专利名称：一种诱导大豆产生大豆抗毒素的方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导大豆产生大豆抗毒素的方法。
背景技术：
大豆(Glycine max)是豆科大豆属一年生草本植物，在豆类中营养价值最高。除了大豆本身所固有的异黄酮类化合物具有多种生物学作用外，大豆在压力条件下会产生一种诱导产物大豆抗毒素(glyceollins)，结构式如式I-III所示；其可以高效阻断妇科肿瘤的生长和扩散。已有的研究结果表明，大豆抗毒素可以抑制53.4%MCF-7肿瘤增长及73. 1% BG-I肿瘤增长。此外，大豆抗毒素可以完全抑制雌激素诱导的MCF-7细胞中黄体酮受体的表达，并部分抑制其在BG-I细胞的表达，以此来阻断肿瘤的生长和扩散。glyceollins有可
能成为大豆中的又一健康元素。褐藻酸寡糖(alginate oligosaccharides，AOS)主要是通过采用化学或是生物方法降解褐藻胶(algin)得到的，褐藻胶广泛存在于褐藻中，是褐藻细胞壁的填充物质之一。 褐藻酸寡糖对于促进机体生长、提高机体免疫防御能力，降低病害的侵扰有着特殊的功效。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过外源刺激大豆来获得大豆抗毒素的方法。本发明所提供的方法，是以褐藻酸寡糖为诱导剂、大豆为原料，通过浸泡、诱导、培养，制得富含大豆抗毒素的大豆。具体制备方法包括下述步骤1)对大豆籽粒进行预处理，使其膨胀并去除种皮，得到大豆子叶；2)在所述大豆子叶表面喷洒褐藻酸寡糖溶液并进行培养，得到含大豆抗毒素的大豆。其中，步骤1)中所述大豆籽粒具体可选自下述任意一种黄豆籽粒、青豆籽粒和黑豆籽粒。其中，黄豆籽粒包括转基因黄豆籽粒和非转基因黄豆籽粒。对大豆籽粒进行预处理的方法具体如下首先用体积含量为75%的乙醇溶液对于大豆籽粒进行灭菌消毒，然后对消毒后的大豆籽粒用无菌水淋洗，接着将大豆籽粒在无菌水中浸泡，最后将浸泡膨胀后的大豆籽粒脱去种皮。
在上述灭菌消毒的过程中，大豆籽粒与体积含量为75%的乙醇溶液的配比可为 Ig 3-5ml，灭菌消毒的时间可为3-5min ；在上述淋洗的过程中，大豆籽粒与无菌水的配比可为Ig 3_5ml，淋洗的次数可为2-3遍；在上述浸泡的过程中，大豆籽粒与无菌水的配比为Ig 3_5ml，浸泡的时间为 3-8h0步骤2~)中所述褐藻酸寡糖是由褐藻胶经褐藻胶裂解酶降解或酸降解得到的聚合度为2-10的褐藻酸寡糖。步骤2、中所述褐藻酸寡糖溶液具体为质量浓度为-15%的褐藻酸寡糖溶液；在大豆子叶表面喷洒褐藻酸寡糖溶液时，大豆子叶与褐藻酸寡糖溶液的配比为 Ig 3mL-20mL。为了达到更好的诱导效果，在喷洒褐藻酸寡糖溶液前，需在大豆子叶表面划出若干道伤口，如划出2-3道伤口。对表面喷洒了褐藻酸寡糖溶液的大豆子叶进行培养的条件如下在黑暗中于温度 200C -40°C、相对湿度30% -70%条件下培养1_7天。在培养的过程中，大豆子叶置于装有用无菌水浸湿的灭菌滤纸的培养皿中。为了得到富含大豆抗毒素的大豆粉，所述方法包括将步骤2、得到的含大豆抗毒素的大豆在90°C _120°C的条件下干燥至水分含量低于5%后，并粉碎的步骤。所得到的含大豆抗毒素的大豆粉中的大豆抗毒素含量可达0.2-0. 5mg/g鲜豆重。本发明通过采用褐藻酸寡糖外源诱导，提高大豆中大豆抗毒素的含量，为深入发掘和开发利用大豆种子资源与其高附加值次生代谢产物提供一种新的方法，同时也为提高褐藻酸寡糖的综合利用价值，开辟一条新的途径。采用本发明方法制备的富含大豆抗毒素的大豆粉中的大豆抗毒素含量最高可达到0. 5mg/g鲜豆重。它可作为生产富含大豆抗毒素功能食品的原料，或可作为饲料添加剂用于养殖动物如畜禽、水产类及反刍养殖动物等饲料中，也可用于制备大豆抗毒素单一组分。
