专利名称：一株对美国白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物杀虫剂技术领域，涉及一株对美国白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其制备方法，更具体的说是国际重要检疫性害虫一美国白蛾筛选到一株对其具有高致病力的球孢白僵菌菌株采集、菌种鉴定和筛选过程。
背景技术：
长期以来，白僵菌作为害虫生物防治的重要因子受到广泛关注和研究。我国从上个世纪50年代开始白僵菌的研究和应用，其中应用球孢白僵菌防治松毛虫、玉米螟是世界上杀虫真菌应用面积最大、最为成功的事例之一，目前仍保持每年应用面积50万公顷，应用面积最高年份超过133万公顷。据不完全统计，1996年我国白僵菌生产厂多达64个。利用白僵菌能够成功防治的害虫种类在40种以上(周鍈等人，北京化学工业出版社，2006)。美国白蛾是一种重要的国际性检疫害虫。自从1979年首次在我国丹东发现至今的30余年已传至河北、天津、山东、陕西、北京等诸多省市，给我国林业生产以及生态安全造成了重大损失和潜在威胁。赵铁珍等人(2004年全国美国白蛾疫区的非经济损失评估[J].林业经济问题，2006，26 (4):321-326)评估美国白蛾造成的全国非经济损失总量合计为140. 35亿元。优先利用各种生物技术与其它非化学防控技术控制美国白蛾是确保我国林业有害生物实现可持续发展的重要保证。如，众所周知的利用周氏啮小蜂防控美国白蛾得到大面积推广应用，效果显著。利用白僵菌防控美国白蛾在山东也有应用的报道，但是以美国白蛾为防控对象取得农药登记的白僵菌制剂在我国目前为空白。但是针对美国白蛾筛选高致病力球孢白僵菌菌株的研究在我国才刚刚起步。陆秀君等人(美国白蛾高毒白僵菌菌株筛选及其与高效氯氰菊酯的相容性[J].植物保护学报，2008，35 (6) :575-576)报道了美国白蛾高毒白僵菌菌株的筛选结果，在6个球孢白僵菌中各菌株的毒力与致死时间上差异显著；刘宝生等人(白僵菌Bb08-12菌株生物学研究及其对美国白蛾的致病力[J].植物保护，2011，37 (4) :146-149)报道了 Bb08_12菌株对美国白蛾的致病性。因此，筛选对美国白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株是一项重要的基础研究工作。
发明内容
本发明涉及的菌株是发明人从感染白僵菌的美国白蛾越冬蛹上分离纯化获得，经过和其它10株不同来源的球孢白僵菌在相同的条件对美国白蛾的室内毒力测定(测定方法相同)，筛选出4株高致病力的菌株，对这4菌株再经过田间对美国白蛾的防效试验，确认发明人自己分离的一株球孢白僵菌Bbl0331菌株具有进一步研发潜力和生产使用价值，特此将该菌株申请发明专利。本发明的一个目的是公开了一种球孢白僵菌菌株，其保藏号为CGMCC No. 5739。本发明的另一个目的是公开了 CGMCC No. 5739菌株的制备方法。
本发明的再一个目的是公开了孢白僵菌菌株在制备作为微生物杀虫剂防治害虫方面的应用。特别是作为微生物杀虫剂防治农林园艺害虫方面的应用。优选是在防治美国白蛾害虫方面的应用。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案
一种球孢白僵菌菌株，特别是对美国白蛾幼虫具有高致病力的球孢白僵菌菌株(球孢白僵菌菌株(ifeawreria代号Bb 10331,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普
通微生物中心的保藏号为=CGMCC No. 5739。本发明公开的球抱白僵菌菌株iBeauveria Aa1S1Siafla),代号Bbl0331,于2012年2月I日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌株保藏号为CGMCCNo. 5739。保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。本发明公开的球抱白僵菌菌株iBeauveria如)代号Bb 10331, CGMCC No.5739所具有的形态、DNA-ITS序列、生物学特征如下
(I)菌落形态特征(沙氏培养基上培养)白色，较平坦，中央2/3面积为乳白色孢子粉层有较为明显的放射状脊沟；外呈白色的毛毡状，放射状脊沟不明显或无。菌落初期侧面观为乳突型。(2)产孢结构及分生孢子特征分生孢子梗多数为瓶状，也见有丝状，单生或簇生；分生孢子梗顶端产孢小梗呈“之”字形；分生孢子着生在产孢梗的折点处。分生孢子多为球形，也有卵圆形，平均大小为2. 95 (2. 16 4.78) X2. 10 (I. 82 2. 92)微米。(3)该菌株特异性DNA-ITS序列碱基数569bp。(4)生物学特性该菌株营养生长适宜的温度范围26 29摄氏度，PH值5. 5
6.0 ;产孢最适温度为26摄氏度，适宜的PH值范围在6. 5 7. 0，分生孢子萌发的适宜温度为26 29摄氏度，适宜的PH值范围在6. 5 7. O。球孢白僵菌菌株(ifeawreria bassiana )CGMCC No. 5739的制备方法,其特征在于按如下步骤进行
(1)球孢白僵菌菌株(ifeawreriaAa1S1Siafla),代号Bb10331的分离从天津市武清区霍屯采集的感染白僵菌的美国白蛾越冬蛹体上分离获得；
(2)纯化方法
