专利名称：一种多孢灵芝的选育方法
技术领域：
本发明涉及一种多孢灵芝的选育方法，属于食用菌遗传选育技术领域。
背景技术：
灵芝(Ganoderma Iucidum)是祖国中医药宝库中的珍品,素有“仙草”之誉。古今药理与临床研究均证明，灵芝确有防病治病、延年益寿之功效。东汉时期的《神农本草经》、明代著名医学家李时珍的《本草纲目》，对灵芝的功效都有详细和肯定的记载。现代药理学与临床实践进一步证实了灵芝的药理作用，并证实灵芝多糖是灵芝扶正固本、滋补强壮、延年益寿的主要成分。现在灵芝作为药物已正式被国家药典收载，2005年美国药典正式收录了灵芝，同时它又是国家批准的新资源食品，无毒副作用，可以药食两用。科学研究表明，灵芝的药理成分非常丰富，其中有效成份可分为十大类，包括灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必须氨基酸)、蛋白质、留类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主要含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝病变、失眠以及衰老的防治作用十分显著。灵芝的应用范围非常广泛。就中医角度辩证看，出于灵芝入五脏补益全身五脏之气，所以无论心、肺、肝、脾、肾脏虚弱，均可服之。灵芝所治病种涉及呼吸、循环、消化、神经、内分泌及运动等各个系统；涵盖内、外、妇、儿、五官各科疾病。就其根本原因在灵芝扶正固本，增强免疫功能，提高机体抵抗力的巨大作用。它不同于一般药物仅针对某种疾病起治疗作用，亦不同于一般营养保健食品只对某一方面营养的不足进行补充和强化，而是在整体上双向调节人体机能平衡，调动机体内部活动，调节人体新陈代谢机能，提高自身免疫能力，促使全部的内脏或器官机能正常化。
灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌孔中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞，孢子淡褐色至黄褐色，大小只有5.2 6.9 μ mX 8.5 11.2 μ m，是活体生物，更适合人体肠胃直接吸收。它凝聚了灵芝的精华，具有灵芝的全部遗传物质和作用。据测定它所含的灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、氨基酸、蛋白质等活性物质的量，是灵芝子实体的70倍。然而，传统的灵芝品种产孢量较低(产孢量一般仅为4% )，难以满足人们对灵芝孢子日益增长的需求；且灵芝出芝试验的时间较长(需耗时几个月)，使得多孢灵芝育种工作进展缓慢。
发明内容
目前用于生产的灵芝菌种分两类:一类主要是采收灵芝子实体的菌种，另一类主要是用来采集灵芝孢子粉的菌种。本发明的目的在于针对主要用来采集灵芝孢子粉的菌种提供一种新的灵芝品种遗传选育方法，选育出的灵芝品种可使其产孢量达8 16%，为一般灵芝品种(产孢量4%)的I倍以上，且选育出的多孢灵芝品种遗传及主要生产性状(产孢量)稳定，从而实现灵芝人丁种植由数量型向质量型的转变，提高灵芝的商品性状，同时缩短了多孢灵芝育种时间。实现上述目的本发明采用的技术方案本发明采用食用菌遗传选育技术，具体主要涉及常规选育(灵芝组织分离法)，辅以现代生物技术中的孢子诱变育种，进行多孢灵芝遗传选育技术研究，主要包括如下5个步骤:I)亲本选择从全国各地采集品质优良、产孢量较高的灵芝品种作为多孢灵芝的培育亲本；2)常规选育将步骤I)培育亲本通过灵芝组织分离法分离培养获得菌丝体，经过栽培试验，筛选获得产孢量较高的灵芝品种(灵芝组织分离法即采用灵芝的幼蕾或菌盖幼组织进行分离，获得纯菌丝的方法。它们具有较强的再生能力和保持亲本种性的能力，属于无性繁殖范畴。