图1为未经诱导的普通大豆中大豆抗毒素glyceollins的HPLC测定谱图。图2为经褐藻酸寡糖诱导的大豆中大豆抗毒素glyceollins的HPLC测定谱图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。褐藻酸寡糖购自大连中科格莱克生物科技有限公司，食品级褐藻酸寡糖，含量 90%以上，聚合度2-9。实施例1、制备富含大豆抗毒素的大豆粉精选黄豆籽粒(含水量< 1%，实际为0.77% )10g，用体积含量为75%的乙醇溶液按照Ig :3ml (大豆重量乙醇溶液体积)的剂量灭菌消毒5min，再用Ig 3ml (大豆重量无菌水体积)剂量的无菌水淋洗2遍，然后在Ig 3ml (大豆重量无菌水体积)体积的无菌水中浸泡证。将浸泡膨胀后的大豆脱去种皮，分成两片，并在豆片上划出2-3道伤口，喷洒质量浓度为的褐藻酸寡糖溶液15mL，将喷洒过褐藻酸寡糖溶液的大豆子叶放入装有用无菌水浸湿的灭菌滤纸的培养皿中，在黑暗中于温度20°C、相对湿度50%条件下培养7天。将培养后的大豆在90°C-12(TC干燥至水分低于5%后，粉碎成粉状物。按照 1. Og大豆粉加入3. OmL体积含量80%的乙醇溶液的比例提取大豆抗毒素(glyceollins)， 50°C加热搅拌lh，冷却至室温，12000rpm条件下离心lOmin，吸取上清液，经0. 22 μ m微孔膜过滤，进行HPLC测定。HPLC测定条件为Waterd695色谱系统，配Waters PD紫外检测器，柱子为C18反相色谱柱6 X 250mm，5 μ m)，柱温40°C，采用二元流动相A =质量浓度为0. 的乙酸水溶液(pH = 3. 0) ；B= 100% 乙腈。流速1.0mL/min，梯度洗脱:0_17min，0% 乙腈—45% 乙腈；17min-27min，45% 乙腈—90% 乙腈；27min_33min，90% 乙腈，维持时间 33min ；检测波长285nm，进样量10yL。大豆抗毒素glyceollins的出峰保留时间为23_2%iin，色谱图如图2所示。经HPLC方法测定，本实施例制备的富含大豆抗毒素的大豆粉中的大豆抗毒素含量为0. 25mg/g鲜豆重，即大豆抗毒素含量为0. 27mg/g干豆重。未经处理的普通黄豆籽粒中几乎不会含有大豆抗毒素。(图1所示为未经处理的普通黄豆中大豆抗毒素含量的 HPLC检测结果，从谱图中可以看出，普通黄豆中没有检出大豆抗毒素。)实施例2、制备富含大豆抗毒素的大豆粉精选黄豆籽粒(含水量< 1%，实际为0. 77% )10g，用体积含量为75%的乙醇溶液按照Ig 5ml (大豆重量乙醇溶液体积)的剂量灭菌消毒:3min，再用Ig 5ml (大豆重量无菌水体积)剂量的无菌水淋洗3遍，然后在Ig 5ml (大豆重量无菌水体积)体积的无菌水中浸泡他。将浸泡膨胀后的大豆脱去种皮，分成两片，并在豆片上划出2-3道伤口，喷洒质量浓度为4%的褐藻酸寡糖溶液5mL，将喷洒过褐藻酸寡糖溶液的大豆子叶放入装有用无菌水浸湿的灭菌滤纸的培养皿中，在黑暗中于温度25°C、相对湿度60%条件下培养5天。将培养后的大豆在90°C -120°C干燥至水分低于5%后，粉碎成粉状物。按照实施例 1中的方法提取大豆抗毒素并用HPLC方法测定其含量。结果表明，本实施例制备的富含大豆抗毒素的大豆粉中的大豆抗毒素含量为0. 5mg/g鲜豆重，即大豆抗毒素含量为0. 54mg/g 干豆重。实施例3、制备富含大豆抗毒素的大豆粉精选黄豆籽粒(含水量< 1%，实际为0. 77% )10g，用体积含量为75%的乙醇溶液按照Ig 細1(大豆重量乙醇溶液体积)的剂量灭菌消毒細化，再用Ig 細1 (大豆重量无菌水体积)剂量的无菌水淋洗2遍，然后在Ig 細1(大豆重量无菌水体积)体积的无菌水中浸泡他。将浸泡膨胀后的大豆脱去种皮，分成两片，并在豆片上划出2-3道伤口，喷洒8%浓度的褐藻酸寡糖溶液3mL，将喷洒过褐藻酸寡糖溶液的大豆子叶放入装有用无菌水浸湿的灭菌滤纸的培养皿中，在黑暗中于温度35°C、相对湿度70%条件下培养4天。 将培养后的大豆在90°C _120°C干燥至水分低于5%后，粉碎成粉状物。按照实施例1中的方法提取大豆抗毒素并用HPLC方法测定其含量。结果表明本实施例制备的富含大豆抗毒素的大豆粉中的大豆抗毒素含量为0. 38mg/g鲜豆重，即大豆抗毒素含量为0. 41mg/g干豆重。
