一种生物膜吸附磷的测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物膜吸附磷的测定方法。该方法包括如下步骤：(1)采集水体中的生物膜，将生物膜粉碎、混匀，得湿重生物膜；(2)将湿重生物膜分成质量相同的三份：1)测定湿重生物膜Ⅰ的干重M；2)将湿重生物膜Ⅱ置于水中，对磷进行解析，水的体积记为V0；解析平衡后，测定解析之后的水中磷的浓度，记为C0；3)配制磷溶液，体积记为V，磷的浓度记为Cmax；将湿重生物膜Ⅲ置于磷溶液中，对磷溶液中的磷进行吸附，待吸附平衡后，测定磷溶液中磷的浓度，记为Cmin；(3)根据G＝[(Cmax?Cmin)×V+C0×V0]/M计算生物膜吸附磷的吸附率G。本发明首次提出了生物膜吸附磷的准确测定方法，通过准确测定生物膜吸附磷的吸附率指标，可对生物膜吸附磷的能力进行定量的评价。
【专利说明】
一种生物膜吸附磷的测定方法
技术领域
[0001]本发明属于水环境技术领域，具体涉及一种生物膜吸附磷的测定方法。
【背景技术】
[0002]磷是自然界中常见的一种重要元素，是生物所必须的营养物质，广泛存在于动、植物组织中，并与蛋白质或脂肪结合成核蛋白、磷蛋白和磷脂等，也有少量其它有机磷和无机磷化合物。
[0003]当水体中氮、磷等植物营养物质含量过多时，藻类等浮游植物快速生长，疯狂繁殖，消耗水体中大量溶解氧，使水变黑、变臭，鱼类和其他水生物大量死亡，这就是水体富营养化。
[0004]大多数学者的研究结果表明，水体中的磷是水体浮游藻类最主要的限制性营养元素，水体中磷的含量与湖泊的营养程度有极为密切的关系。当水体中磷处于低浓度时，即使氮营养物能满足藻类等水生生物所需，其生产能力也会大受遏制，而水体中磷的浓度在0.02mg/L以上时，对水体的富营养化就起明显的促进作用。营养盐吸收动力学研究表明，浮游植物生长需要的无机氮N的阈值为14yg/L，无机磷P的阈值为3.1yg/L，如果N: P > 22，则P为限制元素;如果N:P<10，则N为限制元素。而多数水体的N:P大于22，有的甚至高达40。因此，研究水体中磷含量，解决水体富营养化问题的关键是如何减少水体中磷的含量。
[0005]生物膜是一种广泛存在于天然水体中的复杂系统，是一种由生命物质和非生命物质、有机物和无机物组成的复合体，对水环境中物质的迀移转化具有非常重要的作用。
[0006]生物膜在天然水体中广泛存在，几乎所有暴露于水中的固体表面上都附着有生物膜。只要有水和微生物，就可能产生生物膜。微生物细胞几乎能在任何适宜的载体表面牢固地附着，并在其上生长和繁殖，由细胞内向外伸展的胞外聚合物使微生物细胞形成纤维状的缠结结构，形成生物膜。
[0007]根据研究角度和维度的不同，对生物膜的组成成分有不同的观点。医学和微生物学领域的生物膜，一般指由一种或多种微生物(主要是细菌)组成的膜，代表了一类微生物群体，其中有各种寄居者如固着细菌、原生动物、真菌和藻类。在膜科学及污水处理技术领域，生物膜主要是指在各种生物膜反应器和各种污水处理设备上附着的各种微生物(包括细菌、真菌、原生动物、一些藻类，甚至一些后生动物)，用于降解有机质，处理废水。在水环境研究中，生物膜则泛指存在于水环境固相基质表面，由微生物及其它有机成分、与微生物等有机成分相结合的金属氧化物和其它无机矿物质共同组成的复合表面附着物。
[0008]生物膜对污染物的吸附性是广泛的，既可以吸附有机污染物，也可以吸附无机污染物。有研究显示，生物膜对苯酚、硝基苯酚等有机污染物的吸附规律也类似于生物膜吸附重金属盐，其吸附等温线也符合Freudl ich方程、Langmuir方程，主要差异在于吸附效果。有学者利用重液分离方法对自然水体中的生物膜、悬浮颗粒物和表层沉积物中的轻、重组分进行了分离，采用批量平衡法研究了各固相样品及其轻、重组分对六六六(HCHs)和滴滴涕(DDTs)的吸附特征，发现生物膜和悬浮颗粒物对HCHs和DDTs的吸附过程同时发生线性的分配作用和非线性的孔隙填充作用。有学者考察了松花江表层沉积物和生物膜对双酚A的吸附规律，吸附过程主要为非线性吸附，吸附热力学特征可用Freundlich和Langmuir等温线描述，与表层沉积物相比，生物膜有机质含量较高，具有较强的吸附能力。