组织分离取材广泛、操作简便、易于成功，是灵芝纯菌种的简便分离方法)；3)诱变处理将步骤2)得到的灵芝品种孢子制成孢子悬浮液，通过紫外线诱变处理:诱变处理应在暗箱内进行，箱内装15w紫外灯I支，悬挂于30cm高处，诱变处理时应先开灯20min，使波长稳定，然后将孢子悬 浮液倒入直径为6cm的无菌培养皿中，打开皿盖，照射时间I 3min ;用无菌水将照射后的孢子悬浮液稀释1000倍以上，再取稀释液0.2ml涂布于马铃薯琼脂培养基的培养皿上，在25°C下培养5 10d，就能在每个平板上得到数十个单菌落，选纯正、健壮的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待斜面菌丝长好后，再分别接入2 4瓶原种中，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生物学特性，择优留取；4)品种筛选通过步骤2)和3)，选育-诱变-再选育-再诱变，筛选出符合主要生产性状要求的菌株(产孢量高)，从而减少常规育种时间，实现多孢灵芝品种遗传选育工作的快速高效；5)人工栽培将通过步骤4)得到的优良品种，进行人工栽培，实现多孢灵芝的速生丰产(产孢量达8 16%);品种遗传及主要生产性状(产孢量)稳定，同时缩短了多孢灵芝育种时间。本发明的有益效果本发明采用食用菌遗传选育技术，具体主要涉及常规选育(灵芝组织分离法)，辅以现代生物技术中的孢子诱变育种，进行多孢灵芝遗传选育技术研究。筛选出优良品种，实现多孢灵芝的速生丰产(产孢量达8 16% );品种遗传及主要生产性状(产孢量)稳定。本发明提供的多孢灵芝选育方法可以规模化、产业化，为灵芝的遗传育种开辟了一条新路，从而实现灵芝种植数量型向质量型的转变，提高品种的商品性状，同时缩短了多孢灵芝育种时间。
具体实施例方式实施例1灵芝采收标准:当子实体菌盖边缘黄色消失，进入成熟期，此期菌盖不再扩展，但可继续增重、增厚，适当控制通风，有促进子实体生长作用。当子实体菌盖边缘黄色消失、逐渐变成褐色时，即可采收。灵芝采收方法如下:I)采收时间:8月 9月份/每年；2)采收方法:灵芝采收时，用果树剪从芝盖以下3cm部位剪去，留下菌柄以便再生
第二潮灵芝；3)注意事项:灵芝采收时，不可手握菌盖，以免菌盖创伤，造成感染:雨天不得采收，下大雨后至少隔2天采收。灵芝采收过程中要轻采轻放，防止碰伤、压伤和黏上沙土和杂质。实施例2灵芝组织分离培养:选择贵州梵净山产孢量较高的灵芝品种，采用灵芝的幼蕾或菌盖幼组织进行分离培养，获得纯菌丝；它们具有较强的再生能力和保持亲本种性的能力，具体操作如下:I)幼蕾分离:切取灵芝菌柄先端膨大的幼蕾，在无菌条件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼烧后的刀片从柄部浅切I刀，掰开两半后用锋利的接种刀挑切取幼蕾内菌肉I小块，移接至斜面中央，28 °C下遮光培养，菌丝长满斜面即为母种；2)菌盖分离:选取生长正常、健壮和未成熟的子实体，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌盖正反面，然后在菌盖边缘黄色生长圈处，切破皮壳，掰下幼嫩菌盖I块，用灼烧后的解剖刀将断面菌肉纵横切割成米粒大小的组织粒，置无菌培养皿内，最后用接种针将组织粒移接至斜面上，28°C下遮光培养，整个操作需在严格无菌条件下进行。