专利名称：枯草芽孢杆菌hl-1及其在土壤解磷方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其应用，具体涉及一种枯草芽孢杆菌{Bacillus subtilis) HL-I及其在分解土壤难溶性磷和改善土壤微生态结构及促进植物生长等方面的应用。
背景技术：
磷是植物生长发育所必需的营养元素之一，对氮的固定、光合作用、能量转移、信号转导、生物大分子合成和呼吸作用都有着重要影响。世界上有57亿hm2 土壤缺磷，大多数土壤中磷浓度从在0. ΓΙΟ μ mol/L,而在理想状态下，禾本科植物生长所需的磷浓度为 1-5 μ mol/L,高需磷植物如西红柿、豌豆则为5飞0 μ mol/L。在磷没达到理想状态下，植物将减产5 15%。传统化学肥料的使用在一定程度上能减轻土壤中磷的缺乏，但作为中国磷肥的主要品种过磷酸钙和磷铵等，无论在北方石灰性土壤还是南方酸性土壤，因土壤强烈的固磷作用，当季利用率不足20%，造成资源浪费。我国有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95% 以上的磷为难溶形态，植物难以吸收利用。并且磷肥施入土壤后极易被化学固定，形成溶解性极低的磷酸钙、铁、铝等化合物，植物利用率仅为5 25%。即使经过多年不断的施用磷肥也没有明显的改善。增施磷肥是一种“高投入，低产出”的途径。同时，我国的磷肥资源匮乏， 生产能力难以满足需求。土壤中的磷元素并不缺乏，经过常年施用化肥的积累，磷元素在土壤中的含量很高，但植物无法吸收利用这些磷，如能提高土壤中磷的利用率将为中国农业带来巨大变化。因此，提高磷肥利用效率，增强土壤磷素的活化与利用成为科学研究的重要任务。解磷微生物是土壤中能够将无效磷转化为植物可以吸收利用的有效磷的一类特殊微生物功能群体，能改进磷肥固定、提高磷肥利用率和溶解土壤难溶磷，在自然及农业生态的磷素生物地化循环中起到了关键作用，已经被世界公认为是一种廉价高效的环保型土壤磷活化生物措施。它们通过酸解、螯合、置换及分泌磷酸酶等方式将无效磷转化为能被植物利用的有效磷(主要是hpo42_和形式)。大量研究表明，施用含有解磷菌的微生物肥料对促进植物生长、改善土壤结构效果显著。利用溶磷微生物对提高磷肥的有效性和土壤难溶磷的利用率、减少磷肥投入、发挥我国有限磷矿的增产作用和农业持续发展意义重大。 鉴于不同种类的溶磷菌或不同菌株之间的溶磷能力有较大差异，高效溶磷菌的筛选工作尤为重要。目前用于制作生物肥料的解磷菌剂普遍使用蛭石、草炭、珍珠岩和沸石粉等作为吸附载体，这些物质皆为不可再生资源，如能寻求一种可再生资源，使其可以部分或完全代替目前常用的不可再生资源，不仅起到节约资源的作用，并能促进农业废弃物的循环利用， 从而达到农业可持续发展的目的。番石榴渣是番石榴加工过程的副产品，纤维含量高，作为吸附剂在去除废水中染料和去除重金属污染方面取得了显著效果和应用前景。番石榴渣外观与微生物菌剂载体泥炭类似，质地较轻显褐棕色，番石榴渣含水量约4 5%，具有比泥炭 (含水量30%左右)含水量低的优点。然而，使用可再生资源——番石榴渣作为生物肥吸附剂材料，代替常用的不可再生资源，制成具有高效解磷效果的菌剂，未曾见报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中的上述不足，提供一种枯草芽孢杆菌。本发明的另一目的是提供上述菌株的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL-l，简称HL-I菌。该菌株的分类命名为 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2011年8月M日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 5175，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株筛选自广东省广州市火炉山土壤中，为革兰氏阳性菌，在牛肉膏蛋白胨培养基上培养12h，在显微镜下观察菌体以单个或成对排列，芽孢数量极少(3飞％)，在牛肉膏蛋白胨培养基上培养Mh，菌体以单个、成对或链状排列，芽孢中生或近中生，芽孢数 80、0%，芽孢形成后菌体不膨大，菌体为杆状，无荚膜，有运动性，需氧。