mg.L-1的6-BA、浓度为0.3-0.5mg.L-1的NAA即萘乙酸、浓度为Ojmg-L-1的KT即激动索;pH值5.7，光强24001ux，光周期16/8h，温度25±2°C; (4)生根培养:当分化培养出的再生植株长至4-6cm高时移入生根培养基中进行生根培养，基本培养基为1/2MS，添加外源激素为3-511^171的IBA即吲哚丁酸，pH值5.7，光强24001ux，光周期 16/8h，温度 25±2°C ； (5)再生植株的炼苗和移栽:3-4周后根长粗、健壮时，将试管苗置于光强为200001UX的强光下炼苗一周后从试管中取出苗，用40±2°C的温水洗净根部的培养基，移栽于泥炭:珍珠岩:蛭石的体积比 为1:1:1的混合基质中进行单株套袋培养，每天浇一次透水，一周后剪去塑料套袋两角，两周后脱去套袋，待长出新叶时移栽至温室，培养出健壮的再生植株苗。
【文档编号】A01H4/00GK103782909SQ201410041069
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】林新春, 周玲, 王晓芹 申请人:浙江农林大学