将感染白僵菌的美国白蛾蛹体上的白粉状物轻轻抖落到盛有0. 05%吐温灭菌水(加入适量的直径达2-3mm的灭菌的玻璃砂粒)的50毫升的三角瓶中充分震荡使白僵菌分生孢子单个分散开，取配好的孢子悬浮液逐一稀释100倍、500倍、1000倍液，用灭菌的三角形玻璃涂抹棒分别蘸取不同稀释倍数的白僵菌孢子液涂抹于培养皿中沙氏琼脂培养基平板(已灭菌)上，置于恒温26摄氏度的培养箱中培养；
在培养第2 5天过程中，当有纯白色的单个菌落长出后，及时挑取单个纯白菌落转接到一个培养皿的沙氏琼脂培养基平板上单独培养，观察确无(青霉、黑根霉等)杂菌后，纯化培养完成；将得到的白僵菌菌株转入盛有沙氏斜面培养基的试管，按照上述培养温度培养15天左右待有大量分生孢子长出后，将试管贴好菌株标签转入4摄氏度冷藏箱中保藏6个 月左右，再活化转管培养、继续保藏；
萨氏琼脂培养基配方(注下列培养基各成分，有市售)蛋白胨10g，葡萄糖40g，酵母膏2g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，PH5. 6);制备过程、方法按照配方比例，根据制备培养基总量称取各成份的质量。将蛋白胨用少量常温蒸馏水(含在总量内)润湿化开再倒入锅内，然后加入葡萄糖、酵母膏充分混匀，最后加入润湿呈粥状的琼脂粉，直到培养基煮成透明状，补足蒸馏水至100%，用PH值试纸测量调节培养基的PH值使其至5. 6-6. 0即可；分装到250毫升或500毫升的三角瓶内，高压蒸汽灭菌，在0. IMPa的压力下121. 3摄氏度灭菌40 45分钟；
(3)该菌株在萨氏琼脂试管斜面培养基恒温26摄氏度培养15天后4摄氏度下保藏。本发明进一步公开了球孢白僵菌菌株(ifeawreria如)在制备作为微生物杀虫剂防治害虫方面的应用。特别是在防治农林园艺害虫方面的应用。典型的是作为微生物杀虫剂防治美国白蛾害虫方面的应用。
本发明制备的球孢白僵菌菌株(ifeawreria bassiana) Bb 10331的特点
检验项目小鼠急性经口毒性试验
检测结果动物染毒后，未见明显中毒表现，观察期内无死亡，尸检中各主要脏器未见明显异常。检测结论本品的小鼠急性经口毒性LD5tl > 20. 0 / g / kg. BW。按《食品安全性毒理学评价疗程和方法》(GB15193. 3-2003)，本品属于无毒。
具体实施例方式 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定，下面通过实例来进一步阐明本发明球孢白僵菌菌株的制备方法及应用，本发明所用到的试剂除特别指出外均有市售。实施例I
I白僵菌Bbl0331及另外10株白僵菌的采集、分离和纯化
利用黄粉虫(市售)诱集法、白僵菌选择性培养基分离法从土壤中筛选白僵菌；利用稀释分离法从感染白僵菌的美国白蛾蛹上分离、纯化。从白僵菌制剂生产商与科研单位索取白僵菌制剂及菌种。从制剂中纯化白僵菌菌株方法采用稀释分离法。结果见表I:
黄粉虫诱集法首先把土壤样品过细筛后加入适量的水，使其含水量达到潮湿状态(手攥成团，轻触散开)，在90mm直径的培养皿中装入三分之二的潮湿细土样品，把黄粉虫幼虫接入培养皿的土壤样品中。最后把接虫的培养皿置于26摄氏度培养I周左右，检查黄粉虫是否被白僵菌感染。白僵菌选择性培养基筛选法
白僵菌选择性培养基(各组份，市售)配方葡萄糖40g，蛋白胨10g，孟加拉红(虎红)
0.330g,琼脂粉17g，蒸馏水IOOOmL,培养基制成后高压湿热灭菌，使用前等培养基温度降到40°C左右后加入IOOOmL加入CuS04 Ig,放线菌酮0. 500g,氯霉素0. 500g。将土壤样品或白僵菌制剂样品进行逐级稀释(100倍、500倍、1000倍)，直至能够在白僵菌选择性培养基平板上长出单个白色白僵菌菌落，密度较小，便于转接培养观察。表I白僵菌菌株采集、收集结果
权利要求
1.一种球孢白僵菌菌株iBeauveriabassiana),代号Bb 10331，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 5739。
2.权利要求I所述球孢白僵菌菌株如Miwa)在制备作为微生物杀虫剂防治害虫方面的应用。
3.权利要求I所述球孢白僵菌菌株如Miwa)在制备作为微生物杀虫剂防治农林园艺害虫方面的应用。
4.权利要求I所述球孢白僵菌菌株如Miwa)在制备作为微生物杀虫剂防治美国白蛾害虫方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一株对美国白蛾具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其制备方法。包括对白僵菌高毒力菌株采集、菌种鉴定和筛选过程。本发明筛选出的Bb10331菌株,保藏号CGMCCNo.5739,是发明人从天津市武清区霍屯采集的感染白僵菌的美国白蛾越冬蛹体上利用稀释分离法纯化获得的菌株。通过对该菌株菌落、产孢结构、分生孢子形态观察以及DNA-ITS序列测定鉴定出该菌株为球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。通过实验室毒力测定和对田间杨树上发生的美国白蛾的防治试验以及防治保护地黄瓜作物上蚜虫试验，这些结果都显示了该菌株具有良好的开发潜力和生产应用价值。
文档编号A01N63/04GK102634459SQ20121004792
公开日2012年8月15日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者刘宝生, 孙淑琴, 徐维红, 白义川, 胡霞, 许静杨, 谷希树 申请人:天津市植物保护研究所