[0009]生物膜吸附无机污染物方面，研究最多的是生物膜吸附重金属离子，目前专门针对生物膜吸附磷的研究文献比较少，也未见有文献描述准确测定生物膜吸附磷的方法。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种生物膜吸附磷的测定方法，该方法能够准确测定生物膜吸附磷的吸附率，从而对各种不同类型生物膜吸附磷的能力进行评价，探究各种不同类型生物膜吸附磷的机理及规律，这对于认识水环境中生物膜对磷的行为，利用生物膜去除水体中的磷，防治水体富营养化有重要的实用价值。
[0011]本发明提供的一种生物膜吸附磷的测定方法，它包括如下步骤:
[0012](I)采集水体中的生物膜，将所述生物膜粉碎、混匀，得湿重生物膜；
[0013](2)将所述湿重生物膜分成质量相同的三份:湿重生物膜1、湿重生物膜Π和湿重生物膜m，并分别进行如下处理:
[0014]I)测定所述湿重生物膜I的干重，记为M;
[0015]2)将所述湿重生物膜Π置于水中，对所述湿重生物膜Π中的磷进行解析，所述水的体积记为VO;解析平衡后，测定解析之后的水中磷的质量体积浓度，记为CO;
[0016]3)配制磷溶液，将所述磷溶液的体积记为V，所述磷溶液中磷的质量体积浓度记为Cmax;将所述湿重生物膜ΙΠ置于所述磷溶液中，对所述磷溶液中的磷进行吸附，待吸附平衡后，测定所述磷溶液中磷的质量体积浓度，记为Cmin;
[0017](3)根据下述公式(I)即可得到所述生物膜吸附磷的吸附率，记为G:
[0018]G= [(Cmax-Cmin) XV+C0XV0]/M (I)。
[0019]上述的测定方法，步骤(I)中，所述生物膜泛指由金属氧化物、矿物盐、微生物(细菌、真菌、藻类等)细胞、胞外聚合物等无机成分和有机成分聚集而成的复合固相集合体。
[0020]所述湿重生物膜的粒径可为0.05?2mm。
[0021]所述混匀可在振荡器中进行，振荡速度可为O?240r/min(如200r/min)，振荡时间可为I?48小时(如12小时)。
[0022]上述的测定方法，步骤(2)中，所述湿重生物膜在分成三份之前还包括将其自然晾干至不再形成水滴的步骤，具体可在室温(15?30 °C)下晾10分钟。
[0023]步骤I)中，测定所述湿重生物膜I的干重的方法可为下述方法(A)或方法(B):
[0024]所述方法(A)的步骤如下:将所述湿重生物膜I烘干、称重，得到所述湿重生物膜I的干重，记为M;
[0025]所述(B)包括如下步骤:
[0026]a)称取至少三份不同质量的湿重生物膜，分别烘干，得干重，拟合出干重-湿重的线性关系；
[0027]b)将所述湿重生物膜I的湿重代入步骤a)中所述干重-湿重的线性关系中，得到所述湿重生物膜I的干重，记为M。
[0028]所述方法(A)和所述方法(B)中，所述烘干的温度可为45?120 °C (如105°C )，时间可为I?8小时(如2小时)。
[0029]所述方法(B)中，每次称重前都要进行，且称重过程不宜过长，应在半小时内一次性连续称重。原因是由于每次采集的生物膜疏松程度、称重时的含水量等有较大差异，湿重-干重线性回归能够保证湿重与干重比值的准确性。
[0030]步骤2)中，每Ig的所述湿重生物膜Π置于50?200mL的水中，具体可为每Ig的所述湿重生物膜Π置于I OOmL的水中。
[0031 ] 所述解析的温度可为15?30°C，如25°C。
