专利名称：一种茶树组培再生体系建立的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及到一种茶树组织培养再生体系建立的方法。
背景技术：
植物组织培养是以细胞全能性为理论基础建立的一种离体培养技术。自20世纪初建立以来，广泛应用于植物的快速繁殖、品种改良、基因工程育种等方面[1]。茶树再生体系或组织培养技术是建立茶树遗传转化体系的基础，后者是进行基因功能验证、茶树工程基因育种、茶树次生代谢研究的重要技术平台。遗憾的是，由于缺乏合适的再生体系，迄今茶树遗传转化体系没有建立，限制了茶树基因工程、代谢工程的发展。1969年，佛利斯特作为先驱者就开始了茶树组织培养的研究[2]。如果不考虑遗传转化的话，实际上茶树的组织 培养已经较为成熟。茶树的嫩枝、茎节间和茶籽是常用的外植体，而腋芽增殖是主要的增殖方式。班纳吉气巴格[4]、蒙达尔[5]和孙俊M等采用成熟大田茶树嫩枝或实生苗的茎节间为外植体，通过腋芽或不定芽增殖形式进行再生实验，这种方式具有遗传稳定、增殖率高的特点，但是由于外植体的酚类物质含量高，难以进行茶树遗传转化。种子也是茶树再生理想的外植体，吴振铎m、加藤[8_9]、和蒙达尔[1°]等均利用种子诱导出体细胞胚，并进一步利用体细胞胚再生出植株。实验证明，体细胞胚是茶树遗传转化的理想对象，蒙达尔[n]甚至利用这种方式成功得到茶树第一个转基因植株，但是在这种方式中，体细胞胚的诱导和增殖是技术难点。虽然体细胞胚的诱导较为困难，但是胚性愈伤组织的诱导则较为简单。
发明内容
为了给茶树遗传转化奠定基础，本发明提供一种茶树组培再生体系建立的方法。一种茶树组培再生体系建立的具体操作步骤如下
I.I愈伤组织的诱导
采摘9月下旬生理成熟的茶籽作为茶树再生体系的原材料，即外植体；取茶籽5 10颗，将绿色的外壳剥去，用浓度75%的乙醇浸泡30秒，用无菌水洗3 4次；再用浓度O. 1%的升汞溶液浸泡10分钟，用无菌水洗3 4次；在超净条件下剥去种皮，选取完整的、带有胚的剥去种皮的茶树籽接种于普通B5培养基上，接种量为每40毫升接3 4颗；培养2周，有茶树愈伤组织长出；所述普通B5培养基中加入了二氯苯氧基乙酸和6-糠氨基嘌呤，其中二氯苯氧基乙酸的加入量为2. 5mg/L，6-糠氨基嘌呤的加入量为O. 5mg/L ；
I.2愈伤组织的继代和增殖
将茶树愈伤组织切下，并切成直径6 10毫米愈伤组织块，培养于普通B5培养基上，接种量每40毫升接5 10块；培养条件为黑暗、温度为25 28度；每21天更换一次新鲜的普通B5培养基；培养3周，得到鲜重可以增殖为原来的I. 8 2. 2倍的增殖愈伤组织；在此条件下，该愈伤组织可以稳定继代4年；
I.3不定芽的诱导，将增殖愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上，接种量每40毫升接直径6 10毫米大小的愈伤组织5 10块；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为25 28度，光强为3000 6000勒克司；每4周更换一次不定芽诱导培养基；培养到第3周，有部分愈伤组织转绿；培养到第4周，不定芽的诱导率为15. 71%，培养到2个月，诱导率上升为24. 29%，培养到4个月，诱导率高达65. 71% ;所述不定芽诱导培养基以MS培养基为基础，力口入吲哚丁酸和6-苄基腺嘌呤，其中吲哚丁酸的加入量为O. lmg/L, 6-苄基腺嘌呤的加入量为 2. 5mg/L ；
I.4不定芽的增殖
将新诱导出的不定芽切下，栽插到不定芽增殖培养基上，栽插量每100毫升接I 3棵；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为27度，光强为4000勒克司；培养3周，大量的丛生芽长出；在此条件下，可以不断增殖不定芽；所述不定芽增殖培养基以MS培养基为基础，加入吲哚丁酸和苯基噻二唑基脲，其中吲哚丁酸的加入量为O. lmg/L、苯基噻二唑基脲的加入量为O. 015mg/L ；
I.5壮苗
将丛生芽切下，栽插到壮苗培养基上，栽插量每100毫升接I 3棵；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为27度，光强为4000勒克司；培养3周，丛生芽平均可生长2 3厘米，得到茶苗；所述壮苗培养基以MS培养基为基础，加入吲哚丁酸，吲哚丁酸的加入量为O. 3mg/L ；
I.6生根和移栽
选取苗高达5厘米以上的粗壮无根的茶苗，直接栽入生根土壤中，培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为25度，光强为3000 6000勒克司；移栽初期，每日三次进行叶面喷水；培养8周，存活率为41. 64%，所有存活的茶苗均生根，所述生根土壤配方为丹麦品氏托普泥炭土 蛭石按质量比I :1均匀混合。本发明方法的有益技术效果体现在以下方面
