专利名称：用于藏獒精子保存的冷冻液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于藏獒精子保存的冷冻液，用于藏獒精液的冷冻及人工授精。
背景技术：
藏獒主要饲养繁育在中国青藏高原牧区，藏獒长期受高海拔、低气温、低氧量的生态环境影响，具备体型高大，性格刚毅凶猛等特点，深受我国甚至世界藏獒爱好者的称赞。近20年来，藏獒文化、经济得到了快速的发展，藏獒养殖已使牧民形成了致富的产业， 给牧民带来了数以千万经济收入。由于管理粗放，没有进行专门的选育改良，再加上环境的变迁和优良种群的流失，藏獒本身的繁殖力和繁殖成活率低等因素，使藏獒处于濒临灭绝的境地。学者们对藏獒精液冷冻技术进行了较深入研究，通过人工授精以改良藏獒，提高藏獒的繁殖率。然而藏獒精液品质对藏獒改良及提高繁殖率是至关重要的一环，研究发现好多内在和外在的因素都会影响藏獒精液的品质，还有好多尚未解决的问题需要进行较为深入的研究。想寻求一条纯种藏獒也是很困难的。其次藏獒繁殖的季节性强，母獒每年只有一次发情，制约了纯种藏獒的繁殖和培育。且藏獒精子与其它犬科动物的精子类似，在冻融过程中对低温损伤的抗性较弱，冻融后精子活力下降，受孕率及窝产仔平均数均低于自然繁殖。影响犬精液冷冻成功与否的关键是稀释液配方，稀释液质量的优劣直接影响藏獒精液冷冻与人工受精的成败。
发明内容
本发明提供一种用于藏獒精子保存的冷冻液，提高了冻精的活力、复苏率、顶体的完整率等，从而使受胎率和窝产仔平均数明显提高，达到或接近了自交水平。本发明采用的技术方案是
用于藏獒精子保存的冷冻液，该稀释液的制备方法是
A液的各组分及重量为氯化钙0. 22-0. 58g、氯化钾0. 11-0. 45g、氯化锌0. 25-0. 75g、 氯化钠0. 9-1. 2g、磷酸二氢钠0. 14-0. 70g、醋酸钠0. 21-0. 56g、黄芪多糖0. 015-0. 045g、加双蒸水定容至500-1000mL而成；
B液的各组分及重量为取A液35-55mL，小藏獒血清20_30mL、大豆油20_25mL、甘油 5-10mL、银杏总黄酮0. 01-0. 02g，混合而成用于藏獒精子保存的冷冻液，pH值为6. 5-7. 0。黄芪多糖、银杏总黄酮来自天津尖峰公司。小藏獒血清的提取纯化方法
(1)采小藏獒静脉血，分离出血清在无菌条件下采6个月以内小藏獒静脉血，放于4°C 冰箱中过夜，自然分离出一部分血清，剩余部分在无菌条件下，10000rpm，4°C离心25分钟，分离出血清备用；
(2)乙醇除蛋白按照乙醇和血清体积比为2 1的量向血清中加入95%乙醇，搅拌， 静置100分钟，使蛋白质变性沉淀，离心(6000转/分，10分钟)后留上清弃沉淀；(3)除乙醇利用真空旋转蒸发仪，37°C，1个大气压减压除乙醇；
(4)粗滤用截留分子量100000D的中空纤维柱粗滤，收集滤液；
(5)酶解在滤液中加入复合蛋白酶，每10升血清加入复合蛋白酶9-10mg，其中纤维素蛋白酶和胃蛋白酶的比例为400 1 ；
(6)离心在4°C、IOOOOrpm条件下离心30分钟，弃沉淀留上清；
(7)超滤用截留分子量5000D的中空纤维柱超滤，收集滤液；
(8)纯化用交联葡聚糖G-50凝胶层析脱盐(层析液为pH6. 8的Tris- Hcl缓冲液)，收集280nm波长紫外线吸收部分，调pH为7. 6 ；然后选用DEAE-S印hadex-50凝胶层析(胶床高度和直径的比为20 1，柱直径选用4. 5cm)，洗脱液为Tris- Hcl缓冲液，含 NaCl 的浓度为 0. 07mol/l，1.0 mol/1，pH 为 7. 9，流速为 3_5ml/min，用 280nm 紫外线检测，弃去0.07mol/l NaCl洗脱部分，收集1.0 mol/1 NaCl洗脱部分，减压浓缩到相对密度为 1. 07-1. 09 ；