[0032 ]所述解析之后的水中磷的质量体积浓度的测定方法可采用钼酸铵分光光度法，如国家标准《GB 11893-1989-T水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》。
[0033]步骤3)中，每Ig的所述湿重生物膜m置于体积为100?500mL的磷溶液中，具体可为2g的所述湿重生物膜ΙΠ置于250mL的磷溶液中；所述磷溶液的浓度可为0.5?50mg/L，具体可为 2 ?5mg/L、2mg/L 或 5mg/L。
[0034]所述吸附的条件如下:温度可为O?45°C (如20?25°C、20°C或25°C)，振荡速率可为O?240r/min(如O?180r/min、0r/min或 180r/min)，磷溶液的浓度可为0.5?50mg/L，(如2?5mg/L、2mg/L或5mg/L)。
[0035]所述磷溶液中磷的质量体积浓度的测定方法可采用钼酸铵分光光度法，如国家标准《GB 11893-1989-T水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》。
[0036]上述的测定方法，步骤(3)中，所述吸附率指单位质量的干重生物膜所吸附的磷元素的质量。
[0037]所述公式(I)中，6的单位可为吸附率的常用单位，如mg/g、mg/Kg等;M的单位可为质量的常用单位，如g、Kg等;V0、V的单位可为体积的常用单位，如mL、L等;Cmax、Cmin的单位可为质量体积浓度的常用单位，如mg/L。在计算过程中，如单位不统一，需要先对各个物理量进行换算。
[0038]本发明具有如下有益效果:
[0039]本发明首次创造性的提出了生物膜吸附磷的准确测定方法，通过准确测定生物膜吸附磷的吸附率指标，可以对生物膜吸附磷的能力进行定量的评价，同时对研究生物膜吸附磷的动力学特征、热力学特征及影响因素提供了技术手段。本发明对利用生物膜去除水体中的磷，防治水体富营养化具有重要意义。
【具体实施方式】
[0040]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042]下述实施例中的烘干操作采用电热恒温鼓风干燥箱。称重采用电子天平。吸附过程中，磷溶液的温度控制采用电热恒温水浴锅。磷溶液的振荡速率控制采用调速多用振荡器。
[0043]实施例1、河水中生物膜吸附磷的测定
[0044]本实施例所用生物膜采集自永定河自然水体。采集水体中的生物膜时，需要注意区分生物膜与底泥、苔藓。用镊子和小刀小心刮取生物膜。取下来的生物膜放在装有水体原水的玻璃容器中。采集的生物膜形状各异，大小不一，且含有少许岩肩等杂质，需要进行必要的前处理。
[0045]按照如下步骤测定上述水体中生物膜中磷的吸附率:
[0046](I)采集水体中的生物膜，将生物膜粉碎、混匀，得湿重生物膜;具体操作如下:用玻璃棒将大块生物膜捣碎，并用200r/min振荡器振荡12小时，使生物膜充分混合均匀，过2mm方孔师去除杂质，并用0.05mm师去除细小颗粒。
[0047](2)将步骤(I)中的生物膜在室温(25 °C)下在分析筛中晾10分钟左右，待其不再形成水滴时称重，分成质量相同的三份:湿重生物膜1、湿重生物膜Π和湿重生物膜m，三份湿重生物膜质量相同均为2克，并分别进行如下处理:
[0048]I)湿重生物膜I在105°C条件下烘干2小时，测其干重(M)为0.616克。
[0049]2)湿重生物膜Π用于测定生物膜中磷的背景含量。将湿重生物膜Π置于水中，对湿重生物膜Π中的磷进行解析，水的体积记为VO;解析平衡后，测定解析之后的水中磷的质量体积浓度，记为CO ；具体操作如下:
