专利名称：一种鲟科鱼类卵子的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种鲟科鱼类卵子的筛选方法。
背景技术：
鲟鱼(Acipenseriformes)是一群古老的生物，具有极高的研究价值和经济价值。 我国于上世纪九十年代初，开始鲟鱼养殖研究，规模发展迅速，至2008年，我国已成为世界最大的养鲟大国，年产量21. 396吨，占世界鲟鱼总量的83%。鲟鱼的卵子质量直接关系到胚胎发育以及仔稚鱼的成活和生长，与养殖效果紧密相关。此外，配子质量还可以反馈亲鱼培育状况、对指导苗种生产等也具有重要的意义。对鱼类卵子质量的评价通常是对其外部形态结构特征和生产性状能的检测，如色泽、受精率、死亡率等，对卵子、卵巢液和雌性血清的基础生化组成等方面研究相对较少。虽然，鲟科鱼类繁殖后期中的受精率、孵化率和成活率等生产性状是评价其配子质量最直接的指标，但这些指标涉及到后期养殖，不能在繁殖早期判断其卵子的质量，避免不必要的损失。目前，国内外还没有使用多种方法进行鲟科鱼类卵子筛选的方法，国外也只建立鲟科鱼类卵子质量单一的评价方法，不能全面地反映其卵子的特性。
发明内容
本发明是要解决现有的鱼类卵子质量的检测方法中缺少综合评价，导致评价方法存在偏差的问题，提供一种鲟科鱼类卵子的筛选方法。本发明鲟科鱼类卵子的筛选方法，按以下步骤进行一、从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液将步骤一取出的卵子剪碎，取鲜重5g，加入12 17mL浓度为0. 02 0. 05mol/L、pH为7. 2 8. 0的Tris-HCl缓冲液，在0 4°C研磨，得到的勻浆于12000 20000r/min的转速离心10 20min，取上清液，即为卵提取液；三、血清的制备将20 30mL新鲜的鲟科鱼类尾椎静脉血或尾椎动脉血室温放置20 40min后，于0 4°C低温保存20 25h，然后于2000 4000r/min离心20 30min，抽取血清，保存备用；四、体液的制备将步骤一取出的卵子经筛网过滤后，采集卵腔液15mL/尾，于液氮罐内保存五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度；七、根据卵提取液测定鲟科鱼类卵狗离子的含量、卵Si离子的含量、卵Ve的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、根据体液测定鲟科鱼类体液ACP的含量和AKP的含量；九、选取同时满足从鲟科鱼类体内取出卵子中85%的卵子的卵母细胞的极化指数> 0. 07，鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度> 200 μ g/ mL，卵Fe离子的含量彡170 μ mol/L,卵Zn离子的含量彡145 μ mol/L,卵Ve的含量彡0. 12g/ mL，卵谷草转氨酶的含量彡1400U/L,体液ACP的含量彡85U/g和AKP的含量彡39U/g的鲟科鱼类的卵，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。本发明的原理如下当血清卵黄蛋白原浓度彡200μ g/mL时，鲟科鱼类卵巢发育为IV期-V期，卵狗离子、离子、Ve和谷草转氨酶的含量与鲟科鱼类的受精率显著相关，体液ACP和AKP的含量与鲟科鱼类的受精率显著相关，卵母细胞胚泡接近动物极卵膜边缘，卵母细胞即成熟，因此其极化指数越低，卵母细胞越成熟。当检测的各项指标得到标准，即说明同一卵巢内的其他卵子已达到成熟，可用于体外受精。本发明的方法不仅可以定性鉴别鲟科鱼类的卵子质量，还可以定量的评价多种鲟科鱼类的繁殖性能，通过全面地评价鲟科鱼类的卵子质量，筛选出优质卵子。与单一的卵形态结构、生化组成等传统的鱼类卵子质量检测方法相比，本方法具有灵敏度高、方便快捷、 准确率高等优点，而且对受检鱼损伤小，是进行鲟鱼类卵子质量鉴别的理想方法。本发明的方法使得鲟鱼的受精卵质量大大提高，受精率达85%以上，孵化率达到95%，鱼苗的成活率达到90%。