专利名称：一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11b及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杨树不定根发育关键基因 PeffOXllb及其应用。
背景技术：
杨树是世界中纬度平原地区栽培最为广泛的树种之一，也是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种之一，对我国无性系林业可持续发展发挥了重要作用。随着速生高产杨树新品种的不断推广，各地杨树种植产业迅猛发展，目前我国杨树人工林面积已超过700万公顷，居世界首位。一般而言，杨树是适宜无性繁殖的树种，在各种无性繁殖方法中，硬枝扦插最为普遍。插穗生根难易程度直接影响造林成活率，且事关无性系的适应性和抗逆性。尽管大多数杨树都比较容易扦插生根，然而仍有许多优良无性系扦插生根困难。随着林木遗传改良工作和无性繁殖技术的发展，人们对于杨树扦插繁殖的重要性有了新的认识，意识到从理论和实践上加强对扦插生根的机理研究有其必要性和迫切性。“根深叶茂”，两者是相辅相成的。在拟南芥、水稻、玉米等草本植物中，根系分子生物学研究引起广泛关注，并取得显著进展(Casson and Lindsey 2003 ；Hochholdinger and Zimmermann 2008 ；Peret et al. 2009)。然而,长期以来,杨树遗传改良研究更多的是集中在地上部分的表型性状，而对根系发育性状的缺乏研究，迄今鲜有杨树扦插生根及其根系发育相关基因克隆及其功能研究的报道。杨树扦插生根性状属于多基因控制的数量性状， 受较强的遗传控制(Zalesn y et al. 2005 ；Zhang et al. 2009)。克隆控制这些重要性状的主效基因是林木后基因组时代的主要研究内容，不仅在探索林木根系发育生物学发面有重要的理论意义，而且在无性系林业生产上有潜在应用价值。WUSCHEL-related homeobox(WOX)蛋白是同源异型盒蛋白家族中为植物所特有的一类转录因子，在植物胚胎发育、干细胞维持、器官发生及形态建成等过程中起着非常重要的作用(Deveauxet al. 2008 ；van der Graaffet al. 2009 ；Zhang et al. 2010)。拟南芥有 15个WOX转录因子成员，分属3个进化分枝WUS分枝(WUS clade)包括AtWUS,AtWOXI-7 ； 中间分枝(intermediate cl ade)包括 AtW0X8,9,11,12 ;古老分枝(ancient clade)包括 AtffOXlO,13，14。AtWUS基因是植物WOX家族的创始成员，它的克隆代表着同源异型盒超基因家族一个新亚类的发现(Lauxet al. 1996 ；Mayer et al. 1998 ；Haeckeret al. 2004)。AtWUS 基因的编码产物是维持干细胞数量的内源性信号分子，促进花药和胚珠发育(Ikeda et al. 2009)。AtffOXl和PRESSED FLOffERl (PRSl/Atff0X3)基因作用在于从各分生组织细胞层招募创始细胞以形成营养器官和花器官(Shimizu et al. 2009 ；Vandenbussche et al. 2009)。AtW0X2、Atff0X8和AtW0X9基因在拟南芥胚胎发育过程中决定器官的特异性 (Breuningeret al. 2008 ；Palovaaraet al. 2010)。AtW0X2 和 AtW0X8 最初在卵细胞和合子中特异表达，随后分别在合子第一次分裂产生的基细胞和顶细胞的子细胞中表达;AtW0X9 最初在合子第一次分裂产生的基细胞的子细胞中表达。AtW0X4基因在原形成层和维管形成层中特异表达，在次生生长过程中维持维管分生组织结构(Jiet al. 2010 ；Hirakawaet al. 2010) ο AtW0X5在根尖不活动中心特异表达(Haecke r et al. 2004)，然而AtW0X5和 AtWUS在维持根尖和茎尖干细胞中的作用是可以互相替代的(Sarkaret al. 2007) oAtff0X6/ PRETTY FEWSEEDS2 (PFS2)基因表达是胚珠正常发育所必需的，主要作用是在胚珠的形成中阻止细胞过早的分化(Park et al. 2005)。OsWOXlI是AtWOXll的同源基因，受控于生长素和细胞分裂素共同作用，主要在水稻不定根根原基及成熟初生根的分生组织中表达(Zhao et al. 2009)。AtW0X13在雄蕊、初生根、侧根及胚胎发育过程中大量表达，而AtWOXH基因局限于侧根形成早期和花药中表达(Deveauxet al. 2008)。上述结果表明高等植物WOX基因家族的表达都具有时空特异性，可能都以不同的作用机制参与植物顶端发育调控。它们与相关基因及植物激素之间的调控网络尚不十分清楚，在杨树中尚未有WOX基因家族功能研究的相关报道。