在营养琼脂培养基上培养24h后形成的菌落为圆形，微黄色，表面粗糙不透明，边缘不整齐。经过序列测定，该枯草芽孢杆菌HL-I的16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所不。由上述枯草芽孢杆菌HL-I制成的菌剂。枯草芽孢杆菌HL-I菌剂的制备方法，是将活化的菌株接种到种子培养基，在培养温度30°C、转速113rpm条件下摇床培养24h后，得到一级种子液，然后按10 15%接种量转接到种子罐培养，用二级种子培养基在30°C、通气量1000L/h、转速70rpm条件下培养Mh， 得到二级种子液，将二级种子液按1(Γ15%接种量接种到发酵罐，在发酵培养基中继续发酵罐深层培养(即扩大培养)，培养条件为30°C、通气量10000L/h、转速70rpm，培养Mh。培养后的发酵液与硅藻土和番石榴渣混合，发酵液硅藻土 番石榴渣的质量比为0.6:1:1 ；搅拌均勻后，粉碎，制备成所述菌剂。其中每IL种子培养基含有牛肉膏5g、蛋白胨5g、氯化钠5g，余下为水，pH值 7. Γ7. 4 ；种子培养基经过115 121°〇灭菌20min，备用。每IL 二级种子培养基和发酵培养基含有豆粕粉30g、麦麸粉10g、硝酸铵1. 5g、 酵母膏3g、氯化钠2. 5g、硫酸镁0. 2g、磷酸氢二钾0. 3g和硫酸锰0. 05g,余下为水，pH值 7.广7. 4。枯草芽孢杆菌HL-I菌剂的具体制备步骤如下 (1) 一级种子培养
种子培养基成分牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，蒸馏水1L，pH值7.广7. 4。 培养基115 121°C灭菌20min，接入活化后的HL-I菌，摇床培养。培养条件30°C，转速 113rpm，时间 24h。(2) 二级种子发酵培养
二级种子培养基成分豆粕粉30g，麦麸粉10g，硝酸铵1. 5g，酵母膏3g，氯化钠2. 5g， 硫酸镁0. 2g，磷酸氢二钾0. 3g，硫酸锰0. 05g，水1L，调节pH值为7.广7.4，121°C灭菌 20min,待降温至30°C，接入一级种子液，接种比例为1:10 (10L 二级种子培养基接种IL 一级种子液)。设置发酵温度为30°C，转速为70rpm，通气量为10000L/h，罐压保持在 0. 02 0. 03MPao(3)发酵罐扩大培养
发酵培养基成分同二级种子培养基。30°C时，接入二级种子液，接种比例为1:10。设置发酵温度为30°C，转速为70rpm，通气量为10000L/h，罐压保持在0. 02 0. 03MPa。(4)吸附载体的添加
将步骤(3)培养后的菌液、硅藻土、番石榴渣按质量比0.6:1:1在搅拌机内混合均勻， 粉碎后制成菌剂。(5)菌剂的包装和贮存
称取菌剂分装于铝质袋中，密封，存放于通风干燥处。本发明的枯草芽孢杆菌HL-I在分解难溶性磷、促进植物生长和/或增加土壤微生物群落多样性和增加微生物丰度中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
发明人经过大量的实验研究，筛选出枯草芽孢杆菌ifeciBm subtilis HL-1。该菌株不仅可以提高土壤中难溶磷的有效性和磷肥利用率，从而促进植物生长，提高土壤微生物多样性，对减少化肥施用，改善土壤微生态和促进土壤可持续利用具有重要的意义。以豆柏麦麸等为主要成分的发酵培养基，具有制备工艺简单，效果好，成本低等优点，并使用可再生资源——番石榴渣作为吸附载体，具有节约资源、变废为宝、促进农业废弃物的循环利用等优点。
图1. HL-I菌革兰氏染色显微照片；
图2. HL-I菌芽孢染色显微照片，图中蓝色部分为芽孢；
图3.不同菌株在磷酸钙培养基下产水溶性磷含量的对比图，横坐标为菌株编号，纵坐标为水溶性磷浓度；
图4.不同菌株在磷酸钙培养基下产微生物磷含量的对比图，横坐标为菌株编号，纵坐标为微生物磷浓度；
图5.为HL-I菌促进玉米生长田间效果对比图6.不同菌株处理土壤微生物群落代谢活性AWCD值变化的曲线图，其中HL-I为HL-I 菌，CK为对照组。