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式鲟科鱼类卵子的筛选方法，按以下步骤进行一、 从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液将步骤一取出的卵子剪碎，取鲜重5g，加入 12 17mL浓度为0. 02 0. 05mol/L、pH为7. 2 8. 0的Tris-HCl缓冲液，在0 4°C研磨， 得到的勻浆于12000 20000r/min的转速离心10 20min，取上清液，即为卵提取液；三、 血清的制备将20 30mL新鲜的鲟科鱼类尾椎静脉血或尾椎动脉血室温放置20 40min 后，于0 4°C低温保存20 25h，然后于2000 4000r/min离心20 30min，抽取血清， 保存备用；四、体液的制备将步骤一取出的卵子经筛网过滤后，采集卵腔液15mL/尾，于液氮罐内保存五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度；七、根据卵提取液测定鲟科鱼类卵狗离子的含量、卵Si离子的含量、卵Ve的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、根据体液测定鲟科鱼类体液ACP的含量和AKP的含量；九、选取同时满足从鲟科鱼类体内取出卵子中85%的卵子的卵母细胞的极化指数> 0. 07，鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度彡200 μ g/mL,卵Fe离子的含量彡170 μ mol/L,卵Zn离子的含量彡145 μ mol/L, 卵Ve的含量彡0. 12g/mL,卵谷草转氨酶的含量彡1400U/L,体液ACP的含量彡85U/g和AKP 的含量> 39U/g的鲟科鱼类的卵，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。 步骤八所述ACP为酸性磷酸酶，AKP为碱性磷酸酶。本实施方式的方法不仅可以定性鉴别鲟科鱼类的卵子质量，还可以定量的评价多种鲟科鱼类的繁殖性能，通过全面地评价鲟科鱼类的卵子质量，筛选出优质卵子。与单一的卵形态结构、生化组成等传统的鱼类卵子质量检测方法相比，本方法具有灵敏度高、方便快捷、准确率高等优点，而且对受检鱼损伤小，是进行鲟鱼类卵子质量鉴别的理想方法。本实施方式的方法使得鲟鱼的受精卵质量大大提高，受精率达85%以上，孵化率达到95%，鱼苗的成活率达到90%。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中从鲟科鱼类体内取出卵子的方法为将鲟科鱼类用丁香油水溶液麻醉，然后于尾部腹面3 5骨板处， 使用取卵器沿腹壁肌肉直入体腔内部取出卵子；所述丁香油水溶液由丁香油和水按体积比 1 IO4组成。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤五中测定卵母细胞的极化指数的方法为取步骤一得到的卵子30粒，放入沸水内，煮沸2 4分钟后， 冷却至室温，然后沿卵极轴切开，测定胚泡到动物极卵膜的距离和胚泡到植物极卵膜的距离，按以下公式计算卵母细胞的极化指数，卵母细胞的极化指数=胚泡到动物极卵膜的距离/胚泡到植物极卵膜的距离。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤六中测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度的方法为在96孔酶标板每孔中加入100 μ L的卵黄磷蛋白标准品，然后于4°C包被Mi ；弃去酶标板中的液体，每孔加入360 μ L封闭液，置于4°C封闭24h ；洗涤弃去封闭液，每孔加入300 μ L洗涤液，轻微震荡Imin后，弃去洗涤液，重复洗涤3次；每孔加入100 μ L步骤三制备的血清和100 μ L酶标抗体，室温孵育Ih后，弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤4次；每孔加入100 μ L显色液，于室温暗处反应20分钟，加入50 μ L终止液，终止反应；用酶标仪测定OD值后，计算血清卵黄蛋白原浓度；其中终止液为0. 