专利名称：一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物抗菌有机肥料的制备方法，特别涉及一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法。
背景技术：
一些瓜果、蔬菜等农作物的连作障碍目前已成为制约农业生产的瓶颈，导致土地资源以及人力、物力、财力等各项农业投入浪费，影响了农业经济效益，同时也极大地打击了农民的生产积极性。连作作物的连作土壤障碍中主要由真菌性病原菌(尖孢镰刀菌)引起的连作枯篓病是最严重的障碍因子，如连作香蕉巴拿马枯篓病在连作4茬就开始出现，连作6茬后越发严重；由青枯劳尔氏菌引起的辣椒青枯病一旦发生通常会造成20-30%的辣椒死亡，严重时高达50%以上，甚至绝收。目前，对这一连作障碍的防治主要有化学防治、选育抗病品种等不同方法，但效果较差。相关研究结果表明，连作作物枯篓病的关键问题在于土壤中的微生物区系及其次生物质致毒问题，因此，对这类连作作物的障碍的防治也逐渐转移到通过筛选高效拮抗菌株，同时将拮抗菌株和有机肥复配开发既能够抗病又可改善土壤结构的微生物有机肥料的以生物防治为主的综合防治措施上来。例如，中国专利ZL 200510122898. O公开了一种能克服或消除连作作物枯篓病的拮抗菌及其生产的微生物有机肥料，其试验表明该微生物有机肥料施入土壤后能使拮抗菌迅速繁殖，在土壤中形成优势群；中国专利ZL 200910183358. I、ZL 200910183361. 3、ZL 200910035425. 5、ZL 201010138221. 7 则分别公开了防除连作黄瓜立枯病、防除连作香蕉巴拿马枯萎病、防除连作棉花黄萎病、防治辣椒青枯病的拮抗菌及其微生物有机肥料。在抗菌类生物药物研发方面，抗菌肽是当今的研究重点和热点。抗菌肽(antibacterial peptides)又称肽抗生素(peptide antibiotics)或抗微生物 (antimicrobialpeptide),是生物免疫系统产生的一类抵抗外界生物感染源的活性多肽, 在昆虫、植物、动物及人体内广泛存在。它除有非特异性的抗细菌、真菌、病毒、抗感染、抗疾病的作用外，还有抗细胞变异、抗肿瘤细胞的作用，且不损害人体正常细胞，尤其对多重耐药菌株仍有效。抗菌肽对革兰氏阳性和阴性细菌约40余种、绿脓杆菌和副伤寒菌等耐药性菌株均有较强的杀灭作用。已有学者对由青枯病病原菌引起的番茄和辣椒青枯病(Bacterial Wilt)、由枯萎镰刀菌引起的香蕉枯萎病(Fusarium wilt)等世界性细菌毁灭性土传病害进行了研究、 试验，证明利用抗菌肽，通过拌土、施灌、植株浸根、拌种等方法可对以上病害进行有效地防治，尤其在我国两广和福建等温暖潮湿的环境中，发病率可减少80%以上。通过生物抗菌肽的广泛应用，可有效地防止、减轻农业病虫害，减少农药的施用量，降低农业生产投入，确保农产品食用安全，实现农业增产增收，从而起到事半功倍、绿色环保的作用。另一方面，相关研究证明家香具有超强的免疫蛋白合成能力，一条香，在不到一个月的生长期中，利用22 25g的桑叶可合成并分泌O. 5^1. 5g的丝蛋白。现已有家蚕抗菌肽的相关研究，如中国专利ZL200910116463. 3公开了一种诱导家蚕产生抗菌肽的方法，所述该方法是采用病毒或细菌注射，或者可以采用使家蚕饥饿的方法；采用病毒或细菌注射时， 给家蚕注射微量的细菌或病毒，采用使家蚕饥饿的方法时，对家蚕不喂桑叶，让其饥饿48 小时，再正常饲养24小时，该专利所述诱导方法简单易行，能有效诱导出较多的抗菌肽，使抗菌肽提取效率大为提高；中国专利ZL200910193620. O则公开了一种家蚕抗菌肽BmcecE 及其cDNA序列与应用，该发明的家蚕抗菌肽对革兰氏阳性菌(苏云金芽孢杆菌)、以及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌)均具有抗菌活性、抗菌谱广，家蚕抗菌肽BmcecE可用于人、畜、禽的药物研发、预防和治疗由苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌感染引起人、畜、禽的致病，还可以用于生物产品添加剂的制备，防止由苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌引起的生物产品的腐败变质。但目前未见采用免疫诱导生物技术，利用五龄蚕中部丝腺高量合成丝胶蛋白抗菌肽、在后部丝腺合成丝素蛋白抗菌肽，进而通过固相或液相生物技术合成、扩增，制备用于农业抗菌生产的生物抗菌有机肥料的相关研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法，以天然五龄蚕为原材料，通过天然五龄蚕中部丝腺高量合成丝胶蛋白抗菌肽，在后部丝腺合成丝素蛋白抗菌肽，以生物高活性剂对丝蛋白抗菌基因进行调控，以固相或液相生物技术合成、扩增，制得生物抗菌有机肥料，所述的调控及固相或液相生物技术合成、扩增的具体步骤为在天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕中部丝腺 1/2处合成丝胶蛋白或天然五龄蚕后部丝腺合成丝素蛋白时，进行免疫诱导，然后在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体经冷冻干燥至水分含量为709Γ75%或将天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎后，投入50kg反应釜中，并加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料。本发明所述的免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法为下列方法中的一种
(1)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体中部丝腺1/2处合成丝胶蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体冷冻干燥至水分含量为70°/Γ75%，然后将经冷冻干燥的天然五龄蚕蚕体投入50kg反应釜中，并加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料；