1.本发明建立了一种胚性愈伤组织诱导一胚性愈伤组织增殖一不定芽诱导一不定芽增殖一体外生根的茶树组培再生体系。该再生体系不仅具有愈伤组织诱导率高、增殖方式简单、遗传稳定特点，而且愈伤组织由于酚类物质含量较低，可以成为遗传转化的对象。因此本技术为茶树遗传转化体系的建立奠定了坚实的实验基础；
2.具有两步增殖阶段，即愈伤组织增殖和不定芽增殖。愈伤组织增殖方式，具有增殖方式简单、遗传稳定的特点，实验发现在继代4年后，细胞的活力和分化能力没有明显变化。
图I为普通B5培养基诱导的茶愈伤组织。图2为普通B5培养基黑暗中培养的茶愈伤组织。图3为芽诱导培养基光照下培养的茶愈伤组织。图4为芽诱导培养基诱导出的茶苗。图5为芽增殖培养基诱导的重生芽。图6为壮苗培养基上茶芽伸长。图7为移栽9周后的茶苗。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步地说明。实施例I :
主要设备超净工作台；恒温光照培养箱；高温高压灭菌锅；PH计 试剂与材料
1.外植体材料普通茶树的种子
2.主要试剂
(1)75%乙醇，市场上购买的医用型75%酒精，主要用于外植体的消毒；
(2)1%氯化汞(HgCl2)，称取I克氯化汞溶于I升水中,用于外植体消毒；
(3)植物激素类市场上购买的二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、吲哚丁酸(IBA)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、6-糠氨基嘌呤(KT)、苯基噻二唑基脲(TDZ)；
(4 )蛭石和丹麦品氏托普泥炭土来自市场购买。一种茶树组培再生体系建立的具体操作步骤如下
I.I愈伤组织的诱导
采摘9月下旬生理成熟的茶籽作为茶树再生体系的原材料，即外植体；取茶籽5 10颗，将绿色的外壳剥去，用浓度75%的乙醇浸泡30秒，用无菌水洗3 4次；再用浓度O. 1%的升汞溶液浸泡10分钟，用无菌水洗3 4次；在超净条件下剥去种皮，选取完整的、带有胚的剥去种皮的茶树籽接种于普通B5培养基上，接种量为每40毫升接3 4颗；培养2周，有茶树愈伤组织长出，见图I ;上述普通B5培养基中激素用量为二氯苯氧基乙酸2. 5mg/L、6-糠氨基嘌呤O. 5mg/L，其他元素用量为B5培养基公知的浓度。I. 2愈伤组织的继代和增殖
将茶树愈伤组织切下，并切成直径6 10毫米愈伤组织块，培养于普通B5培养基上，接种量每40毫升接5 10块；培养条件为黑暗、温度为25 28度；每21天更换一次新鲜的普通B5培养基；培养3周，得到鲜重可以增殖为原来的2倍左右的增殖愈伤组织，见图
2;在此条件下，该愈伤组织可以稳定继代4年。I. 3不定芽的诱导
将增殖愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上，接种量每40毫升接直径6 10毫米大小的愈伤组织5 10块；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为25 28度，光强为3000 6000勒克司；每4周更换一次不定芽诱导培养基；培养到第3周，有部分愈伤组织转绿，见图3 ;培养到第4周，不定芽的诱导率为15. 71%，见图4，培养到2个月，诱导率上升为24. 29%，培养到4个月，诱导率高达65. 71% ;上述不定芽诱导培养基中激素用量为吲哚丁酸O. lmg/L,6-苄基腺嘌呤2. 5mg/L，其他元素用量为MS培养基公知的浓度。I. 4不定芽的增殖
将新诱导出的不定芽切下，栽插到不定芽增殖培养基上，栽插量每100毫升接I 3棵；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为27度，光强为4000勒克司；培养3周，大量的丛生芽长出，见图5 ;在此条件下，可以不断增殖不定芽；上述不定芽增殖培养基中激素用量为吲哚丁酸O. lmg/L、苯基噻二唑基脲O. 015mg/L，其他元素用量为MS培养基公知的浓度。
I. 5 壮苗
将丛生芽切下，栽插到壮苗培养基上，栽插量每100毫升接I 3棵；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为27度，光强为4000勒克司；培养3周，丛生芽平均可生长2 3厘米，得到茶苗，见图6 ;上述壮苗培养基中激素用量为吲哚丁酸O. 3mg/L，其他元素用量为MS培养基公知的浓度。I. 6生根和移栽