实施例3`诱变育种:选择贵州梵净山产孢量较高的灵芝品种进行诱变育种，诱变剂为紫外线，诱变育种包括以下四个步骤:I)新鲜灵芝无菌孢子的收集:将灭菌处理过的多套培养皿、玻璃漏斗及不锈钢挂钩，置于超净工作台上；选择正在弹射孢子的灵芝子实体菌盖用75%酒精棉球擦拭，在无菌操作状态下将其挂于玻璃漏斗内，灵芝子实体经过12 20h自然弹射后，培养皿中可收集得到一定数量的新鲜灵芝无菌孢子；2)孢子悬浮液的制备:将收集得到的灵芝无菌孢子移入无菌生理盐水或磷酸缓冲液中，摇匀后即成孢子悬浮液；3)诱变处理:用紫外线处理，诱变处理应在暗箱内进行，箱内装15w紫外灯I支，悬挂于30cm高处，诱变处理时应先开灯20min，使波长稳定，然后将孢子悬浮液倒入直径为6cm的无菌培养皿中，打开皿盖,照射时间I 3min,用无菌水将照射后的孢子悬浮液稀释1000倍以上，然后取稀释液0.2ml涂布于马铃薯琼脂培养基的培养皿上，在25°C下培养5 10d，这时就能在每个平板上得到数十个单菌落，选纯正、健壮的单个菌落移入斜面试管内，供进一步筛选；4)挑菌筛选:将诱变后的孢子经培养长出菌落后及时挑菌，选发育健全的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待斜面菌丝长好后，再分别接入2 4瓶原种中，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生物学特性，择优留取。实施例4人工栽培:将上述通过“选育-诱变-再选育-再诱变”得到的优良品种，进行人工栽培，实现多孢灵芝的速生丰产。人工栽培过程中应注意以下事项:I)搞好栽培环境的清洁卫生:芝房内要清除菌渣、垃圾，彻底清洗栽培用架，并进行空间消毒，消灭杂菌隐匿场所，减少传播媒介，搞好环境卫生对防止污染能起到事半功倍的效果；2)严格选料:培养料要求新鲜、无霉变，用前要曝晒数天，培养料配方要求合理，主料和辅料要充分拌匀，含水量控制在60% 70%左右，装量合适、松紧适度，装好后立即进行高压或常压灭菌，以防培养基的酸化，灭菌要求彻底；3)接种中树立严格的无菌观念:由于空气中到处漂浮有杂菌孢子，操作时不能因为肉眼看不见而麻痹大意，操作人员的双手、衣物和所用接种工具、材料须严格消毒，如选用接种室接种的操作人员应戴上帽子，以防头发上落有杂菌孢子。接种动作要尽量快捷、熟练，防止接种过程中带入杂菌、杂菌孢子，对灭菌过程中破损的袋子用胶布封好，并在封口处用75%酒精消毒；4)适当加大接种量:可使灵芝菌丝以绝对优势迅速占领地盘，减少杂菌的污染，起到以芝抑菌的作用；5)保证培养室内具有适宜的小气候,把好菌丝培养关:控制25°C左右的温度、60 % 70 %的湿度，注意通风换气，严防高温高湿，创造灵芝菌丝生长的最适宜环境条件，促进灵芝菌丝快速生长，迅速占领整个料面；6)认真抓好出芝阶段的培养管理工作:灵芝栽培一般选在春季进行，出芝时正好是6、7月份的高温季节，子实体生长阶段由于需要较高的湿度，因此是防治杂菌污染的重要时期。灵芝原基长出后，要及时拔去棉塞或开袋，以免原基损坏而感染杂菌。做好保温保湿工作，同时加强通风和给予一定的光照，促使原基健康地长成子实体，子实体成熟后及时米摘； 7)加强早期防治:定期检查生长情况，一旦发现污染，应采取有效措施，控制杂菌的生长、蔓延。一般可采用石灰水擦洗患处，或用石灰浆封杀；如子实体感染杂菌，应及时摘除，以防蔓延。在栽培中也可选用一些高效、低毒、低残留的杀菌剂进行拌料或治疗，但在选用杀菌剂时一定要慎重，以免杀死菌丝，或引起农药残留。本方法选育出的多孢灵芝品种可使其芝产孢量达8 16%,为一般灵芝品种(产孢量4% )的I倍以上，且选育出的多孢灵芝在遗传及主要生产性状(产孢量)上稳定，从而实现灵芝人工种植由数量型向质量型转变，提高品种的商品性状，同时缩短了多孢灵芝育种时间。
权利要求