(9)病毒灭活采用微孔滤膜滤过+短波紫外线照射进行病毒灭活；采用的微孔滤膜为 0. 025微米；用波长为254nm的短波紫外线，强度为1000 μ w/cm 2，直接照射时间为10秒；
得到小藏獒血清产品。小藏獒血清的提取纯化方法可以按照小牛血清的提取纯化方法的方法来制备，只需要将原料由小牛静脉血换为小藏獒静脉血就可以了。本发明用于藏獒精子保存的冷冻液有以下用途，一是用于藏獒精液低温保存，如果去掉甘油等低温保护剂，则还可用于藏獒精液的常温保存。
具体实施例实施例1
本发明用于藏獒精子保存的冷冻液
A液的各组分及重量为氯化钙0. 22g、氯化钾0. llg、氯化锌0. 25g、氯化钠0. 9g、磷酸二氢钠0. 14g、醋酸钠0. 21g、黄芪多糖0. 015g、加双蒸水定容至500mL而成；
B液的各组分及重量为取A液35mL，小藏獒血清20mL、大豆油20mL、甘油5mL、银杏总黄酮0. Olg，混合而成本发明的冷冻液，PH值为6. 5。实施例2
本发明用于藏獒精子保存的冷冻液
A液的各组分及重量为氯化钙0. 58g、氯化钾0. 45g、氯化锌0. 75g、氯化钠1. 2g、磷酸二氢钠0. 70g、醋酸钠0. 56g、黄芪多糖0. 045g、加双蒸水定容至IOOOmL而成；
B液的各组分及重量为取A液55mL，小藏獒血清30mL、大豆油25mL、甘油10mL、银杏总黄酮0. 02g，混合而成本发明的冷冻液，pH值为7. 0。实施例3
2009年1月，使用实施例2藏獒精子的冷冻液，在兰州某山区养獒基地采精后，按1 :1 比例与藏獒精液进行同温稀释，放入o°c的保温盒中，马上做飞机返回上海，对上海的发情
的母藏獒进行人工授精试验结果 __
I采精数(只)I受孕数(只)I受胎率(％ ) I窝产仔平均数(只
权利要求
1.用于藏獒精子保存的冷冻液，其特征在于该稀释液的制备方法是A液的各组分及重量为氯化钙0. 22-0. 58g、氯化钾0. 11-0. 45g、氯化锌0. 25-0. 75g、 氯化钠0. 9-1. 2g、磷酸二氢钠0. 14-0. 70g、醋酸钠0. 21-0. 56g、黄芪多糖0. 015-0. 045g、加双蒸水定容至500-1000mL而成；B液的各组分及重量为取A液35-55mL，小藏獒血清20_30mL、大豆油20_25mL、甘油 5-10mL、银杏总黄酮0. 01-0. 02g,混合而成本发明冷冻液，pH值为6. 5-7. 0。
2.用于藏獒精子保存的冷冻液，其特征在于该稀释液的制备方法是A液的各组分及重量为氯化钙0. 22g、氯化钾0. llg、氯化锌0. 25g、氯化钠0. 9g、磷酸二氢钠0. 14g、醋酸钠0. 21g、黄芪多糖0. 015g、加双蒸水定容至500mL而成；B液的各组分及重量为取A液35mL，小藏獒血清20mL、大豆油20mL、甘油5mL、银杏总黄酮0. Olg，混合而成本发明的冷冻液，PH值为6. 5。
3.用于藏獒精子保存的冷冻液，其特征在于该稀释液的制备方法是A液的各组分及重量为氯化钙0. 58g、氯化钾0. 45g、氯化锌0. 75g、氯化钠1. 2g、磷酸二氢钠0. 70g、醋酸钠0. 56g、黄芪多糖0. 045g、加双蒸水定容至IOOOmL而成；B液的各组分及重量为取A液55mL，小藏獒血清30mL、大豆油25mL、甘油10mL、银杏总黄酮0. 02g，混合而成本发明的冷冻液，pH值为7. 0。
全文摘要
本发明涉及一种用于藏獒精子保存的冷冻液，用于藏獒精液的冷冻及人工授精。该发明能提高冻精的活力、复苏率、顶体的完整率等，其受胎率和窝产仔平均数达到或接近了自然交配水平，具有推广价值。
文档编号A01N1/02GK102379279SQ20111036571
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者张大宇 申请人:张大宇