具体实施例方式实施例1枯草芽孢杆菌HL-I的分离、纯化和鉴定 (1)分离
配制难溶无机磷培养基葡萄糖10. Og,硫酸铵0. 5g，氯化钠0. 3g，氯化钾0. 3g，七水硫酸亚铁0. 03g,四水硫酸锰0. 03g，酵母膏0. 4g，磷酸钙5g，蒸馏水1L，pH值7. 0 7· 5。以广东省广州市天河区火炉山上采集的土壤为筛选土样，采用平板涂布法准确称取待测土样10. 0g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min， 使微生物充分分散，静置2(T30s，取上清液进行10倍递减稀释，采用10，105稀释度，用移液枪分别移取稀释液0. lmL，涂布在难溶无机磷培养基平板上，28°C倒置培养7d，逐日观察溶磷圈，记录溶磷菌菌落(d)和溶磷圈直径(D)。筛选出有解磷圈的细菌菌株编号为a_4， a-7, a-15，和b-17，其中a-15的解磷效果最强。经分子生物学鉴定和生理生化鉴定后，确定a-15菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is)。(2)纯化
营养琼脂培养基牛肉膏3. 0g，蛋白胨5. 0g，氯化钠5. 0g，琼脂18. 0g，蒸馏水lL，pH值 7. 0 7· 2。将筛选出的菌株利用平板划线法纯化后，保存于营养琼脂斜面培养基上，本发明中简称HL-I菌。实施例2特性鉴定 (1)菌体形态特征
革兰氏阳性菌，有芽孢，芽孢形成后菌体不膨大。菌体为杆状，无荚膜，有运动性，需氧。 革兰氏染色效果见图1，菌体被染成蓝紫色，芽孢未着色。芽孢染色效果见图2，菌体呈黄棕色，芽孢为浅蓝色。(2)菌落形态特征
在营养琼脂培养基上形成的菌落为圆形，微黄色，表面粗糙不透明，边缘不整齐。(3)生理生化特性
根据Biolog微生物鉴定仪，分析此菌株在好氧条件下对31种不同碳源的利用情况，结果见表1。表1 HL-I菌对31种不同碳源的利用情况
特性结果特性结果水+甲基D-葡萄糖苷+D-半乳糖内酯+D-半乳糖内酯+丙酮酸甲脂+D-木糖+D-半乳糖醛酸+L-天冬酰胺酸+吐温40+I-赤藻糖醇+羟苯甲酸—L-苯基丙氨酸+吐温80—D-甘露醇4-羟基苯甲酸+L-丝氨酸+a-环式糊精+N-乙酰基-D-葡萄胺+y-羟基丁酸+L-苏氨酸+肝糖+D-葡萄胺酸+衣康酸+甘氨酰-L-谷氨酸+D-纤维二糖+葡萄糖-ι-磷酸盐+a-丁酮酸+苯乙基胺+a-D-乳糖+D, L-a-甘油+D-苹果酸+腐胺+
注+表示为阳性或可以利用；一表示为阴性或不能利用 (4)分子生物学特性
采用试剂盒法提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物F63 (CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC, SEQ ID N0:2)和 R1087 (CTC GTTGCG GGA CTT ACC CC, SEQ ID N0:3)，PCR 扩增细菌的16S rDNA，在IOOObp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，将获得的DNA序列输入GenBank，以Blast程序对数据库中的所有序列进行比较分析，结
6果发现本发明菌株的16S rDNA序列和与GenBank中枯草芽孢杆菌具有较高的同源性，其相似度为99%。结合上述的平板菌落特征、Biolog微平板培养结果、16S rDNA序列的结果以及参照《伯杰细菌鉴定手册》进行生理生化实验，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Mcillus sub tills ), 'bp'Bacillus subtil is HL—1。实施例3 HL-I菌在不同碳源环境下的生长特性
牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000ml，pH为7. Γ7. 4。分别以玉米粉、麦麸、葡萄糖、花生麸、蔗糖、米糠和植物淀粉7种物质作为碳源， 浓度均为20g/L，替代牛肉膏蛋白胨培养基中的牛肉膏，其它成分不变。将上述7种培养基煮沸lOmin，自然降温至室温，用lmol/L的NaOH或者HCl调节pH值为7.广7. 5，制备成发酵培养基。在250mL三角瓶中分装各组培养基45mL，灭菌，各组培养基做三次重复。按照 10%的接种量将HL-I菌接种到上述灭菌后的发酵培养基，在温度33°C，转速113rpm条件下培养Mh，用平板菌落计数法测定各组培养基中的活菌数。结果表明(表2):HL-1菌在以麦麸为碳源的环境下，其生长特性最佳，活菌数为5. 44士0. 22X 108cfu/mL。
权利要求
1.枯草芽孢杆菌HL-1，于2011年8月M日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 5175。
2.根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌HL-I，其特征在于其16SrDNA核苷酸序列如SEQ ID N0:1 所示。
3.由权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌HL-I制备成的菌剂。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于是由枯草芽孢杆菌HL-1、硅藻土和番石榴渣组成。
5.权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于是将活化的菌株按1(Γ15%接种量接种到种子培养基，在培养温度30°C、转速113rpm条件下，摇床培养Mh，得到一级种子液，然后按1(Γ15%接种量转接到种子罐培养，用二级种子培养基在30°C、通气量1000L/h、转速 70rpm条件下培养Mh，得到二级种子液，将二级种子液按1(Γ 5%接种量接种到发酵罐，在发酵培养基中继续扩大培养，在30°C、通气量10000L/h、转速70rpm条件下培养Mh，培养后的发酵液加入硅藻土和番石榴渣，搅拌均勻，粉碎，制备成所述菌剂；其中每IL 一级种子培养基含有牛肉膏5g、蛋白胨5g、氯化钠5g，余下为水，pH值 7. Γ7. 4 ；每IL 二级种子培养基和发酵培养基含有豆粕粉30g、麦麸粉10g、硝酸铵1. 5g、酵母膏 3g、氯化钠2. 5g、硫酸镁0. 2g、磷酸氢二钾0. 3g和硫酸锰0. 05g，余下为水，pH值7. Γ7. 4。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于培养后的发酵液硅藻土番石榴渣的质量比为0.6:1:1。
7.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌HL-I在分解难溶性磷中的应用。
8.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌HL-I在促进植物生长中的应用。
9.权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌HL-I在增加土壤微生物群落多样性和增加微生物丰度中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌HL-1及其在土壤解磷方面的应用。该菌株于2011年8月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.5175，其16SrDNA核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。该枯草芽孢杆菌HL-1发酵液可以添加硅藻土和番石榴渣吸附剂材料制备成菌剂。该菌株能够提高土壤磷的有效性和磷肥利用率，促进植物生长，提高土壤微生物多样性，对减少化肥施用，改善土壤微生态和促进土壤可持续利用具有重要的意义，在生产实践中具有广泛的应用前景。
文档编号C05F11/08GK102399713SQ20111028265
公开日2012年4月4日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者孔德颖, 孙礼勇, 李永涛, 王亚君, 蔡燕飞, 赵肃清, 陈昊, 黄娟 申请人:华南农业大学