猪肺萃取物作为基质金属蛋白酶抑制剂的用途的制作方法

专利名称：猪肺萃取物作为基质金属蛋白酶抑制剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明相关于猪肺萃取物作为基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase, MMP)抑制剂的新用途，特别是用于抑制MMP-1、MMP_2或MMP-9。
背景技术：
金属蛋白酶为蛋白酶(酵素)的超族群，其数目于近年来已急剧地增加。基于结构与功能性考虑，这些酶已被分类成数个族群与亚族群。金属蛋白酶的实例，包括基质金属蛋白酶(MMP)，譬如胶原酶(MMP-1，MMP-8，MMP-13)、明胶酶(MMP_2，MMP_9)、基质溶素(MMP-3, MMP10, MMP-11)、间质溶素(MMP-7)、金属弹性蛋白酶(MMP-12)、釉质溶素(MMP-19)、 MT-MMP (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17)；生殖溶素或齿釉质溶素或MDC族群，其包括分泌酶与流出酶，譬如TNF转化酶(ADAM10与TACE)虾红素族群，其包括一些酶，譬如原胶原处理蛋白酶(PCP)；及其它金属蛋白酶，譬如聚集原酶，内皮肽转化酶族群及血管收缩素转化酶族群。其中已知MMP与多种疾病相关，如MMP于癌组织中血管新生或癌转移时，其表达量会升高或者酵素会产生活性化，另外，对于溃疡形成、慢性关节风湿病、骨质疏松症、牙周病等各种病症中细胞外基质的分解亦具有作用。再者，皮肤因紫外线等外部刺激使活性亢进的MMP将维持皮肤构造上重要成分分解的现象，在最近，因其为由于紫外线而活化的老化促进因子而特别受到重视，尤以MMP-I、MMP-2及MMP-9特别受到重视，其原因有两个，其一是这些MMP的底物为皮肤的重要结构成分，其二是皮肤长期暴露在会刺激这些MMP形成病理状态的因素下，例如炎症反应、氧化性应激及紫外线。因此，目前认为选择性抑制MMP-I、 MMP-2及MMP-9比抑制所有金属蛋白酶在减缓皮肤老化上更有益处及有效。MMP-I是通称的胶原蛋白分解酶的一种，为调节光老化重要因子，纤维母细胞受阳光的紫外线曝晒会引起基质金属蛋白酶大量表达，进而降解细胞外基质(ECM)，也就是说 MMP-I负责真皮组织的胶原蛋白降解。MMP_2(解胶酵素72-kDa)的作用在皮肤生理上的重要性也已经得到证实。虽然 MMP-2在第I型胶原的分解上是否扮演直接的角色尚未确定，但第I型胶原是其酵解物之一则已获得证实，另外，第IV型胶原(基底膜)、第VII型胶原(真皮-表皮定锚微纤维)、 明胶(变质的第I型胶原)、弹性蛋白和纤维蛋白等，也都是MMP-2的酵解物。随着年龄日长，MMP-2在皮肤里的酵素活动量会增加，因此，MMP-2在胞外基质的萎缩方面，亦扮演重要的角色。MMP-9 (明胶酶B ；92kDa类型IV胶原酶；92kDa明胶酶)为一种分泌的蛋白质，其是在1989年首先经纯化，然后无性繁殖及定序。MMP-9的表达于正常情况下是被限制于少数细胞类型，包括滋胚层、破骨细胞、嗜中性白血球及巨噬细胞。但是，其表达可在这些相同细胞中，及在其它细胞类型中，藉数种介体诱发，包括此等细胞曝露至生长因子或细胞活素。其是为经常与引发炎性回应有关联的相同介体。与其它经分泌的MMP—样，MMP-9是以不活性酶原释出，其是随后分裂而形成具酵素活性的酶。于活体内供此活化作用所需要的蛋白酶，是为未知。活性MMP9对不活性酶的平衡，是进一步于活体内经由与一种天然生成的蛋白质TIMP-I (金属蛋白酶-1的组织抑制剂)的交互作用作调节。TIMP-I是结合至MMP-9的C-末端区域，导致MMP-9催化功能部位的抑制。ProMMP-9经诱发表达的平衡， ProMMP-9的分裂成活性MMP9，及TIMP-I的存在，是合并以决定存在于局部位置的具催化活性MMP-9的量。具蛋白分解活性的MMP-9会攻击受质，其包括明胶、弹性蛋白及天然类型IV 与类型V胶原；其对于天然类型I胶原、蛋白多醣或昆布胺酸未具有活性。