不定根发生既是植物器官发生和形态建成中最为基本的理论问题，又是植物无性繁殖和离体器官再生方面重要的实践问题，因此成为近年来植物功能基因组研究的一个热点。WOX基因家族在根尖干细胞维持、不定根根原基启动等过程中起着非常重要的作用，在杨树中克隆和开发利用这些基因资源，不仅有助于阐明植物生长发育的分子调节机制，而且还能促进林业优良品系的快速繁殖，对农、林与园艺业的发展具有不可估量的价值。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杨树不定根发育关键基因PeWOXllb。本发明的另一目的是提供一种杨树不定根发育关键基因PeWOXllb 的应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种杨树不定根发育关键基因PeWOXllb，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。含有权利要求I所述的杨树不定根发育关键基因PeWOXllb的载体。含有权利要求I所述的杨树不定根发育关键基因PeWOXllb的宿主细胞。杨树不定根发育关键基因PeWOXllb在调控杨树不定根的发生和发育中的应用。杨树不定根发育关键基因PeWOXllb的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ N02所示。本发明以南林895杨初生不定根为材料，通过RACE技术克隆了 PeWOXllb基因。 同时，采用通路克隆技术构建其杨树过量表达载体pH35GS-PeW0Xllb，该基因位于启动子 P35S之后，在启动子P35S的驱动下，PeffOXllb可在杨树体内高效表达，从而调控不定根的发生和发育。其中，所PeWOXllb基因是杨树不定根发生发育关键基因。所述载体质粒，在PeWOXllb基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，它能使 PeffOXlIb基因在杨树体内闻效表达。所述载体质粒，在PeWOXllb基因的3’端组装了强终止子N0S，可有效终止 PeTOXllb基因的转录。所述载体质粒组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。所述载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeWOXllb基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。
有益效果本发明通过将PeWOXl Ib基因转入杨树，过量表达PeWOXl Ib基因的转基因杨不定根数目增多，茎上有不定根产生，而且在异位根上还能再生出新植株，说明 PeWOXllb基因是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。
图I是植物表达载体pH5GS的结构示意图；图2是过量表达PeWOXllb基因的转基因杨半定量检测I %琼脂糖凝胶电泳图；图3是过量表达PeWOXllb基因的转基因杨与未转基因杨的整体形态比较图；图中，左边为未转基因杨，右边为转基因杨；图4是过量表达PeWOXllb基因的转基因杨与未转基因杨的根形态比较图；图中， 左边未转基因杨，右边为转基因杨；图5是过量表达PeWOXllb基因的转基因杨继代培养苗10周后茎上产生异位根图；图6是过量表达PeWOXllb基因的转基因杨继代培养苗10周后叶尖产生异位根图；图7是过量表达PeWOXllb基因的转基因杨继代培养苗茎上异位根再生出新植株图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所使用的主要试剂盒和药品为RNAplant Reagent (TIANGEN)， RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN), SuperScript First-Strand Synthesis Syste m (Invitrogen), LR Clonase 11 enzyme Mix (Invitrogen), pCR 8/Gff/TOPO vector (Invitrogen), TaKaRa LA Taq(TaKaRa), TaKaRa Taq(TaKaRa),p MD-19T(TaKaRa), 5，-Full RACE Kit (TaKaRa)，3’-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa)，所有引物合成及测序工作均由Irwitrogen(上海)完成。其他未作出说明的均为常规要求。