5mol/ L的；洗涤液为含体积百分比浓度0. 05% Tween20的稀释液，稀释液为PBS缓冲液，pH 为7. 4 ；封闭液为含体积百分比浓度牛血清白蛋白的稀释液；显色液为邻苯二胺溶液。 其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤七中测定鲟科鱼类卵狗离子的含量的方法为取IOmL试管3支，一支试管作测定管，测定管中依次加入0. 2mL步骤二得到的卵提取液、2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液、0. ImLO. 5mmol/ L的显色剂非咯嗪；一支试管做空白管，空白管中依次加入2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液、0. ImL 0. 5mmol/L的显色剂非咯嗪；另一支试管作标准管，标准管中依次加入0. 2mL 35. 7 μ mol/L的标准液硫酸亚铁，2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液，0. ImLO. 5mmol/L的显色剂非咯嗪，将三支试管混合均勻后，置于37°C水浴中lOmin，然后用分光光度计比色，波长 578nm，试剂空白调零点，读取吸光度值，计算狗离子的浓度；其中甘氨酸和盐酸羟胺的混合液中甘氨酸的浓度为lOOmmol/L，盐酸羟胺的浓度为2mmol/L。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤七中测定卵Si离子的含量的方法为取IOmL试管3支，一支试管作测定管，测定管中依次加入0. 2mL步骤二得到的卵提取液、1. 5mL浓度为100mmol/L的Tris、0. ImL浓度为7mmol/ L的锌贡显色剂；一支试管作空白管，空白管中依次加入1. 7mL浓度为lOOmmol/L的Tris、 0. ImL浓度为7mmol/L的锌贡显色剂；另一支试管作标准管，标准管中依次加入0. 2mL浓度为15. 4 μ mol/L的硫酸锌，0. ImL浓度为7mmol/L的锌贡显色剂；将三支试管混合均勻后， 置于37°C水浴中5min，然后用分光光度计比色，波长630nm，试剂空白调零点，读取吸光度值，计算Si离子的浓度。其它与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤七中测定卵^的含量的方法为取IOmL试管3支，一支试管作测定管，测定管中依次加入0. 4mL步骤二得到的卵提取液、0. 3mL蒸馏水、0. 6mL无水乙醇；一支试管作空白管，空白管中依次加入0. 7mL蒸馏水、0. 6mL无水乙醇；另一支试管作标准管，标准管中依次加入0. 6mL蒸馏水， 0. ImL 12 μ g/mL的Ve标准品、0. 6mL无水乙醇；将三支试管漩涡震荡混勻20秒后，分别加入1. 2mL正庚烷，漩涡震荡混勻Imin后于3000 4000r/min离心5 IOmin ；分别取最上层抽提液进行Ve的显色反应取IOmL试管3支，一支作测定管，一支做空白管，另一支作标准管，各管分别加入相应的抽提液0. 7mL,各加0. ImL显色剂和0. 05mLFeCl3乙醇液，混勻， 显色5分钟后各加1. OmL磷酸乙醇液，混勻后于分光光度计波长560nm，0. 5cm比色，试剂空
白管调零，计算Ve的浓度。其它与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤七中测定卵谷草转氨酶的含量的方法为取IOmL试管2支，一支作测定管，依次加入0. ImL步骤二得到的卵提取液和0. 5mL谷草转氨酶底物液；另一支作对照管，仅加入0. ImL步骤二得到的卵提取液，将二管同时置37°C水浴，60min后取出，各管分别加0.5mL 2，4-二硝基苯胼液终止反应，对照管再加0. 5mL谷草转氨酶底物液，将二管再置37°C水浴中20min，取出后各管分别加5mL 0. 