专利名称：发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方及筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方及筛选方法。
背景技术：
我国每年白酒糟产量高达2100多万t，基于酒糟中含有一定的蛋白质，丰富的氨基酸、维生素和多种微量元素等，传统的做法是将鲜酒糟直接饲喂牲畜当饲料原料，此方法有两个弊端一是鲜酒糟内粗纤维含量高、家畜适口性差、消化率低，霉烂酒糟易产生病虫害；二是鲜酒糟含水率高，难运输，酸度高，易腐败变质。为此，人们对其资源化问题进行了多方面的研究，如利用白酒糟制取甘油，培养食用菌，提取复合氨基酸及微量元素，提取植酸和植酸钙，酿醋；利用酒精糟厌氧发酵回收沼气，提取蛋白质，生产干全饲料(DDGS)，制取单细胞蛋白(SCP)饲料，酒糟发酵生产燃料乙醇，生产粗酶制剂等。以上方法由于规模小、能源消耗大、营养物质转化不充分等问题多数处于停顿状态。为此我们采用微生物固态发酵白酒糟生产生物饲料，此法有以下优点微生物生长速度快，周期短、蛋白质含量高，含丰富的必需氨基酸、B族维生素、辅酶等，生产不受气候条件、产季节变化的影响，仅需少量土地、劳动力和能源，酒糟中营养物质得到有效的利用。本试验特设计将班图酒香酵母(Y1)、枯草芽孢杆菌(Y2)、绿色木霉(Y3)、嗜酸乳杆菌(Y4) 4种菌进行不同的组合发酵白酒糟培养基，通过对各指标的测定筛选出最佳组
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发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种有效发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方及筛选方法，以克服现有技术存在的能源消耗大、营养物质转化不充分等不足。本发明的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方为它包括酒糟培养基和菌种，所述酒糟培养基的配方为鲜白酒糟60 %、玉米粉10 %、菜籽柏10 %、水20 %，此处的百分比指各配方占酒糟培养基的总重量之比；且每100 g酒糟培养基中另加硫酸亚铁15mg、硫酸锌12 mg、硫酸锰10 mg、硫酸铜15 mg、磷酸氢钙2 g ;所述的菌种包括枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌和班图酒香酵母。所述枯草芽孢杆菌，针对其菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长。接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液I. 5ml，接种摇菌后第22 h的、活菌数达I. 33X1011cfu/mL。 所述绿色木霉，针对它是所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，效果非常好，酒糟中纤维素含量很高，利用绿色木霉能很好的起到降解纤维的目的，提高饲料的适口性，及消化效率。接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液I. 5ml，接种摇菌后第36 h的、活菌数达7. 0X1010 cfu/ml。
所述嗜酸乳杆菌，针对它是一种能从发酵碳水化合物产酸的细菌，为肠道中的正常微生物。其作用归纳为产生有机酸拮抗病原微生物，调节动物消化道微生物区系平衡、活化免疫防御系统增强免疫力、合成维生素等营养物质、产生消化酶，提高酶活性有利于饲料消化吸收、降低氨、胺等有害物质的产生，控制肠毒素，增进动物健康，有利于动物健康。接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液I. 5ml，接种摇菌后第16 h的、活菌数达2. I X1010 cfu/mLo所述班图酒香酵母，针对它是一类非常重要的微生物，安全性好，含有丰富蛋白质，含量一般占细胞干重的50%-55%以上，且氨基酸组成丰富。它还能合成丰富的B族维生素、乙醇、有机酸、酶类等多种营养成分和某些协同因子。接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液I. 5ml，接种摇菌后第32 h的、活菌数达3. 5 X IO11 cfu/mL。发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，包括以下过程