已有成长中的资料体，与MMP-9在不同生理学与病理学过程中的角色有关联。生理学角色包括在胚胎移植的早期阶段中，胚胎滋胚层经过子宫上皮的侵入；在骨骼生长与发展中的某种角色；及炎性细胞从血管分布潜移至组织中。使用酶免疫分析度量的MMP-9释出，在流体中，及在来自未经治疗的气喘病患者的AM上层清液中，与来自其它个体群者比较，是显着地提高。增加的MMP-9表达亦已被发现于某些其它病理学症状中，于是使MMP-9与疾病过程产生关联，譬如C0PD、关节炎、肿瘤转移、阿耳滋海默氏病、多发性硬化，及在动脉粥瘤硬化中的斑破裂， 导致急性冠状症状，譬如心肌梗塞。由于天然产物的安全性佳，现今对于天然来源产物的开发越来越受重视，仍有需要开发抑制MMP的天然产物。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种猪肺萃取物的用途，其是用于制备抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性的组合物。本发明在以下部分中详细描述。本发明的其它特征、目的及优点可易见于本发明的实施方式及权利要求书中。


图IA是猪肺萃取物对纤维母细胞的毒性试验图表；图IB及C是各种浓度的猪肺萃取物抑制MMP-I活性的胶体电泳图及图表。图2A是猪肺萃取物对纤维母细胞的毒性试验图表；图2B及C是各种浓度的猪肺萃取物抑制MMP-2及MMP-9活性的胶体电泳图及图表。图2D为不同浓度的猪肺萃取物以及对照组对于MMP-9的抑制率。
具体实施例方式在本发明的前，并没有任何报告或先前技术指出或推测猪肺萃取物具有抑制基质金属蛋白酶的功效，而在本发明中，出人意料地发现猪肺萃取物可有效抑制基质金属蛋白酶活性。藉由该抑制活性，特别是抑制ΜΜΡ-1、ΜΜΡ-2或/及MMP-9的活性，减少弹性蛋白的分解，因而可改善/减缓/防止皮肤老化。本发明的一个目的是提供一种猪肺萃取物的用途，其是用于制备抑制基质金属蛋白酶的组合物。除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科技术语应具有所属领域的技术人员通常理解的含义。术语的含义及范畴应为明确的；然而，若存在任何潜在含糊性，则本文所提供的定义优先于任何词典或外部来源的定义。而除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。术语“猪肺萃取物”表示将猪肺及其周边组织经萃取后的萃取物，其中该猪肺不限于新鲜或冷冻的猪肺。于一较佳实施例中，本发明的猪肺萃取物萃取方式是(a)猪肺绞碎后加入缓冲液调整PH值约6. 0-9. 0 ； (b)加入酵素于步骤(a)中保温酶解，酶解后升温使酵素失活；(c)加入酸液于步骤(b)中进行酸沉淀后，过滤收集滤液，且(d)加入有机溶剂于滤液中，收集沉淀物，得到猪肺萃取物。于一较佳实例中，该猪肺是去除气管部分后再绞碎。于一较佳实例中，本发明步骤(a)中的pH值为约6.0-8.0、6.5-8.0、6.0-7. 5、或约7.0。于一较佳实例中，本发明步骤(a)中所使用的缓冲液包括但不限于柠檬酸钠或磷酸盐类。于一较佳实例中，本发明步骤(b)中所使用的酵素包括但不限于菠萝酵素或蛋白酶M或其组合。于一较佳实例中，本发明步骤(c)中所使用的酸液为强酸，其包括但不限于盐酸、过氯酸及三氟醋酸。于一较佳实例中，本发明步骤(d)中所使用的有机溶液包括但不限于甲醇、乙醇或异丙醇，更佳是乙醇，最佳是食品级乙醇。于本发明的一较佳实施例中，本发明的猪肺萃取物可抑制MMP活性，所述的MMP较佳为MMP-I、MMP-2或MMP-9。于另一较佳实施例中，本发明的猪肺萃取物可同时抑制MMP-I、 MMP-2及MMP-9的活性。于另一方面，本发明的猪肺萃取物可经由抑制MMP的活性而具有改善、减缓或防止皮肤老化，特别是防止皮肤老化的用途。术语“防止”表示预防或阻止症状产生，或改善或回复已产生的症状。术语“皮肤老化”一词包括此种老化迹象包括但不限于皮肤脆性；胶原或弹性蛋白的丧失；皮肤中的雌激素平衡缺失；皮肤萎缩；线条或皱纹的出现或深度，包括微细线条； 皮肤变色，包括黑眼圈；皮肤松弛；皮肤疲劳或压力，例如由于环境压力譬如污染或温度变化所致的皮肤突出；皮肤干燥性；皮肤片状剥落；细胞老化；皮肤张力、弹性或光泽的丧失； 皮肤坚牢性的丧失；粗皮质地；皮肤弹性或回弹性的丧失。