实施例1895杨cDNA模板的准备可按常规方法准备895杨cDNA，也可以采用如下方法准备总RNA的粗提吸取ImL RNAplant Reagent裂解液于2mL离心管中，将适量经液氮研磨精细的南林895杨根材料加入其中，涡旋并充分混匀；室温水平放置离心管5-10min， 彻底裂解核蛋白；4°C 12000rmp离心2_5min，转移上清液至新的离心管；加入O. 2mL 5M NaCl,轻轻混勻；再加入O. 3mL氯仿,上下颠倒混勻；4°C 12000rmp离心IOmin,转移上清液至新的离心管；重复氯仿抽提；加与所得上清液等体积的异丙醇，混匀，室温静置IOmin ； 4 °C 12000rmp离心IOmin,弃上清液；加入O. 5mL新鲜配置的RLT buffer (ImL RLT加 10 μ L β -巯基乙醇)，彻底涡旋；加入250 μ L无水乙醇，吹打混匀；将混合液转移至收集柱RNeasy mini column (Pink)中，12000rmp离心15s,弃滤液,离心管可重复使用；在收集柱 RNeasy mini column 中加入 350 μ L RffI buffer, 12000rmp 离心 15s,弃滤液和离心管； 将新鲜配置的80 μ L DNase I incubation mix加入收集柱RNeasy mini colum膜中央，室温静置 15min ;在收集柱 RNeasy mini column 中加入 350 μ L RffI buffer, 12000rmp 离心 15s,弃滤液和离心管；将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管,加500 μ L buffer RPE, 12000rmp 离心 15s,弃滤液；重新加入 500 μ L buffer RPE, 12000rmp 离心 2min,弃滤液和离心管；将收集柱RNeasy mini column放入新的离心管，13000rmp离心Imi η ;将收集柱RNeasy mini column放入新的RNA收集离心管,加入适量RNase-free water到膜中央， 静置lmin, 12000rmp离心Imin ;将滤液重新加入收集柱RNeasy mini column, 12000rmp离心lmin，回收滤液，即得总RNA ;用紫外分光光度计检测确定RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性，确认质量完好。总RNA的纯化将总RNA的体积用RNase-free水调整到100 μ L(确保RNA总量不超过100 μ g);加入350 μ L RLT工作液(ImL RLT力卩10 μ Li3 -巯基乙醇)，充分混匀； 加入250 μ L无水乙醇，充分混匀(不要离心)；将700 μ L混合液将到QIAGEN纯化柱中， 12000rmp,离心15s ;弃滤液,加入500 μ L工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混勻而成), 12000rmp,离心15s ;弃滤液,重新加入500 μ L工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混勻而成),12000rmp,离心2min ;将纯化柱放入新的离心管,最大转速离心Imin ;将纯化柱重新放入新的RNA收集离心管，在纯化柱膜中央加适量RNase-free水，室温静置Imin，最大转速离心Imin ;回收滤液即得纯化RNA样品；第一链cDNA 合成米用 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (I nvitrogen),以Oligo DT-Adaptor Primer引物引发进行第一链cDNA的合成。具体操作如下准备RNA/Primer 混合液1 μ g 南林 895 杨 Total RNA, IyL Oligo DT-Ada ptor Primer (50ng/ μ L) , I μ L IOmM dNTP mix,加 DEPC-treated water 到 10 μ L ; 65°C温浴5min,而后迅速放置冰上至少Imin ;配制反转录混合液，依次加入试剂2 μ L 10XRT buffer,4y L 250nnM MgCl2、2yL 0. IM DTTU μ L RNase OUT (40U/μ L)、I μ L superscript RT (200U/ μ L);将 IOyL 反转录混合液加入 IOyL RNA/Primer 混合液中， 轻轻混勻，短暂离心；进行反转录程序25V, IOmin, 50°C, 50min, 85°C, 5min (终止反应)， 然后置于冰上；加IuL RNase H，混匀，短暂离心，37°C温浴20min ;冰上冷却后使用灭菌 Milli-Q水I : 50稀释后( 10ng/yL)-20°C保存备用。实施例2通过RACE技术克隆PeWOXl Ia基因以实施例I制备的895杨cDNA为模板，使用特异性引物来扩增PeWOXllb基因短片段，其中，扩增PeWOXllb短片段正向引物为5’AACGCCAGATGCAAGCTAGT 3 ;扩增PeWOXllb 短片段反向引物为5’TCTGTTGGAACCCCATTGAT 3，。