它包括以下过程所选菌种的确定、所选菌种是否能复合添加的确定、最佳接种时间的 确定、最佳发酵方式的确定，以l-4d有氧5-10d天厌氧进行酒糟微生物固态发酵,发酵后成分的测定和筛选出最佳组合配方。所选菌种是否能复合添加的确定，是将班图酒香酵母、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌4种菌两两组合分组，将每组的其中一种菌以10 _的间隔划线接种于普通培养基上，然后取另外一种菌垂直划一条直线，30 °C培养24 h，观察十字交叉处是否有被抑制而发生菌落萎缩和消失的现象。各组菌种十字交叉处均未出现菌落萎缩和消失的现象，得出结论各菌间均不存在拮抗效应，适合组合发酵酒糟培养基。最佳接种时间的确定，即测得嗜酸乳杆菌、班图酒香酵母、绿色木霉、枯草芽孢杆菌的生长曲线得出最佳接种时间
最佳发酵方式的确定，是将班图酒香酵母、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌4种菌分别接种一环斜面菌于100 mL液体培养基中，150 r/min、30 °C摇菌，此处摇菌即为振荡培养。摇菌后将4种菌搭配共分为15组每组3个重复，每个重复所接各菌种体积相等，以每IOOg酒糟培养基总接种量为6ml菌液的比例接种到酒糟饲料发酵培养基中。接种后分别用2种方式发酵一种完全厌氧、另一种为1-4 d有氧，5-12 d为厌氧，温度都为30 °C。分别于发酵后的3、6、9、12 d取样检测活菌数，确定最佳发酵方式及时间。以l-4d有氧5-10d天厌氧进行酒糟微生物固态发酵将Y1-Y4的4种菌分别接种一环斜面菌于IOOml液体培养基中，150r/min、30°C摇菌。摇菌后将4种菌以单菌、双菌、三菌、四菌搭配分为14组，连同对照组共分为15组，每组3个重复，每个重复所接各菌种体积相等，以每IOOg酒糟培养基总接种量为6ml菌液的比例接种到酒糟饲料发酵培养基中。绿色木霉接种摇菌后第36 h的，活菌数达到7. OX 101(lCfu/ml ;酵母菌接种摇菌后第32 h的，活菌数达到3. 5X10ncfu/ml ;乳酸菌接种摇菌后第16 h的，活菌数达到2. I X IO10Cfu/ml ;枯草芽孢杆菌接种摇菌后第22 h的，活菌数达到I. 33X 10ncfu/ml。接种后以l_4d有氧，5-10d天为厌氧，温度都为30°C的方式发酵。具体分组为第I组对照组(发酵前的样品，未接菌、未发酵)、第2组单接Y1、第3组单接Y2、第4组单接Y3、第5组单接Y4、第 6 组Y1+ Y2、第 7 组Y1+ Y3、第 8 组Y2+ Y3、第 9 组Y1+ Y4、第 10 组Y2+ Y4、第 11组Y3+ Y4、第 12 组Y1+ Y2+ Y4、第 13 组Y2+ Y3+ Y4、第 14 组Y1+ Y2+ Y3、第 15 组Y1+Y2+Y3+ Y4。总发酵时间为IOd0
发酵后成分的测定和筛选出最佳组合配方，包括酶活测定和酒糟发酵培养基各养分指标测定；酶活测定是指发酵第7d取样采用ELISA试剂盒测定蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶活性浓度；酒糟发酵培养基各养分指标测定是指将发酵前及发酵第IOd的饲料样品混匀、烘干、粉碎制备成分析试样进行干物质、粗灰分、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、氨基酸含量、脂肪酸含量的测定，确定最佳菌种组合。
测定结果比较各组发酵后第6-9d活菌数最高，第9d后开始下降。筛选出第15组为最佳组合，该组发酵第7d蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶酶活浓度分别为317. 38U/g、350. 48U/g、116. 79U/g、89. 71U/g优于其它组相比发酵前显著提高；干物质、粗蛋白、粗灰分(风干基础)分别为95. 31%、23. 2%、11. 15%优于其它组较发酵前显著提高；酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维(风干基础)分别为6. 37%、12. 53%优于其它组较发酵前显著降低；C22:6n-3(DHA)、单不饱和脂肪酸之和、多不饱和脂肪酸之和分别为16. 20%,26. 47%,31. 86%优于其它组较发酵前显著提高；总氨基酸、总必须氨基酸、总鲜味氨基酸分别为18.31%、8. 15%、7. 27%仅次于第8组组较发酵前显著提高。本发明有益效果本发明能将酒糟原料转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、功能性脂肪酸、微生物活性益生菌、复合酶制剂为一体的生物发酵饲料。该饲料产品不但可以弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸、脂肪酸，而且能使其中不易吸收等原料营养成份迅速转化，达到提高家畜适口性增强消化吸收利用效果。解决了酒糟对环境污染造成的压力、提高了酒糟的适口性及营养成分，解决了人畜争粮的问题、为酒糟资源化利用提出了解决方案。具有以下的技术优势和积极效果
