一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法
【专利摘要】本发明涉及一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，选用常规铁皮石斛组培过程中产生的特定原球茎，将其在无菌条件下转入含秋水仙素的培养基中进行四倍体诱变处理，然后转入原球茎诱导分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，并对纯合四倍体植株进行性状筛选，切取性状优良的四倍体植株的茎段转接入原球茎诱导培养基中，续代后将原球茎进行诱导分化出再生纯合四倍体无毒植株。本发明培育方法简便易行，不受季节气候影响，缩短了常规育种的时间，一次性即可获得数万株优质同源纯合四倍体石斛种苗，可大大提高铁皮石斛的产量和品质。
【专利说明】—种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种铁皮石斛新品种培育方法，尤其是一种大量繁育同源四倍体铁皮石斛的方法，属于生物技术育种领域。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是传统名贵珍稀中药材,具有益胃生津、滋阴清热、增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症等独特的功效。1000多年前的《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草之首”，其在民间也素有“救命仙草”之称，国际药用植物界将之誉为“药界大熊猫”。虽其功效独特但目前野生资源已濒临枯竭，加之人工种植投入高，且现有二倍体石斛种质难以保证、生长缓慢，成活率低下，造成人工种植铁皮石斛的产量低，品质参次不齐，农户种植积极性低下，国内市场供需矛盾日益突出，而现代多倍体育种技术为繁育出高产、抗逆性强，药用成份高的优质铁皮石斛提供了可能，通过多倍体育种技术可大大提升铁皮石斛的种植积极性，促进我国石斛产业的发展。
[0003]经对现有技术文献检索发现铁皮石斛四倍体研究鲜有报道，仅发现专利200710061225.8报道了铁皮石斛四倍体的培育方法，虽此法诱变率较高但存在一定的缺陷:a、以石斛种子为出发点，受季节气候影响有一定的局限性。b、育种周期长，从授粉、播种、诱变、种植、培育、育种到产业化应用需五年以上的时间。C、四倍体植株中嵌合四倍体的频率较高，种质难以保证d、一次仅可获得百株四倍体植株，仅适用于实验室研究阶段，难以满足实际产业化生产需求，需进一步改进。
【发明内容】
[0004]针对传统方法的不 足，本发明提供了一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，本方法简单有效易行，缩短了传统四倍体育种时间，大大提高传统四倍体育种的纯合性
和培育产量。
[0005]为实现以上目的，本发明提供了如下技术方案:一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于包括以下步骤:选用石斛组培续代1~4代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，用秋水仙素进行四倍体诱变，处理后转入原球茎分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，切取具有优良性状的纯合四倍体植株的茎段，转接入原球茎诱导培养基中，续代三次后将原球茎进行诱导分化出再生四倍体植株。
[0006]优选，所述的四倍体诱变处理为，在含0.0r0.06wt%秋水仙碱的1/3~1/2MS (MS基本培养基的中大量元素浓度减为1/3~1/2)液体培养基中诱变处理6(T72h，优选是含
0.05wt%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基。
[0007]优选，所述的原球茎分化培养基为:萘乙酸(NAA) 0.5^1.5mg/L+花宝I号
0.4~1.0g/L+蔗糖2-4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固体培养基。
[0008]作为改进，所述的切取具有优良性状的纯合四倍体植株茎段，其切方法为从相连的两个茎节节点处斜切茎段，将带有两个斜切口的茎段水平接种于原球茎诱导培养基，每个母瓶中接种一个茎段。
[0009]优选，所述的原球茎诱导培养基的组成为1/31/2MS+6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) 0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+ 活性炭 0.5~1.5g/L
[0010]与现有技术相比，本发明的优点在于:采用石斛组培过程中产生的原球茎为材料进行四倍体诱变，不受季节气候的影响，对根尖染色体镜检后用流式细胞仪筛选出纯合四倍体植株，将性状优良的四倍体植株的茎段转接愈伤组织诱导培养基中，经续代、分化一次性即可获得数万株优质纯合同源四倍体铁皮石斛种苗，本方法简单有效易行，缩短了传统四倍体育种时间，大大提高传统四倍体育种的纯合性,可以大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛，提高了铁皮石斛的品质和产量。 【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1是黄绿色原球茎照片；
[0012]图2是四倍体植株照片；
[0013]图3是二倍体2n=38染色体的照片；
[0014]图4是四倍体染色体2n=76的照片；
【具体实施方式】
[0015]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0016]一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，包括以下步骤:
[0017]I)选取原球茎:选取在石斛组培续代1~4代过程中产生的原球茎，要求选取黄绿色且没有原球茎尖分化的原球茎。
[0018]2)四倍体诱变处理:无菌条件下将选取的原球茎转入含有0.05%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基中进行诱变处理60~72h。