4mol/L的NaOH，混勻，IOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度；将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积，若查得的丙酮酸体积超过0. 2mL时应将步骤二得到的卵提取液稀释后再进行测定，测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积，根据1 μ mol丙酮酸所需1个酶活力单位，计算谷草转氨酶的酶活力。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤八中测定鲟科鱼类体液ACP的含量的方法为取IOmL试管3支，一支作测定管，测定管中依次加入0. 05mL步骤四制备的体液、0. 5mL pH为5. 4的0. lmol/L的柠檬酸缓冲液，0. 5mL浓度为 2mmol/L的基质液DCAP-P ；—支做空白管，空白管中依次加入0. 05mL双蒸水、0. 5mL pH为 5. 4的0. lmol/L的柠檬酸缓冲液，0. 5mL浓度为2mmol/L的基质液DCAP-P ；另一支作标准管，标准管中依次加入0. 05mL浓度为0. lmg/mL的酚标准液、0. 5mL pH为5. 4的0. lmol/L 的柠檬酸缓冲液、0. 5mL浓度为2mmol/L的基质液DCAP-P ；将三管混勻后，置于37°C水浴中 30min，然后加入ImL碱液，加入显色剂，混合后于室温静置lOmin，用分光光度计比色，波长 520nm，试剂空白调零点，读取吸光度值，计算ACP的浓度；其中碱液的制备方法为4. 2g碳酸氢钠和0. Ig 4 一氨基安替比林溶于IOOmL蒸馏水中，再加入IOOmL浓度为0. 5mol/L的 NaOH，混勻；显色剂的制备方法为将2. 5g铁氰化钾和17g硼酸分别溶于400mL蒸馏水中， 得到两种溶液，将两种溶液混合，加水至1L，放于棕色瓶内暗处保存。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤八中测定鲟科鱼类体液AKP的含量的方法为取IOmL试管3支，一支作测定管，测定管中依次加入 0. 05mL步骤四制备的体液、0. 5mL缓冲液，0. 5mL基质液；一支做空白管，空白管中依次加入 0. 05mL双蒸水、0. 5mL缓冲液、0. 5mL基质液；另一支作标准管，标准管中依次加入0. 05mL 浓度为0. lmg/mL的酚标准液、0. 5mL缓冲液、0. 5mL基质液；将三管混合后，置于37°C水浴中15min，然后加入1. 5mL显色剂，混合后室温静置lOmin，用分光光度计比色，波长520nm， 试剂空白调零点，读取吸光度值，计算AKP的浓度；其中每IOOOmL缓冲液由15. 8g pH为10 的无水碳酸钠、8. 4g碳酸氢钠、1. 235g结晶硫酸镁和余量的蒸馏水组成；每200mL基质液由 218mL浓度为15mmol/L的无水磷酸苯二钠、IOmL pH为10的贮存缓冲液、IOmL体积浓度为 3%的4-氨基安替吡啉和余量的蒸馏水组成；显色剂为体积浓度为2. 4%的高铁氰化钾水溶液。其它与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式鲟科鱼类卵子的筛选方法，按以下步骤进行一、 从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液将步骤一取出的卵子剪碎，取鲜重5g，加入15mL浓度为0. 02mol/L、pH为8. 0的Tris-HCl缓冲液，在4°C研磨，得到的勻浆于20000" min的转速离心lOmin，取上清液，即为卵提取液；三、血清的制备将20mL新鲜的鲟科鱼类尾椎静脉血或尾椎动脉血室温放置30min后，于4°C低温保存Mh，然后于3000r/min离心20min，抽取血清，保存备用；四、体液的制备将步骤一取出的卵子经筛网过滤后，采集卵腔液15mL/尾，于液氮罐内保存五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度；七、根据卵提取液测定鲟科鱼类卵狗离子的含量、卵Si离子的含量、卵Ve 的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、根据体液测定鲟科鱼类体液ACP的含量和AKP的含量； 九、选取同时满足从鲟科鱼类体内取出卵子中85%的卵子的卵母细胞的极化指数>0. 