权利要求
1.一种诱导大豆产生大豆抗毒素的方法，包括下述步骤1)对大豆籽粒进行预处理，使其膨胀并去除种皮，得到大豆子叶；2)在所述大豆子叶表面喷洒褐藻酸寡糖溶液并进行培养，得到含大豆抗毒素的大豆。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤幻中所述褐藻酸寡糖是由褐藻胶经褐藻胶裂解酶降解或酸降解，得到的聚合度为2-10的褐藻酸寡糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤幻中所述褐藻酸寡糖溶液中褐藻酸寡糖的质量浓度为-15% ；所述大豆子叶与褐藻酸寡糖溶液的配比为 Ig 3mL_20mL ；所述大豆子叶表面划有若干道伤口，具体为2-3道伤口。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述培养的条件如下在黑暗中于温度20°C -40°C、相对湿度30% -70%条件下培养1_7天。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于在所述培养的过程中，表面喷洒过褐藻酸寡糖溶液的大豆子叶置于装有用无菌水浸湿的灭菌滤纸的培养皿中。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述大豆籽粒选自下述籽粒中的任意一种黄豆籽粒、青豆籽粒和黑豆籽粒。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于步骤1)中对大豆籽粒进行预处理的方法如下首先用体积含量为75%的乙醇溶液对于大豆籽粒进行灭菌消毒，然后对消毒后的大豆籽粒用无菌水淋洗，接着将大豆籽粒在无菌水中浸泡，最后将浸泡膨胀后的大豆籽粒脱去种皮。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述灭菌消毒的过程中，大豆籽粒与体积含量为75%的乙醇溶液的配比为Ig 3-5ml，灭菌消毒的时间为3-5min ；所述淋洗的过程中，大豆籽粒与无菌水的配比为Ig 3-5ml，淋洗的次数为2-3遍；所述浸泡的过程中，大豆籽粒与无菌水的配比为Ig 3-5ml，浸泡的时间为3-他。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括将步骤2) 得到的含大豆抗毒素的大豆在90°C-12(TC的条件下干燥至水分含量低于5%后，粉碎，得到含大豆抗毒素的大豆粉。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述含大豆抗毒素的大豆粉中的大豆抗毒素含量为0. 2-0. 5mg/g鲜豆重。
全文摘要
本发明公开了一种诱导大豆产生大豆抗毒素的方法。该方法包括下述步骤1)对大豆籽粒进行预处理，使其膨胀并去除种皮，得到大豆子叶；2)在所述大豆子叶表面喷洒褐藻酸寡糖溶液并进行培养，得到含大豆抗毒素的大豆。本发明通过采用褐藻酸寡糖外源诱导，提高大豆中大豆抗毒素的含量，为深入发掘和开发利用大豆种子资源与其高附加值次生代谢产物提供一种新的方法，同时也为提高褐藻酸寡糖的综合利用价值，开辟一条新的途径。采用本发明方法制备的富含大豆抗毒素的大豆粉中的大豆抗毒素含量最高可达到0.5mg/g鲜豆重，即大豆抗毒素含量为0.54mg/g干豆重。
文档编号A01P21/00GK102511367SQ20111045006
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者崔刚, 梁平, 石波, 胡佳 申请人:中国农业科学院饲料研究所, 大连中科格莱克生物科技有限公司