(1)微生物生长速度快，周期短、蛋白质含量高，含丰富的必需氨基酸、B族维生素、辅酶等；
(2)生产不受气候条件、生产季节变化的影响，仅需少量土地和劳动力、能源消耗低，酒糟中营养物质得到有效的利用。
图I为本发明有效发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合筛选流程图。
具体实施例方式
具体实施例方式本发明的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方为菌种包括枯草芽抱杆菌 iBaciIlus subtiIis (Ehrenberg) Cohn )、绿色木霉(Trichodermaviride、、嗜酸乳杆菌{Lactobacillus acidophilus')、班图酒香酵 ^^U^rGttanomycesCttSter1Siazw1S);酒糟培养基的配方为鲜白酒糟60 %、玉米粉10 %、菜籽柏10 %、水20 %,且每100 g酒糟培养基中另加硫酸亚铁15 mg、硫酸锌12 mg、硫酸猛10 mg、硫酸铜15 mg、磷酸氢钙2 g0枯草芽孢杆菌接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液1.5ml，活菌数为
I.33X10ncfu/mL。绿色木霉接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液I. 5ml，活菌数为7. OX 101°cfu/mL0嗜酸乳杆菌接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液I. 5ml，活菌数为2. I X 101°cfu/mLo班图酒香酵母接种量为每100 g酒糟培养基接种其菌液I. 5ml，活菌数为3. 5 X IO11 cfu/mLo如附图I所示意，发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，包括以下过程所选菌种的确定、所选菌种是否能复合添加的确定、最佳接种时间的确定、最佳发酵方式的确定，以l-4d有氧5-10d天厌氧进行酒糟微生物固态发酵，发酵后成分的测定和筛选出最佳组合配方。
所选菌种的确定。针对发酵后酒糟要达到的目的弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸、脂肪酸，使其中不易吸收等原料营养成份迅速转化，达到提高家畜适口性增强消化吸收利用效果，即干物质、粗蛋白、多不饱和脂肪酸、氨基酸含量的提高；粗纤维含量降低。确定所选菌种。所选菌种是否能复合添加的确定，是将班图酒香酵母、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌4种菌两两组合分组，将每组的其中一种菌以10 _的间隔划线接种于普通培养基上，然后取另外一种菌垂直划一条直线，30 °C培养24 h，观察十字交叉处是否有被抑制而发生菌落萎缩和消失的现象。各组菌种十字交叉处均未出现菌落萎缩和消失的现象，得出结论各菌间均不存在拮抗效应，适合组合发酵酒糟培养基。最佳接种时间的确定，即测得嗜酸乳杆菌(Y1)、班图酒香酵母(Y2)、绿色木霉(Y3)、枯草芽孢杆菌(Y4)的生长曲线得出最佳接种时间；
最佳发酵方式的确定，是将班图酒香酵母、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌4种菌分别接种一环斜面菌于100 mL液体培养基中，150 r/min、30 °C摇菌。摇菌后将4种菌搭配共分为15组每组3个重复，每个重复所接各菌种体积相等，以每IOOg酒糟培养基总接种量为6ml菌液的比例接种到酒糟饲料发酵培养基中。接种后分别用2种方式发酵一种完全厌氧、另一种为1-4 d有氧，5-12 d为厌氧，温度都为30 °C。分别于发酵后的3、6、9、