07， 鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度彡200 μ g/mL,卵！^离子的含量彡170 μ mol/L,卵Si离子的含量彡145μπι01/1，卵含量彡0. 12g/mL，卵谷草转氨酶的含量彡1400U/L，体液ACP的含量彡85U/g和AKP的含量彡39U/g的鲟科鱼类的卵，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。
本实施方式的方法使得鲟鱼的受精卵质量大大提高，受精率达88%，孵化率达到 95%，鱼苗的成活率达到90%
权利要求
1.一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于鲟科鱼类卵子的筛选方法，按以下步骤进行一、从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液将步骤一取出的卵子剪碎，取鲜重 5g,加入12 17mL浓度为0. 02 0. 05mol/L、pH为7. 2 8. 0的Tris-HCl缓冲液，在 0 4°C研磨，得到的勻浆于12000 20000r/min的转速离心10 20min，取上清液，即为卵提取液；三、血清的制备将20 30mL新鲜的鲟科鱼类尾椎静脉血或尾椎动脉血室温放置20 40min后，于0 4°C低温保存20 25h，然后于2000 4000r/min离心20 30min，抽取血清，保存备用；四、体液的制备将步骤一取出的卵子经筛网过滤后，采集卵腔液15mL/尾，于液氮罐内保存五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度；七、根据卵提取液测定鲟科鱼类卵狗离子的含量、卵Si离子的含量、卵Ve的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、根据体液测定鲟科鱼类体液ACP的含量和AKP的含量；九、 选取同时满足从鲟科鱼类体内取出卵子中85%的卵子的卵母细胞的极化指数> 0. 07，鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度彡200 μ g/mL,卵！^离子的含量彡170 μ mol/L,卵Si离子的含量彡145μπι01/1，卵含量彡0. 12g/mL，卵谷草转氨酶的含量彡1400U/L，体液ACP的含量彡85U/g和AKP的含量彡39U/g的鲟科鱼类的卵，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。
2.根据权利要求1所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤一中从鲟科鱼类体内取出卵子的方法为将鲟科鱼类用丁香油水溶液麻醉，然后于尾部腹面3 5骨板处，使用取卵器沿腹壁肌肉直入体腔内部取出卵子；所述丁香油水溶液由丁香油和水按体积比1 IO4组成。
3.根据权利要求1或2所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤五中测定卵母细胞的极化指数的方法为取步骤一得到的卵子30粒，放入沸水内，煮沸2 4分钟后，冷却至室温，然后沿卵极轴切开，测定胚泡到动物极卵膜的距离和胚泡到植物极卵膜的距离，按以下公式计算卵母细胞的极化指数，卵母细胞的极化指数=胚泡到动物极卵膜的距离/胚泡到植物极卵膜的距离。