[0019]3)原球茎的分化诱导:将诱变处理过的原球茎用无菌水冲洗3飞次，转接于含ΝΑΑ0.5~L 5mg/L+花宝I号0.5~0.8g/L+蔗糖2~4wt%+香蕉10~15wt%的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500LUX，光照时间12h/d，温度23~27°C的条件下培养，中间续代一次，待植株长至3飞cm移栽进行正常管理栽培。
[0020]4)四倍体的鉴定与筛选:对再生植株进行编号标记后，对标记植株根尖的染色体进行镜检，染色体镜检结果为2n=76的植株是诱变成功的四倍体植株，进而用流式细胞仪从中筛选出纯合四倍体株系。
[0021]5)四倍体植株原球茎的诱导:在无菌条件下切取性状优良的纯合四倍体植株的茎段，切取茎段要求从相连的两个茎节节点处斜切茎段，将带有两个斜切口的茎段水平接种于原球茎诱导培养基中(1/3~1/2MS+6-BA0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.5mg/L+活性炭
0.5~1.5g/L。)，每个母瓶中接种一个茎段。
[0022]6)原球茎的分化诱导:诱导出的原球茎基于步骤3所述的分化培养基中进行诱导分化，半年后可一次性获得数万株优质四倍体铁皮石斛无毒种苗。
[0023]实施例:
[0024]选取选取在石斛组培续代第I代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，无菌条件下将选取的原球茎转入含有0.05%秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基中进行诱变处理60h。在超净工作台上将诱变处理过的原球茎用无菌水冲洗3次，转接于含NAA1.0mg/L+花宝I号0.6g/L+蔗糖3wt%+香蕉12wt%的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500Lux，光照时间12h/d，温度24±1°C的条件下培养，30d后续代一次，待植株长至3cm后炼苗7天，编号后移栽入种植基地进行正常管理栽培。
[0025]半年后选取长势好、茎粗大的植株的根尖进行镜检，染色体镜检结果为2n=76的植株是诱变成功的四倍体植株，用流式细胞仪从四倍体植株中筛选出纯合四倍体株系。
[0026]a、在无菌条件下切取编号为L-99的纯合四倍体植株的茎段(切取茎段时从相连的两个茎节节点处斜切，下同)，将切取的4段茎段接种于含6-BA0.2mg/L+NAA0.3mg/L+活性炭0.5g/L的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500Lux，光照时间12h/d，温度24± 1°C的条件下培养35d后诱导出原球茎，将原球茎续代2次后转入原球茎分化培养基，7个月后一次性获得2.8万株优质四倍体铁皮石斛无毒种苗。
[0027]b、在无菌条件下切取编号为L-121的纯合四倍体植株的茎段，将切取的5段茎段接种于含6-BA0.4mg/L+NAA0.4m g/L+活性炭1.0g/L的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500LUX，光照时间12h/d，温度25±1°C的条件下培养35d后诱导出原球茎，将原球茎续代3次后转入原球茎分化培养基，7个月后一次性获得9.5万株优质四倍体铁皮石斛无毒种苗。
[0028]C、在无菌条件下切取编号为L-326的纯合四倍体植株的茎段，将切取的5段茎段接种于含6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭1.5g/L的1/3~1/2MS固体培养基中，在光照强度1500LUX，光照时间12h/d，温度25±2°C的条件下培养30d后诱导出原球茎，将原球茎续代4次后转入分化培养基7个月后一次性获得30万株优质四倍体铁皮石斛无毒种苗。
[0029]花宝I号是美国花宝公司，作用是促进兰科植物生根壮苗，在市场可以购买获得，http://baike.baidu.com/view/1194364.htm。
【权利要求】
1.一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于包括以下步骤:选用石斛组培续代1~4代过程中产生的黄绿色且没有茎尖分化的原球茎，用秋水仙素进行四倍体诱变，处理后转入原球茎分化培养基中培养出再生植株，按常规方式进行栽培管理，对再生植株的根尖染色体进行检测，筛选出纯合四倍体植株，切取具有优良性状的纯合四倍体植株的茎段，转接入原球茎诱导培养基中，续代三次后将原球茎进行诱导分化出再生四倍体植株。
2.根据权利要求1所述的一种大量繁育同源四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于所述的四倍体诱变处理为，在含0.04、.06 (wt) %秋水仙碱的1/3~1/2MS液体培养基中诱变处理.60~72h。
3.根据权利要求1所述的一种大量繁育同源四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于所述的原球茎分化培养基为:NAA0.5^1.5mg/L+花宝I号0.5^0.8g/L+蔗糖2-4 (wt) %+香蕉.10~15(wt)%的1/3~1/2MS固体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于所述的切取具有优良性状的纯合四倍体植株茎段，其切方法为从相连的两个茎节节点处斜切茎段，将带有两个斜切口的茎段水平接种于原球茎诱导培养基，每个母瓶中接种一个茎段。
5.根据权利要求1所述的一种大量繁育同源纯合四倍体铁皮石斛的方法，其特征在于原球茎诱导培养基的组成为1/3~1/2MS+6-BA0.2~0.5mg/L+NAA0.3~0.6mg/L+活性炭.0.5~1.5g/L。
【文档编号】A01H4/00GK103535274SQ201210244240
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月13日 优先权日:2012年7月13日
【发明者】李振达, 何心展, 马春光, 付文飞 申请人:宁波洛祥药业有限公司