对皮肤美观的利益与改良，可以任何下述证明孔隙大小的降低；皮肤张力、光彩、透明性或拉紧性的改良；抗氧化剂活性的促进；皮肤坚牢性、膨胀性、柔曲性或柔软度的改良；原胶原或胶原生产上的改良；皮肤质地上的改良或再变形的促进；皮肤障壁修复或功能上的改良皮肤轮廓外观上的改良；皮肤光泽或亮度的修复；于皮肤中因老化或断经所减少的必须营养物或组份的补充；皮肤细胞中连通的改良；细胞增生或繁殖上的增加；因老化或断经而降低的皮肤细胞新陈代谢作用上的增加；皮肤润湿作用上的改良；细胞转换的促进或加速；皮肤厚度的加强；皮肤弹性或回弹性上的增加；及脱落的加强。于另一较佳实例中，本发明的猪肺萃取物，其中的组合物另包含构成该组合物所需的载剂。术语“载剂”或“化妆品中可接受的载剂”是指稀释剂、赋形剂或类似物，其为各该行业所属技术领域的技术人员所熟知。本发明的组合物还可进一步包含可用于防止皮肤老化的活性成分，例如维生素A 酸、维生素A醇、熊果素、玻尿酸、表皮生长因子及其它天然美白成分等。本发明的组合物另可包含习用化妆品活性剂，譬如其它习用低色素沉着剂，譬如对苯二酚、抗坏血酸或甘草精萃液；消炎剂；抗粉刺剂，譬如柳酸；剥落剂，譬如α-羟基酸、β-羟基酸、酮基酸、氧酸或氧二酸；抗坏血酸基-磷酰基-胆固醇；防晒剂，譬如氧基苯酮、甲氧基桂皮酸辛酯、柳酸辛酯、八可烯、二氧化钛、氧化锌、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基酚(MBBT)；或抗老化剂；或其任何组合。于另一个较佳实施例中，本发明的组合物包含最终浓度约50 μ g/mL至500 μ g/mL 的猪肺萃取物。较佳地，本发明的组合物包含约200 μ g/mL至400 μ g/mL的猪肺萃取物。最佳是包含约300 μ g/mL的猪肺萃取物。本发明的猪肺萃取物可以所萃取溶液原状使用，或依需要进行浓缩、稀释、过滤等处理及以活性碳等进行脱色、脱臭处理后使用。另外，将萃取后溶液进行浓缩干固、喷雾干燥、冷冻干燥等处理，以干燥物的形式使用亦可。本发明的猪肺萃取物可应用于对皮肤老化的预防、抑制或症状改善的医药品、准医药品、化妆品、饲料添加剂或食品中，并可使用上述萃取物的原样，或在不损害萃取物范围内，与普通医药品、准医药品、化妆品或食品中使用的成分赋形剂、安定剂、保存剂、结合齐U、崩散剂、烃类、脂肪酸类、醇类、酯类、界面活性剂、金属肥皂、PH调节剂、防腐剂、香料、保湿齐 、粉体、紫外线吸收齐 、增黏齐 、色素、抗氧化齐 、美白齐 、螯合剂、油脂类或蜡类等成分配合使用。本发明的猪肺萃取物可呈现的剂型例如有散剂、丸剂、锭剂、注射剂、栓剂、乳剂、 胶囊、颗粒剂、液剂(包括酊剂、流体酊剂、酒精剂、悬浊剂、柠檬水剂等)、化妆水、乳膏、乳液、凝胶剂、喷雾剂、润肤膏、洗净剂、浴用剂、基底、打粉、口红、软膏、温湿布、糊状剂、膏药、 精油、糖果锭或饮料等。以下实施例不应视为过度地限制本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者可在不背离本发明的精神或范畴的情况下对本文所讨论的实施例进行修改及变化，而仍属于本发明的范围。实例实例1猪肺萃取物萃取方式冷冻猪肺解冻后以清水洗净后去除气管部分，先切割成约10公分大小块状，以绞肉机绞碎至无大块状组织，加入猪肺2倍重量的萃取液(0.02Μ柠檬酸钠ρΗ 7.0 士 0. 2)，以搅拌机充分混合均勻，秤取绞碎猪肺脏重量的5% (W/W)菠萝酵素(2000⑶U/g，ST BIO)与 0. 1% (w/w)的蛋白酶M酵素(5500untis/g，Amano)，以搅拌机充分搅拌均勻，于50°C水浴反应3小时，反应完成后再以水浴90°C 10分钟让酵素失活，静置于冰水中降温至25°C，力口入1.5% (W/W)6N盐酸搅拌均勻后静置室温下1小时，进行酸沉淀反应。上述样品以Iym 孔径纸板直接进行板式过滤，收集过滤液。以3倍体积的95%乙醇(食品级)沉淀，放入 4°C冷房12小时。