[0050]取200毫升的蒸馏水于玻璃容器中，加入湿重生物膜Π进行解析。解析过程就是生物膜在蒸馏水中释放吸附的磷。解析开始后按一定时间间隔(如12h、24h、36h、48h……)取溶液测定磷浓度，若相邻两次测得的磷浓度基本不再变化，则解析达到平衡。解析达到平衡后测定的磷的质量体积浓度(CO)乘以蒸馏水的体积(VO)，就得到第二份生物膜中磷元素的背景含量C0*V0。
[0051 ]磷浓度的测定方法采用钼酸铵分光光度法测定磷浓度。此方法是目前公认的准确测定溶液中磷浓度的方法。具体操作见国家标准《GB 11893-1989-T水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》。
[0052]本实施例中，湿重生物膜的质量为2g，水的体积VO为200毫升，在室温(25°C)下进行解析，解析达到平衡后测定的磷的质量体积浓度(CO)为0.121mg/L。
[0053]3)配制磷浓度为5mg//L的磷溶液。取250毫升磷浓度为5mg//L的磷溶液于玻璃容器中，加入湿重生物膜m，在25°C温度、Or/min回旋振荡速率吸附条件下进行吸附，吸附开始后按一定时间间隔(如12h、24h、36h、48h……)取溶液测定磷浓度，若相邻两次测得的浓度基本不再变化，则吸附达到平衡。
[0054]磷浓度为5mg/L的磷溶液的配制步骤如下:称取约0.5克磷酸二氢钾(KH2PO4,化学纯，分子量为136.09，其中磷元素P的相对原子量为30.97)置于烘干箱中，用110°C高温烘2小时，在烘干箱中放冷后，用电子天平称取0.2197±0.0Ol克溶解于水中并转移至1000毫升玻璃容器，加入大约800毫升蒸馏水、5毫升50%含量的硫酸，再加蒸馏水至标线。此磷溶液的磷浓度为50mg/L，可以在玻璃瓶中贮存六个月以上。取25毫升磷浓度为50mg/L的磷溶液，转移至250毫升玻璃容器，加蒸馏水至250毫升标线。此磷溶液的磷浓度为5mg/L。
[0055]测定磷浓度的方法采用钼酸铵分光光度法测定磷浓度。此方法是目前公认的准确测定溶液中磷浓度的方法。具体操作见国家标准《GB 11893-1989-T水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》。
[0056]本实施例中，磷溶液中磷的质量体积浓度Cmax为5mg/L，吸附平衡后磷溶液中磷的质量体积浓度Cmin为2.564mg/L，磷溶液的体积为250mL。吸附达到平衡所用时间为96小时。
[0057](3)根据下述公式(I)即可得到生物膜吸附磷的吸附率，记为G:
[0058]G= [(Cmax-Cmin) X V+CO X VO]/M( I)。
[0059]这是因为，步骤3)中一定干重质量(M)的生物膜吸附一定初始浓度(Cmax)、一定体积(V)的磷溶液，经过一段时间后，磷浓度从初始浓度Cmax变化到t时刻浓度Ct，最终达到平衡浓度Cmin。在t时刻，生物膜吸附的磷含量为(Cmax-Ct)*V。在吸附达到平衡后，生物膜吸附的磷含量为(Cmax-Cmin)*V。以上磷含量加上步骤2)测定的背景磷含量，就得到此生物膜所能吸附的最大磷含量:(Cmax_Cmin)*V+C0*V0。此生物膜吸附的最大磷含量除以步骤I)测定的生物膜干重(M)，就得到此生物膜吸附磷的吸附率:((Cmax-Cmin)*V+C0*V0)/M。
[0060]本实施例中，在25°C温度、Or/min回旋振荡速率、磷溶液的磷浓度为5mg/L吸附条件下，生物膜吸附磷的吸附率G为1027mg/Kg。
[0061 ]实施例2、湖中生物膜吸附磷的测定
[0062]本实施例所用生物膜采集自清华大学荷塘湖自然水体。采集水体中的生物膜时，需要注意区分生物膜与底泥、苔藓。用镊子和小刀小心刮取生物膜。取下来的生物膜放在装有水体原水的玻璃容器中。采集的生物膜形状各异，大小不一，且含有少许岩肩等杂质，需要进行必要的前处理。
[0063]按照如下步骤测定上述水体中生物膜中磷的吸附率:
[0064](I)采集水体中的生物膜，将生物膜粉碎、混匀，得湿重生物膜;具体操作如下:用玻璃棒将大块生物膜捣碎，并用200r/min振荡器振荡12小时，使生物膜充分混合均匀，过2mm方孔师去除杂质，并用0.05mm师去除细小颗粒。
[0065](2)将步骤(I)中的生物膜在室温(20 °C)下在分析筛中晾10分钟左右，待其不再形成水滴时称重，分成质量相同的三份:湿重生物膜1、湿重生物膜π和湿重生物膜m，三份湿重生物膜质量相同均为?克，并分别进行如下处理:
[0066]I)湿重生物膜I在105°C条件下烘干2小时，测其干重(M)为0.291克。
[0067]2)湿重生物膜Π用于测定生物膜中磷的背景含量。将湿重生物膜Π置于水中，对湿重生物膜Π中的磷进行解析，水的体积记为VO;解析平衡后，测定解析之后的水中磷的质量体积浓度，记为CO ；具体操作如下:
[0068]取100毫升的蒸馏水于玻璃容器中，加入湿重生物膜Π进行解析。解析过程就是生物膜在蒸馏水中释放吸附的磷。解析开始后按一定时间间隔(如12h、24h、36h、48h……)取溶液测定磷浓度，若相邻两次测得的磷浓度基本不再变化，则解析达到平衡。解析达到平衡后测定的磷的质量体积浓度(CO)乘以蒸馏水的体积(VO)，就得到第二份生物膜中磷元素的背景含量C0*V0。
[0069]磷浓度的测定方法采用钼酸铵分光光度法测定磷浓度。此方法是目前公认的准确测定溶液中磷浓度的方法。具体操作见国家标准《GB 11893-1989-T水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》。
[0070]本实施例中，湿重生物膜的质量为lg，水的体积VO为100毫升，在室温(20°C)下进行解析，解析达到平衡后测定的磷的质量体积浓度(CO)为0.113mg/L。
[0071]3)配制磷浓度为2mg//L的磷溶液。取250毫升磷浓度为2mg//L的磷溶液于玻璃容器中，加入湿重生物膜ΙΠ，在20°C温度、180r/min回旋振荡速率吸附条件下进行吸附，吸附开始后按一定时间间隔(如12h、24h、36h、48h……)取溶液测定磷浓度，若相邻两次测得的浓度基本不再变化，则吸附达到平衡。
[0072]磷浓度为2mg/L的磷溶液的配制步骤如下:称取约0.5克磷酸二氢钾(KH2PO4,化学纯，分子量为136.09，其中磷元素P的相对原子量为30.97)置于烘干箱中，用110°C高温烘2小时，在烘干箱中放冷后，用电子天平称取0.2197±0.001克溶解于水中并转移至1000毫升玻璃容器，加入大约800毫升蒸馏水、5毫升50%含量的硫酸，再加蒸馏水至标线。此磷溶液的磷浓度为50mg/L，可以在玻璃瓶中贮存六个月以上。取10毫升磷浓度为50mg/L的磷溶液，转移至250毫升玻璃容器，加蒸馏水至250毫升标线。此磷溶液的磷浓度为2mg/L。
[0073]测定磷浓度的方法采用钼酸铵分光光度法测定磷浓度。此方法是目前公认的准确测定溶液中磷浓度的方法。具体操作见国家标准《GB 11893-1989-T水质总磷的测定钼酸铵分光光度法》。
[0074]本实施例中，磷溶液中磷的质量体积浓度Cmax为2mg/L，吸附平衡后磷溶液中磷的质量体积浓度Cmin为0.044mg/L，磷溶液的体积为250mL。吸附达到平衡所用时间为140小时。
[0075](3)根据下述公式(I)即可得到生物膜吸附磷的吸附率，记为G:
[0076]G= [(Cmax-Cmin) XV+C0XV0]/M (I)。