4.根据权利要求3所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤六中测定鲟科鱼类血清卵黄蛋白原浓度的方法为在96孔酶标板每孔中加入100 μ L的卵黄磷蛋白标准品，然后于4°C包被Mi ；弃去酶标板中的液体，每孔加入360 μ L封闭液，置于4°C封闭 24h ；洗涤弃去封闭液，每孔加入300 μ L洗涤液，轻微震荡Imin后，弃去洗涤液，重复洗涤 3次；每孔加入100 μ L步骤三制备的血清和100 μ L酶标抗体，室温孵育Ih后，弃去酶标抗体，用洗涤液洗涤4次；每孔加入100 μ L显色液，于室温暗处反应20分钟，加入50 μ L终止液，终止反应；用酶标仪测定OD值后，计算血清卵黄蛋白原浓度；其中终止液为0. 5mol/ L的；洗涤液为含体积百分比浓度0. 05% Tween20的稀释液，稀释液为PBS缓冲液，pH 为7. 4 ；封闭液为含体积百分比浓度牛血清白蛋白的稀释液；显色液为邻苯二胺溶液。
5.根据权利要求4所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤七中测定鲟科鱼类卵1 离子的含量的方法为取IOmL试管3支，一支试管作测定管，测定管中依次加入0. 2mL步骤二得到的卵提取液、2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液、0. ImL 0. 5mmol/ L的显色剂非咯嗪；一支试管做空白管，空白管中依次加入2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液、0. ImL 0. 5mmol/L的显色剂非咯嗪；另一支试管作标准管，标准管中依次加入 0. 2mL35. 7 μ mol/L的标准液硫酸亚铁，2mL甘氨酸和盐酸羟胺的混合液，0. ImL 0. 5mmol/ L的显色剂非咯嗪，将三支试管混合均勻后，置于37°C水浴中lOmin，然后用分光光度计比色，波长578nm，试剂空白调零点，读取吸光度值，计算！^离子的浓度；其中甘氨酸和盐酸羟胺的混合液中甘氨酸的浓度为lOOmmol/L，盐酸羟胺的浓度为2mmol/L。
6.根据权利要求5所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤七中测定卵 Si离子的含量的方法为取IOmL试管3支，一支试管作测定管，测定管中依次加入0. 2mL步骤二得到的卵提取液、1. 5mL浓度为100mmol/L的Tris、0. ImL浓度为7mmol/L的锌贡显色剂；一支试管作空白管，空白管中依次加入1. 7mL浓度为lOOmmol/L的Tris、0. ImL浓度为 7mmol/L的锌贡显色剂；另一支试管作标准管，标准管中依次加入0. 2mL浓度为15. 4ymol/ L的硫酸锌，0. ImL浓度为7mmol/L的锌贡显色剂；将三支试管混合均勻后，置于37°C水浴中5min，然后用分光光度计比色，波长630nm，试剂空白调零点，读取吸光度值，计算Si离子的浓度。
7.根据权利要求6所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤七中测定卵VE的含量的方法为取IOmL试管3支，一支试管作测定管，测定管中依次加入0. 4mL步骤二得到的卵提取液、0. 3mL蒸馏水、0. 6mL无水乙醇；一支试管作空白管，空白管中依次加入0. 7mL蒸馏水、0. 6mL无水乙醇；另一支试管作标准管，标准管中依次加入0. 6mL蒸馏水， 0. ImL 12 μ g/mL的Ve标准品、0. 6mL无水乙醇；将三支试管漩涡震荡混勻20秒后，分别加入1. 2mL正庚烷，漩涡震荡混勻Imin后于3000 4000r/min离心5 IOmin ；分别取最上层抽提液进行Ve的显色反应取IOmL试管3支，一支作测定管，一支做空白管，另一支作标准管，各管分别加入相应的抽提液0. 7mL,各加0. ImL显色剂和0. 05mL FeCl3乙醇液，混勻， 显色5分钟后各加1. OmL磷酸乙醇液，混勻后于分光光度计波长560nm，0. 5cm比色，试剂空白管调零，计算Ve的浓度。