12d取样检测活菌数，确定最佳发酵方式及时间。以l-4d有氧5-10d天厌氧进行酒糟微生物固态发酵将Y1-Y4的4种菌分别接种一环斜面菌于IOOml液体培养基中，150r/min、30°C摇菌。摇菌后将4种菌以单菌、双菌、三菌、四菌搭配分为14组，连同对照组共分为15组，每组3个重复，每个重复所接各菌种体积相等，以每IOOg酒糟培养基总接种量为6ml菌液的比例接种到酒糟饲料发酵培养基中。绿色木霉接种摇菌后第36 h的，活菌数达到7. OX 101(lCfu/ml ;酵母菌接种摇菌后第32 h的，活菌数达到3. 5X10ncfu/ml ;乳酸菌接种摇菌后第16 h的，活菌数达到2. I X IO10Cfu/ml ;枯草芽孢杆菌接种摇菌后第22 h的，活菌数达到I. 33X 10ncfu/ml。接种后以l_4d有氧，5-10d天为厌氧，温度都为30°C的方式发酵。具体分组为第I组对照组(发酵前的样品，未接菌、未发酵)、第2组单接Y1、第3组单接Y2、第4组单接Y3、第5组单接Y4、第 6 组Y1+ Y2、第 7 组Y1+ Y3、第 8 组Y2+ Y3、第 9 组Y1+ Y4、第 10 组Y2+ Y4、第 11组Y3+ Y4、第 12 组Y1+ Y2+ Y4、第 13 组Y2+ Y3+ Y4、第 14 组Y1+ Y2+ Y3、第 15 组Y1+Y2+Y3+ Y4。总发酵时间为IOd0发酵后成分的测定和筛选出最佳组合配方，包括酶活测定和酒糟发酵培养基各养分指标测定；酶活测定是指发酵第7d取样采用ELISA试剂盒测定蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶活性浓度；酒糟发酵培养基各养分指标测定是指将发酵前及发酵第IOd的饲料样品混匀、烘干、粉碎制备成分析试样进行干物质、粗灰分、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、氨基酸含量、脂肪酸含量的测定，确定最佳菌种组合。
测定结果比较各组发酵后第6-9d活菌数最高，第9d后开始下降。筛选出第15组为最佳组合，该组发酵第7d蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶酶活浓度分别为317. 38U/g、350. 48U/g、116. 79U/g、89. 71U/g优于其它组相比发酵前显著提高；干物质、粗蛋白、粗灰分(风干基础)分别为95. 31%、23. 2%、11. 15%优于其它组较发酵前显著提高；酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维(风干基础)分别为6. 37%、12. 53%优于其它组较发酵前显著降低；C22:6n-3(DHA)、单不饱和脂肪酸之和、多不饱和脂肪酸之和分别为16. 20%,26. 47%,31. 86%优于其它组较发酵前显著提高；总氨基酸、总必须氨基酸、总鲜味氨基酸分别为18. 31%、8. 15%、7. 27%仅次于第8组组较发酵前显著提高。
权利要求
1.一种发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方，其特征在于它包括酒糟培养基和菌种，所述酒糟培养基的配方为鲜白酒糟60 %、玉米粉10 %、菜籽柏10 %、水20 %，此处的百分比指各配方占酒糟培养基的总重量之比；且每100 g酒糟培养基中另加硫酸亚铁15 mg、硫酸锌12 mg、硫酸猛10 mg、硫酸铜15 mg、磷酸氢|丐2 g ;所述的菌种包括枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌和班图酒香酵母。
2.根据权利要求I所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方，其特征在每100 g酒糟培养基接种枯草芽孢杆菌菌液I. 5ml，活菌数为I. 33X 10ncfu/mL。
3.根据权利要求I所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方，其特征在每100 g酒糟培养基接种绿色木霉菌液I. 5ml，活菌数为7. OX 101° cfu/mL。
4.根据权利要求I所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方，其特征在每100 g酒糟培养基接种嗜酸乳杆菌菌液I. 5ml，活菌数为2. IXlO10 cfu/mL。
5.根据权利要求I所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方，其特征在每100 g酒糟培养基接种班图酒香酵母菌液I. 5ml，活菌数为3. 5X IO11 cfu/mL。
6.—种如权利要求I所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，其特征在于它包括以下过程所选菌种的确定、所选菌种是否能复合添加的确定、最佳接种时间的确定、最佳发酵方式的确定，以l-4d有氧5-10d天厌氧进行酒糟微生物固态发酵，发酵后成分的测定和筛选出最佳组合配方。