[0077]这是因为，步骤3)中一定干重质量(M)的生物膜吸附一定初始浓度(Cmax)、一定体积(V)的磷溶液，经过一段时间后，磷浓度从初始浓度Cmax变化到t时刻浓度Ct，最终达到平衡浓度Cmin。在t时刻，生物膜吸附的磷含量为(Cmax-Ct)*V。在吸附达到平衡后，生物膜吸附的磷含量为(Cmax-Cmin)*V。以上磷含量加上步骤2)测定的背景磷含量，就得到此生物膜所能吸附的最大磷含量:(Cmax_Cmin)*V+C0*V0。此生物膜吸附的最大磷含量除以步骤I)测定的生物膜干重(M)，就得到此生物膜吸附磷的吸附率:((Cmax-Cmin)*V+C0*V0)/M。
[0078]本实施例中，在20°C温度、180r/min回旋振荡速率、磷溶液的磷浓度为2mg/L吸附条件下，生物膜吸附磷的吸附率G为1719mg/Kg。
【主权项】
1.一种生物膜吸附磷的测定方法，它包括如下步骤: (1)采集水体中的生物膜，将所述生物膜粉碎、混匀，得湿重生物膜； (2)将所述湿重生物膜分成质量相同的三份:湿重生物膜1、湿重生物膜Π和湿重生物膜m，并分别进行如下处理: 1)测定所述湿重生物膜I的干重，记为M; 2)将所述湿重生物膜Π置于水中，对所述湿重生物膜Π中的磷进行解析，所述水的体积记为VO;解析平衡后，测定解析之后的水中磷的质量体积浓度，记为CO; 3)配制磷溶液，将所述磷溶液的体积记为V，所述磷溶液中磷的质量体积浓度记为Cmax;将所述湿重生物膜ΙΠ置于所述磷溶液中，对所述磷溶液中的磷进行吸附，待吸附平衡后，测定所述磷溶液中磷的质量体积浓度，记为Cmin; (3)根据下述公式(I)即可得到所述生物膜吸附磷的吸附率，记为G: G= [(Cmax-Cmin) X V+CO X V0]/M( I)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述湿重生物膜的粒径为0.05?2mm03.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，所述混匀在振荡器中进行，振荡速度为O?240r/min，振荡时间为I?48小时。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于:步骤I)中，测定所述湿重生物膜I的干重的方法为下述方法(A)S方法(B): 所述方法(A)的步骤如下:将所述湿重生物膜I烘干、称重，得到所述湿重生物膜I的干重，记为M; 所述(B)包括如下步骤:a)称取至少三份不同质量的湿重生物膜，分别烘干，得干重，拟合出干重-湿重的线性关系;b)将所述湿重生物膜I的湿重代入步骤a)中所述干重-湿重的线性关系中，得到所述湿重生物膜I的干重，记为M。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述方法(A)和所述方法(B)中，所述烘干的温度为45?120°C，时间为I?8小时。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于:步骤2)中，每Ig的所述湿重生物膜Π置于50?200mL的水中。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于:步骤2)中，所述解析的温度为15?30。。。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于:步骤3)中，每Ig的所述湿重生物膜ΙΠ置于100?500mL磷溶液中；所述磷溶液的浓度为0.5?50mg/mL。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于:步骤3)中，所述吸附的条件如下:温度为O?45°C，振荡速率为O?240r/min。
【文档编号】G01N5/02GK106053283SQ201610532387
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】李玲, 陈永灿, 刘昭伟
【申请人】清华大学