以SOOO(Xg)，30分钟离心收集沉淀物，沉淀物再以0. 02M柠檬酸钠ρΗ 7.0回溶。实例2猪肺萃取物对纤维母细胞的毒性及抑制MMP-I的功效MMP-I同功酵素图谱分析1.细胞培养和毒性分析(1)细胞培养以含 10% FBS 的 a-MEM 培养基，种植总体积 0. ImL 的 1 X 104WS1 (BCRC 60300)细胞于96孔盘，隔夜去除上清液，取已知浓度的样品，以含有血清的培养基配制成0，0. 125， 0. 25,0. 5,lmg/mL 5个分析剂量，各3重复。再以0. 2 μ m的过滤膜过滤，取0. ImL加入细胞中，处理Mhr后去除上清液，再以无血清但含有lOng/mL TNF-的a_MEM培养基配制成0，0.125, 0.25, 0.5, lmg/mL 5个分析剂量各3重复，以0. 2 μ m的过滤膜过滤，取0. ImL加入
细胞中，再处理M小时后收集上清液，保存在-80°C，作为后续MMP-I同功酵素图谱分析样品。(2)毒性分析上述仍留在96孔盘的细胞，加入含有血清的培养基与MTS (IOOmL20mL)的混合液，37°C反应3小时，在0D.490/630nm分析细胞存活率。取存活率高于80% (定义为无毒性)的最高浓度者，分析MMP-I同功酵素图谱。2.同功酵素图谱分析(1)配制酵素电泳胶及电泳分析以含有0. 2%酪蛋白(casein)受质溶液，配制成10% SDS-PAGE电泳胶。取4μ L 的样品染料(sample dye) (200mM Tris-HCl, pH 值 6. 8，8% SDS，0. 4%溴酚蓝，40%甘油) 和20yL的样品混合均勻(样品染料样品=15)，置于室温10分钟，注入(loading) 到上述配制的电泳胶进行电泳分析，以固定80伏特至电泳结束。(2)同功酵素图谱反应取完成胶片浸泡在清洗缓冲液I (Wash buffer I)中，于室温下摇晃洗涤60分钟。 再换浸泡在清洗缓冲液II (Wash buffer II)中于室温下摇晃洗涤40分钟。最后于反应缓冲液(Reaction buffer)中，37°C作用 20 小时。(3)染色、退染及条带分析反应完成的胶片放置于染色溶液(0. 15%考马斯蓝R250)中染色60分钟。再置于去染溶液(40%甲醇，10%醋酸)中去色约30分钟，摇晃至透明带出现。最后浸泡在RO水中震荡10分钟。以Bio-Rad影像处理系统定量透明条带的光密度值。由图IA所示的猪肺萃取物对纤维母细胞的毒性试验图表可知，即便猪肺萃取物浓度达400 μ g/mL,也不会对细胞产生毒性而使细胞死亡。由图IB可知，对于对照组，猪肺萃取物浓度越高，确越可抑制MMP-I。图IC则将不同浓度的猪肺萃取物以及对照组对于 MMP-I的抑制率做成图表，显示越高浓度的猪肺萃取物具有抑制MMP-I的功效，而对照组则未有相同的抑制作用。实例3猪肺萃取物对纤维母细胞的毒性及抑制MMP-2/-9的功效MMP-2/-9同功酵素图谱分析1.细胞培养和毒性分析(1)细胞培养以含 10% FBS 的 DMEM培养基，种植总体积 0. ImL 的 1 X 104NIH/3T3 (BCRC60008)细胞于96孔盘，隔夜去除上清液，取已知浓度的样品，以含有血清的培养基配制成0，0. 125， 0. 25，0. 5，lmg/mL 5个分析剂量，各3重复，再以0. 2 μ m的过滤膜过滤，取0. ImL加入细胞中，处理Mir后去除上清液，再以未含有血清但含有TNF-的DMEM培养基配制成0，0. 125， 0. 25，0. 5，lmg/mL 5个分析剂量各3重复，以0. 2 μ m的过滤膜过滤，取0. ImL加入细胞中， 再处理M小时后收集上清液，保存在-80°C，作为后续MMP-2/-9同功酵素图谱分析样品。(2)细胞毒性分析同实施例二的细胞毒性分析试验步骤。2.同功酵素图谱分析(1)配制酵素电泳胶及电泳分析