1.一种多孢灵芝的选育方法，其特征在于:该方法采用常规选育即灵芝组织分离法，辅以现代生物技术中的孢子诱变育种，进行多孢灵芝遗传选育技术研究，主要包括如下5个步骤: 1)亲本选择 从全国各地采集品质优良、产孢量较高的灵芝品种作为多孢灵芝的培育亲本； 2)常规选育 将步骤I)培育亲本通过灵芝组织分离法分离培养获得纯菌丝体，经过栽培试验，筛选获得产孢量较高的灵芝品种——灵芝组织分的法V.采用灵芝的幼2或菌‘幼组织只I i分离培养，获得纯菌丝的方法: 3)诱变处理 将步骤2)得到的灵芝品种孢子制成孢子悬浮液，通过紫外线诱变处理，用无菌水将紫外线照射后的孢子悬浮液稀释，再取稀释液涂布于马铃薯琼脂培养基的培养皿上，在25°C下培养5 10d，在平板上得到单菌落，选纯正、健壮的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待斜面菌丝长好后，再分别接入2 4瓶原种中，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生物学特性，择优留取； 4)品种筛选 通过步骤2)和3)，选育-诱变-再选育-再诱变，筛选出符合主要生产性状要求的产孢量高的菌株，从而减少常规育种时间，实现多孢灵芝品种遗传选育工作的快速高效； 5)人工栽培 将通过步骤4)得到的优良品种，进行人工栽培，实现多孢灵芝的速生丰产，其产孢量达8 16% ;品种遗传及主要产孢量性状稳定，同时缩短了多孢灵芝育种时间。
2.根据权利要求1所述一种多孢灵芝的选育方法，其特征在于: 步骤2)灵芝组织分离法具体操作包括:A.幼蕾分离:切取灵芝菌柄先端膨大的幼蕾，在无菌条件下，用75%酒精棉球擦拭，再用灼烧后的刀片从柄部浅切I刀，掰开两半后用锋利的接种刀挑切取幼蕾内菌肉I小块，移接至斜面中央，28°C下遮光培养，菌丝长满斜面即为母种菌盖分离:选取生长正常、健壮和未成熟的子实体，切去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌盖正反面，然后在菌盖边缘黄色生长圈处，切破皮壳，掰下幼嫩菌盖I块，用灼烧后的解剖刀将断面菌肉纵横切割成米粒大小的组织粒，再用接种针将组织粒移接至斜面上，28 °C下遮光培养，整个操作需在严格无菌条件下进行。
步骤3)诱变处理具体操作包括:A.新鲜灵芝无菌孢子的收集:将灭菌处理过的多套培养皿、玻璃漏斗及不锈钢挂钩，置于超净工作台上；选择正在弹射孢子的灵芝子实体菌盖用75%酒精棉球擦拭，在无菌操作状态下将其挂于玻璃漏斗内，灵芝子实体经过12 20h自然弹射后，培养皿中可收集得到一定数量的新鲜灵芝无菌孢子孢子悬浮液的制备:将新鲜的灵芝无菌孢子移入无菌生理盐水或磷酸缓冲液中，摇匀后即成孢子悬浮液；C.诱变处理:用紫外线处理，诱变处理应在暗箱内进行，箱内装15w紫外灯I支，悬挂于30cm高处，诱变处理时应先开灯20min，使波长稳定，然后将孢子悬浮液倒入直径为6cm的无菌培养皿中，打开皿盖，照射时间I 3min，用无菌水将照射后的孢子悬浮液稀释1000倍以上，然后取稀释液0.2ml 涂布于马铃薯琼脂培养基的培养皿上，在25°C下培养5 10d，选纯正、健壮的单个菌落移入斜面试管内，供进一步筛选；D.挑菌筛选:将诱变后的孢子经培养长出菌落后及时挑菌，选发育健全的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待斜面菌丝长好后，再分别接入2 4瓶原种中，然后进行栽培试验，反复比较各菌落的生物学特性，择优留 取。
全文摘要
本发明涉及一种多孢灵芝的选育方法，属于食用菌遗传选育技术领域；具体方法主要涉及常规选育(灵芝组织分离法)，辅以现代生物技术中的孢子诱变育种，其步骤包括亲本选择、常规选育、诱变处理、品种筛选、人工栽培。与现有技术相比，本发明在于选育出的多孢灵芝品种可使其芝产孢量达8～16％，为一般灵芝品种(产孢量4％)的1倍以上，且选育出的多孢灵芝在遗传及主要生产性状(产孢量)上稳定，从而实现灵芝种植由数量型向质量型转变，提高品种的商品性状，同时缩短了多孢灵芝育种时间。
文档编号A01G1/04GK103238459SQ201210038310
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者张伦, 张 林, 贺红早, 张超然, 袁铖巍 申请人:贵州省生物研究所