(2)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体中部丝腺1/2处合成丝胶蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎并将粉碎后得到的液体投入50kg反应釜中，加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂， 在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料；
(3)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体尾部丝腺处合成丝素蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体冷冻干燥至水分含量70°/Γ75%，将经冷冻干燥的天然五龄蚕蚕体投入50kg反应釜中，并加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料；
(4)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体尾部丝腺处合成丝素蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎并将粉碎后得到的液体投入50kg反应釜中，加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料。所述免疫诱导方法为用接种器将枯草杆菌接种到天然五龄蚕蚕体中部丝腺1/2 处或接种到天然五龄蚕蚕体尾部丝腺处，接种后3 5日天然五龄蚕蚕体达到免疫高峰期。所述生物高活性剂为生物分裂素，为湛江师范学院自主知识产权研究成果生产。所述冻干的条件为2-4小时内，将温度由常温降到预冻温度-20 V，保持-20°C I. 5-3小时，再由-20°C升温至_5'8°C，维持2 4小时，然后用真空泵抽干。所述生物抗菌有机肥料为固体抗菌有机肥料或液体抗菌有机肥料。本发明相对于现有技术的有益效果是
(I)本发明所述免疫诱导生物技术合成制备生物抗菌有机肥料的方法，其生物技术合成路线简便易学，生产成本低廉，产率可控度高，防病害能力高达95%以上，且便于产业化生产；
(2 )采用本发明方法制备得到的生物抗菌有机肥料在农用时拌土，栽前浸根，对革兰氏阳性菌(苏云金芽孢杆菌)、以及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌)或是由苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、灵菌败血病菌或青枯菌、枯草杆菌、青枯病等病原菌、枯萎镰刀菌引起的感染，具有较强的抗菌作用及高效、广谱的抗菌优势。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例I 采用本发明所述方法，按下列步骤制备一种用于农业抗菌生产的生物抗菌有机肥料
(1)抗体菌种枯草杆菌；生物高活性剂来源于湛江师范学院自主知识产权研究成果生产的生物分裂素；
(2)制备步骤
①天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体中部丝腺1/2处合成丝胶蛋白时，用接种器将枯草杆菌接种到天然五龄蚕蚕体中部丝腺1/2处，免疫诱导，接种后5日天然五龄蚕蚕体达到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，将处于免疫高峰期的天然五龄蚕蚕体冷冻干燥至水分含量为70%， 然后将经冷冻干燥的天然五龄蚕蚕体投入50kg反应釜中，并加入占天然五龄蚕蚕体质量 1/1000的生物分裂素，在常温下发酵6天；
③发酵结束，采用下列冻干条件将发酵后的产物冻干2.5小时常温降到预冻温度_20°C，保持_20°C 2小时，再由-20°C升温至_5°C，维持2小时，然后用真空泵抽干；
④冻干后产品即为固体抗菌有机肥料成品，分装后用于农业抗菌生产。实施例2 采用本发明所述方法，按下列步骤制备一种用于农业抗菌生产的生物抗菌有机肥料
(1)抗体菌种枯草杆菌；生物高活性剂来源于湛江师范学院自主知识产权研究成果生产的生物分裂素；
(2)制备步骤
①天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体中部丝腺1/2处合成丝胶蛋白时，用接种器将枯草杆菌接种到天然五龄蚕蚕体中部丝腺1/2处，免疫诱导，接种后4日天然五龄蚕蚕体达到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，将处于免疫高峰期的天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎并将粉碎后得到的液体投入50kg反应釜中，加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物分裂素，在常温下发酵6天；
③发酵结束，采用下列冻干条件将发酵后的产物冻干2小时常温降到预冻温度_20°C，保持_20°C 3小时，再由-20°C升温至_6°C，维持3小时，然后用真空泵抽干；
④冻干后产品即为液体抗菌有机肥料成品，分装后用于农业抗菌生产。实施例3 采用本发明所述方法，按下列步骤制备一种用于农业抗菌生产的生物抗菌有机肥料
(O目标抗体菌种枯草杆菌；生物高活性剂来源于湛江师范学院自主知识产权研究成果生产的生物分裂素；
(2)制备步骤
①天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体尾部丝腺处合成丝素蛋白时，用接种器将枯草杆菌接种到天然五龄蚕蚕体尾部丝腺处，免疫诱导，接种后3日天然五龄蚕蚕体达到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，将处于免疫高峰期的天然五龄蚕蚕体冷冻干燥至水分含量为75%， 然后将经冷冻干燥的天然五龄蚕蚕体投入50kg反应釜中，并加入占天然五龄蚕蚕体质量 1/1000的生物分裂素，在常温下发酵8天；
③发酵结束，采用下列冻干条件将发酵后的产物冻干3小时常温降到预冻温度_20°C，保持_20°C 2. 5小时，再由-20°C升温至_6°C，维持2小时，然后用真空泵抽干；
④冻干后产品即为固体抗菌有机肥料成品，分装后用于农业抗菌生产。实施例4 采用本发明所述方法，按下列步骤制备一种用于农业抗菌生产的生物抗菌有机肥料
(1)抗体菌种枯草杆菌；生物高活性剂来源于湛江师范学院自主知识产权研究成果生产的生物分裂素；
(2)制备步骤