选取苗高达5厘米以上的粗壮无根的茶苗，直接栽入生根土壤中，培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为25度，光强为3000 6000勒克司；移栽初期，每日三次进行叶面喷水；培养8周，存活率为41. 64%，所有存活的茶苗均生根，见图7。上述生根土壤配方为丹麦品氏托普泥炭土 蛭石按质量I :1均匀混合。
参考文献
[1]肖哲丽，柳金凤.植物组织培养的研究进展及新技术应用[J].宁夏农林科技· 2011，(01). 13-15
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权利要求
1.一种茶树组培再生体系建立的方法，其特征在于包括以下操作步骤 I.I愈伤组织的诱导 采摘9月下旬生理成熟的茶籽作为茶树再生体系的原材料，即外植体；取茶籽5 10颗，将绿色的外壳剥去，用浓度75%的乙醇浸泡30秒，用无菌水洗3 4次；再用浓度O. 1%的升汞溶液浸泡10分钟，用无菌水洗3 4次；在超净条件下剥去种皮，选取完整的、带有胚的剥去种皮的茶树籽接种于普通B5培养基上，接种量为每40毫升接3 4颗；培养2周，有茶树愈伤组织长出；所述普通B5培养基中加入了二氯苯氧基乙酸和6-糠氨基嘌呤，其中二氯苯氧基乙酸的加入量为2. 5mg/L，6-糠氨基嘌呤的加入量为O. 5mg/L ； I.2愈伤组织的继代和增殖 将茶树愈伤组织切下，并切成直径6 10毫米愈伤组织块，培养于普通B5培养基上，接种量每40毫升接5 10块；培养条件为黑暗、温度为25 28度；每21天更换一次新鲜的普通B5培养基；培养3周，得到鲜重可以增殖为原来的I. 8 2. 2倍的增殖愈伤组织；在此条件下，该愈伤组织可以稳定继代4年； I.3不定芽的诱导， 将增殖愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上，接种量每40毫升接直径6 10毫米大小的愈伤组织5 10块；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为25 28度，光强为3000 6000勒克司；每4周更换一次不定芽诱导培养基；培养到第3周，有部分愈伤组织转绿；培养到第4周，不定芽的诱导率为15. 71%，培养到2个月，诱导率上升为24. 29%，培养到4个月，诱导率高达65. 71% ;所述不定芽诱导培养基以MS培养基为基础，力口入吲哚丁酸和6-苄基腺嘌呤，其中吲哚丁酸的加入量为O. lmg/L，6-苄基腺嘌呤的加入量为 2. 5mg/L ； I.4不定芽的增殖 将新诱导出的不定芽切下，栽插到不定芽增殖培养基上，栽插量每100毫升接I 3棵；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为27度，光强为4000勒克司；培养3周，大量的丛生芽长出；在此条件下，可以不断增殖不定芽；所述不定芽增殖培养基以MS培养基为基础，加入吲哚丁酸和苯基噻二唑基脲，其中吲哚丁酸的加入量为O. lmg/L、苯基噻二唑基脲的加入量为O. 015mg/L ； I.5壮苗 将丛生芽切下，栽插到壮苗培养基上，栽插量每100毫升接I 3棵；培养条件为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为27度，光强为4000勒克司；培养3周，丛生芽平均可生长2 3厘米，得到茶苗；所述壮苗培养基以MS培养基为基础，加入吲哚丁酸，吲哚丁酸的加入量为O. 3mg/L ； I.6生根和移栽 选取苗高达5厘米以上的粗壮无根的茶苗，直接栽入生根土壤中，培养条件 为12小时光照和12小时黑暗交替，温度为25度，光强为3000 6000勒克司；移栽初期，每日三次进行叶面喷水；培养8周，存活率为41. 64%，所有存活的茶苗均生根，所述生根土壤配方为丹麦品氏托普泥炭土 蛭石按质量比I :1均匀混合。
全文摘要
本发明涉及一种茶树组培再生体系建立的方法。具体操作步骤如下1.愈伤组织的诱导，2.愈伤组织的继代和增殖，3.不定芽的诱导，4.不定芽的增殖，5.壮苗，6生根和移栽。本发明具有两步增殖阶段，即愈伤组织增殖和不定芽增殖。愈伤组织增殖方式，具有增殖方式简单、遗传稳定的特点，实验发现在继代4年后，细胞的活力和分化能力没有明显变化；而且愈伤组织由于酚类物质含量较低，可以成为遗传转化的对象。因此本技术为茶树遗传转化体系的建立奠定了坚实的实验基础。
文档编号A01G31/00GK102726296SQ20121022794
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者刘亚军, 王婕, 贡年娣, 高丽萍 申请人:安徽农业大学