8.根据权利要求7所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤七中测定卵谷草转氨酶的含量的方法为取IOmL试管2支，一支作测定管，依次加入0. ImL步骤二得到的卵提取液和0. 5mL谷草转氨酶底物液；另一支作对照管，仅加入0. ImL步骤二得到的卵提取液，将二管同时置37°C水浴，60min后取出，各管分别加0. 5mL 2，4-二硝基苯胼液终止反应，对照管再加0. 5mL谷草转氨酶底物液，将二管再置37°C水浴中20min，取出后各管分别加5mL 0. 4mol/L的NaOH，混勻，IOmin后用分光光度计比色，波长500nm，蒸馏水调零点，读取吸光度；将测定管吸光度减去对照管吸光度，得吸光度差值，查工作曲线即可查得丙酮酸体积，若查得的丙酮酸体积超过0. 2mL时应将步骤二得到的卵提取液稀释后再进行测定， 测定结果乘以稀释倍数即得丙酮酸体积，根据1 μ mol丙酮酸所需1个酶活力单位，计算谷草转氨酶的酶活力。
9.根据权利要求8所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤八中测定鲟科鱼类体液ACP的含量的方法为取IOmL试管3支，一支作测定管，测定管中依次加入 0. 05mL步骤四制备的体液、0. 5mL pH为5. 4的0. lmol/L的柠檬酸缓冲液，0. 5mL浓度为 2mmol/L的基质液DCAP-P ；—支做空白管，空白管中依次加入0. 05mL双蒸水、0. 5mL pH为 5. 4的0. lmol/L的柠檬酸缓冲液，0. 5mL浓度为2mmol/L的基质液DCAP-P ；另一支作标准管，标准管中依次加入0. 05mL浓度为0. lmg/mL的酚标准液、0. 5mL pH为5. 4的0. lmol/L 的柠檬酸缓冲液、0. 5mL浓度为2mmol/L的基质液DCAP-P ；将三管混勻后，置于37°C水浴中 30min，然后加入ImL碱液，加入显色剂，混合后于室温静置lOmin，用分光光度计比色，波长 520nm，试剂空白调零点，读取吸光度值，计算ACP的浓度；其中碱液的制备方法为4. 2g碳酸氢钠和0. Ig 4 一氨基安替比林溶于IOOmL蒸馏水中，再加入IOOmL浓度为0. 5mol/L的 NaOH，混勻；显色剂的制备方法为将2. 5g铁氰化钾和17g硼酸分别溶于400mL蒸馏水中， 得到两种溶液，将两种溶液混合，加水至1L，放于棕色瓶内暗处保存。
10.根据权利要求9所述的一种鲟科鱼类卵子的筛选方法，其特征在于步骤八中测定鲟科鱼类体液AKP的含量的方法为取IOmL试管3支，一支作测定管，测定管中依次加入 0. 05mL步骤四制备的体液、0. 5mL缓冲液，0. 5mL基质液；一支做空白管，空白管中依次加入 0. 05mL双蒸水、0. 5mL缓冲液、0. 5mL基质液；另一支作标准管，标准管中依次加入0. 05mL 浓度为0. lmg/mL的酚标准液、0. 5mL缓冲液、0. 5mL基质液；将三管混合后，置于37°C水浴中15min，然后加入1. 5mL显色剂，混合后室温静置lOmin，用分光光度计比色，波长520nm， 试剂空白调零点，读取吸光度值，计算AKP的浓度；其中每IOOOmL缓冲液由15. 8g pH为10 的无水碳酸钠、8. 4g碳酸氢钠、1. 235g结晶硫酸镁和余量的蒸馏水组成；每200mL基质液由 218mL浓度为15mmol/L的无水磷酸苯二钠、IOmL pH为10的贮存缓冲液、IOmL体积浓度为 3%的4-氨基安替吡啉和余量的蒸馏水组成；显色剂为体积浓度为2. 4%的高铁氰化钾水溶液。
全文摘要
本发明涉及一种鲟科鱼类卵子的筛选方法。要解决现有的鱼类卵子质量的检测方法中缺少综合评价，导致评价方法存在偏差的问题。方法一、从鲟科鱼类体内取出卵子；二、制备卵提取液；三、血清的制备；四、体液的制备；五、测定卵母细胞的极化指数；六、测定血清卵黄蛋白原浓度；七、测定Fe离子的含量、卵Zn离子的含量、卵VE的含量和卵谷草转氨酶的含量；八、测定ACP的含量和AKP的含量；九、测定的各项指标同时满足目标值，即表明同一卵巢内的其他卵子已达到成熟，即完成鲟科鱼类卵子的筛选。本发明方法使鲟鱼的受精率达85％以上，孵化率达到95％，鱼苗的成活率达到90％。用于鲟科鱼类的繁殖。
文档编号A01K61/00GK102440202SQ201110292690
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者刘晓勇, 孙大江, 张颖, 曲秋芝 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所