①天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体尾部丝腺处合成丝素蛋白时，用接种器将枯草杆菌接种到天然五龄蚕蚕体尾部丝腺处，免疫诱导，接种后3日天然五龄蚕蚕体达到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，将处于免疫高峰期的天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎并将粉碎后得到的液体投入50kg反应釜中，加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物分裂素，在常温下发酵7天；
③发酵结束，采用下列冻干条件将发酵后的产物冻干4小时常温降到预冻温度-20°C，保持_20°C I. 5小时，再由-20°C升温至_8°C，维持4小时，然后用真空泵抽干；
④冻干后产品即为液体抗菌有机肥料成品，分装后用于农业抗菌生产。
权利要求
1.一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法，其特征在于该方法是以天然五龄蚕为原材料，通过天然五龄蚕中部丝腺高量合成丝胶蛋白抗菌肽，在后部丝腺合成丝素蛋白抗菌肽，以生物高活性剂对丝蛋白抗菌基因进行调控，以固相或液相生物技术合成、扩增，制得生物抗菌有机肥料，所述的调控及固相或液相生物技术合成、扩增的具体步骤为在天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕中部丝腺1/2处合成丝胶蛋白或天然五龄蚕后部丝腺合成丝素蛋白时，进行免疫诱导，然后在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体经冷冻干燥至水分含量为70°/Γ75%或将天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎后，投入50kg反应釜中， 并加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料。
2.一种如权利要求I所述的免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法，其特征在于为下列方法中的一种(1)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体中部丝腺1/2处合成丝胶蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体冷冻干燥至水分含量为70°/Γ75%，然后将经冷冻干燥的天然五龄蚕蚕体投入50kg反应釜中，并加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料；(2)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体中部丝腺1/2处合成丝胶蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎并将粉碎后得到的液体投入50kg反应釜中，加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂， 在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料；(3)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体尾部丝腺处合成丝素蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体冷冻干燥至水分含量 70°/Γ75%，将经冷冻干燥的天然五龄蚕蚕体投入50kg反应釜中，并加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料；(4)天然五龄蚕生长到第三天，在天然五龄蚕体尾部丝腺处合成丝素蛋白时，用接种器接种枯草杆菌，进行免疫诱导，在免疫高峰期，将天然五龄蚕蚕体直接碾磨粉碎并将粉碎后得到的液体投入50kg反应釜中，加入占天然五龄蚕蚕体质量1/1000的生物高活性剂，在常温下发酵6-8天，冻干后，即得到生物抗菌有机肥料。
3.根据权利要求I或2所述的一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法， 其特征在于所述免疫诱导方法为用接种器将枯草杆菌接种到天然五龄蚕蚕体中部丝腺 1/2处或接种到天然五龄蚕蚕体尾部丝腺处，接种后3 5日天然五龄蚕蚕体达到免疫高峰期。
4.根据权利要求I或2所述的一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法， 其特征在于所述生物高活性剂为生物分裂素。
5.根据权利要求I或2所述的一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法，其特征在于所述冻干的条件为2-4小时内，将温度由常温降到预冻温度-20°C，保持-20°C I. 5-3小时，再由-20°C升温至_5'8°C，维持2 4小时，然后用真空泵抽干。
6.根据权利要求I或2所述的一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法， 其特征在于所述生物抗菌有机肥料为固体抗菌有机肥料或液体抗菌有机肥料。
全文摘要
本发明公开了一种免疫诱导生物技术制备生物抗菌有机肥料的方法。本发明利用了家蚕具有超强的免疫蛋白合成能力，通过天然五龄蚕中部丝腺高量合成丝胶蛋白抗菌肽，在后部丝腺合成丝素蛋白抗菌肽，以生物高活性剂对丝蛋白基因进行调控，以固相或液相生物技术合成、扩增，制得生物抗菌有机肥料。本发明方法生物技术合成路线简便易学，生产成本低廉，产率可控度高，防病害能力高达80%~95%以上，且成果易转化、便于产业化生产；采用本发明方法制得的生物抗菌有机肥料在农用时拌土，栽前浸根，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或枯草杆菌、青枯病等病原菌、枯萎镰刀菌引起的感染，具有较强的抗菌作用及高效、广谱的抗菌优势。
文档编号C05G3/00GK102584452SQ20121003980
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月22日 优先权日2012年2月22日
发明者李典, 罗富英 申请人:湛江师范学院