7.根据权利要求6所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，其特征在于所选菌种是否能复合添加的确定，是将班图酒香酵母、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌4种菌两两组合分组，将每组的其中一种菌以10 mm的间隔划线接种于普通培养基上，然后取另外一种菌垂直划一条直线，30 °C培养24 h，观察十字交叉处是否有被抑制而发生菌落萎缩和消失的现象；各组菌种十字交叉处均未出现菌落萎缩和消失的现象，得出结论各菌间均不存在拮抗效应，适合组合发酵酒糟培养基。
8.根据权利要求6所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，其特征在于最佳接种时间的确定，即测得嗜酸乳杆菌、班图酒香酵母、绿色木霉、枯草芽孢杆菌的生长曲线得出最佳接种时间。
9.根据权利要求6所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，其特征在于最佳发酵方式的确定，是将班图酒香酵母、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌4种菌分别接种一环斜面菌于100 mL液体培养基中，150 r/min、30 °C摇菌，此处摇菌即为振荡培养；摇菌后将4种菌搭配共分为15组每组3个重复，每个重复所接各菌种体积相等，以每IOOg酒糟培养基总接种量为6ml菌液的比例接种到酒糟饲料发酵培养基中；接种后分别用2种方式发酵一种完全厌氧、另一种为1-4 d有氧，5-12 d为厌氧，温度都为300C ,分别于发酵后的3、6、9、12 d取样检测活菌数，确定最佳发酵方式及时间。
10.根据权利要求6所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，其特征在于以l-4d有氧5-10d天厌氧进行酒糟微生物固态发酵，即将所选枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌和班图酒香酵母分别接种一环斜面菌于IOOml液体培养基中，150r/min、30°C摇菌，此处摇菌即为振荡培养；摇菌后将4种菌搭配共分为15组每组3个重复；每个重复所接各菌种体积相等，以每IOOg酒糟培养基总接种量为6ml菌液的比例接种到酒糟饲料发酵培养基中；绿色木霉接种摇菌后第36 h的，活菌数达到7.0X101(lCfU/ml ;酵母菌接种摇菌后第32 h的，活菌数达到3. 5X10ncfu/ml ;乳酸菌接种摇菌后第16h的，活菌数达到2. I X 101(lCfu/ml ;枯草芽孢杆菌接种摇菌后第22 h的，活菌数达到1.33X10ncfu/ml ;接种后以l-4d有氧，5-10d天为厌氧，温度都为30°C的方式发酵，总发酵时间为IOd0
11.根据权利要求6所述的发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方的筛选方法，其特征在于发酵后成分的测定和筛选出最佳组合配方，包括酶活测定和酒糟发酵培养基各养分指标测定；酶活测定是指发酵第7d取样采用ELISA试剂盒测定蛋白酶、淀粉酶、月旨肪酶、纤维素酶活性浓度；酒糟发酵培养基各养分指标测定是指将发酵前及发酵第IOd的饲料样品混匀、烘干、粉碎制备成分析试样进行干物质、粗灰分、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、氨基酸含量、脂肪酸含量的测定，确定最佳菌种组合。
全文摘要
本发明公开了一种发酵白酒糟生产酒糟生物饲料的菌种组合配方及筛选方法。其菌种组合配方包括酒糟培养基和菌种，所述酒糟培养基的配方为鲜白酒糟60%、玉米粉10%、菜籽粕10%、水20%；且每100g酒糟培养基中另加硫酸亚铁15mg、硫酸锌12mg、硫酸锰10mg、硫酸铜15mg、磷酸氢钙2g；所述的菌种包括枯草芽孢杆菌、绿色木霉、嗜酸乳杆菌和班图酒香酵母，接种量均为1.5%，其中枯草芽孢杆活菌数为1.33×1011cfu/mL，绿色木霉活菌数为7.0×1010cfu/mL，班图酒香酵母活菌数为3.5×1011cfu/ml，嗜酸乳酸菌活菌数为2.1×1010cfu/ml。
文档编号A23K1/06GK102630809SQ20121014311
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者周碧君, 夏先林, 王开功, 郭素环 申请人:贵州大学