高保真PCR反应体系如下10 X LA PCR Buffer (Mg2+ free) 5. O μ L ；2. 5mM dNTP Mixture 8. 0 μ L ；25mM Mg2+ 5. 0 μ L ；LA Taq DNA Poly merase (5U/μ L) 0. 5 μ L ;正向引物(10μΜ)2μ L ;反向引物(10μΜ)2μ L ;模板(895 杨 cDNA) I μ L ;加无菌 ddH20 补足 50 μ L0 反应程序预变性 94°C，3min ;94°C，40s，55°C， 30s，72°C，30s，35个循环；72°C，10min。对产物测序，获得的PeWOXlla基因短片段序列如 SEQ N03 所示。依据上述PeWOXlla基因短片段序列设计3’末端的RACE引物，进行3’ RACE，获得3’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序，在NCBI数据库(http://blast, ncbi. nlm. nih. rov/)中Blast确认上述片段与其它植物相关的基因同源。以相同的方法，根据获得的正确的3’ cDNA末端片段序列设计5’末端的RACE引物，进行5’ RACE，获得5’ cDNA末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行PCR筛选后进行测序。 主要引物和过程如下3’ RACE 弓 I 物3 1 RACE gene-specific outer primer 5 ' ATAATCAACGGGCATACGATAGC 3 ； 3 ' RACE gene specific inner primer 5 ' CTTGTTTTCTTTCTCTAACCAGArGGGT 3，； 3 ' RACE Outer Primer 5' GCGAGCACAGAATTAATACGACT 33' RACE Inner Primer 5/ CGCGGATCCGAATTAATACGACT CACTATAGG 3，。3' RACE 反应程序根据3，-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa) Protocol 进行。反转录(Reverse Transcription):将表I成分加入到一个置于冰上的 RNase-free的小离心管中，轻轻混匀，短暂离心，42°C温育lh，72°C温育15min ;进入PCR步骤，或-20°C保存反应物。表I反转录反应体系
权利要求
1.一种杨树不定根发育关键基因PeWOXlIb，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。
2.含有权利要求I所述的杨树不定根发育关键基因PeWOXllb的载体。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体在PeWOXllb基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S。
4.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体在PeWOXllb基因的3’端组装了强终止子NOS。
5.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体组装HPT基因表达盒，作为转基因杨树的筛选标记，可以用潮霉素进行转基因杨树的筛选。
6.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述载体组装LB和RB序列，促使组装于其间的PeWOXllb基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体细胞染色体中。
7.含有权利要求I所述的杨树不定根发育关键基因PeWOXllb的宿主细胞。
8.权利要求I所述的杨树不定根发育关键基因PeWOXllb在调控杨树不定根的发生和发育中的应用。
9.权利要求I所述的杨树不定根发育关键基因PeWOXllb的表达蛋白，其氨基酸序列如 SEQ N02 所示。
全文摘要
本发明公开了一种杨树不定根发育关键基因PeWOX11b，其核苷酸序列如SEQNO1所示。本发明通过将PeWOX11b基因转入杨树，过量表达PeWOX11b基因的转基因杨不定根数目增多，茎上有不定根产生，而且在异位不定根上还能再生出新植株，说明PeWOX11b基因是控制杨树不定根发生发育的关键调节因子，在林木基因工程和无性系林业领域有重要应用价值。
文档编号A01H5/06GK102586272SQ20121001773
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者徐立安, 潘惠新, 王光萍, 王明庥, 胥猛, 谢雯凡, 陈英, 黄敏仁 申请人:南京林业大学