以含有动物胶/酪蛋白受质溶液配制成10% SDS-PAGE电泳胶。取4μ L的样品染料QOOmM Tris-HCl, ρΗ值6. 8，8% SDS，0. 4%溴酚蓝，40%甘油)和20 μ L的样品混合均勻(样品染料样品=15)，置于室温10分钟，注入到上述配制的电泳胶进行电泳分析，以固定80伏特至电泳结束。(2)同功酵素图谱反应步骤同实施例二的功酵素图谱反应所述(3)染色、退染及条带分析步骤同实施例二的染色、退染及条带分析所述。由图2Α所示的猪肺萃取物对纤维母细胞的毒性试验图表可知，猪肺萃取物浓度达300 μ g/mL，也不会对细胞产生毒性而使细胞死亡，证实猪肺萃取物对细胞是安全的。由图2B可知，对于对照组，猪肺萃取物浓度越高，确越可抑制MMP-2以及MMP-9。图2C则将不同浓度的猪肺萃取物以及对照组对于MMP-2的抑制率做成图表，显示越高浓度的猪肺萃取物具有抑制MMP-2的功效，而对照组则未有相同的抑制作用。图2D则将不同浓度的猪肺萃取物以及对照组对于MMP-9的抑制率做成图表，显示越高浓度的猪肺萃取物具有抑制 MMP-9的功效，而对照组则未有相同的抑制作用。
权利要求
1.一种猪肺萃取物的用途，其是用于制备抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性的组合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述猪肺萃取物是利用以下步骤萃取而得(a)猪肺及其周边组织绞碎后加入缓冲液调整pH值约6.0-9. 0 ；(b)加入酵素于步骤(a)中保温酶解，酶解后升温使酵素失活；(c)加入酸液于步骤(b)中进行酸沉淀后，过滤收集滤液，且(d)加入有机溶剂于滤液中，收集沉淀物，得到猪肺萃取物。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述步骤(a)的猪肺为新鲜或冷冻猪肺。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述步骤(a)的pH值为约6.0-8.0、6.5-8.0、 6. 0-7. 5、或约 7. 0。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述步骤(a)中的缓冲液是柠檬酸钠或磷酸盐类。
6.如权利要求2所述的用途，其中所述步骤(b)中的酵素是菠萝酵素或蛋白酶M或其组合。
7.如权利要求2所述的用途，其中所述步骤(b)中的保温酶解温度是约50至55°C。
8.如权利要求2所述的用途，其中所述步骤(b)中的升温温度是约90至100°C。
9.如权利要求2所述的用途，其中所述步骤(c)中的酸液是盐酸、过氯酸或三氟醋酸。
10.如权利要求2所述的用途，其中所述步骤(d)中的有机溶剂是甲醇、乙醇或异丙醇。
11.如权利要求1所述的用途，其中所述的MMP是MMP-1、MMP_2或MMP-9。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述猪肺萃取物是同时抑制MMP-1、MMP_2及 MMP-9。
13.如权利要求1所述的用途，其中所述抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性的组合物可改善、减缓或防止皮肤老化。
14.如权利要求1所述的用途，其中所述的组合物另包含构成该组合物所需的载剂。
15.如权利要求1所述的用途，其中所述萃取物在所述组合物中的含量为约50μg/mL 至 500 μ g/mL。
16.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物可为化妆品、保养品、食品、保健食品、 健康食品、动物用药品、饲料添加剂或人类用药品。
全文摘要
本发明相关于猪肺萃取物作为基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)抑制剂的新用途，特别是用于抑制MMP-1、MMP-2或/及MMP-9。
文档编号A23K1/16GK102462699SQ201110189218
公开日2012年5月23日 申请日期2011年6月30日 优先权日2010年11月1日
发明者刘嘉哲, 张誉腾, 陈嘉琪, 陈怡菁 申请人:台湾糖业股份有限公司